Bir lazer kaynaklı retina dejenerasyonu, Zebra balığı rejenerasyon modelini Müller Glia hücre aktivasyonu

Vizyon muhtemelen insanın en temel anlamda ve onun bozulma bir yüksek sosyo-ekonomik etkisi vardır. Sanayileşmiş dünyada retina dejeneratif hastalıkları görme kaybı ve körlük arasında¹yetişkin nüfusun çoğunluğu için hesap. Retinitis pigmentosa (RP) körlüğü yaklaşık 1.5 milyon kişi dünya çapında^2,3etkileyen 60 ve 20 yaşları arasındaki kişilerde en sık devralınan nedenidir. Kalıtsal retina bozuklukları dejenerasyonu retina pigment epiteli ve daha sonra gliosis tarafından takip ve iç nöronlar⁴remodeling ilerici kaybı photoreceptors (PRs) tarafından karakterize heterojen bir ailedir. Hastalığın seyrini genellikle çubuklar, loş ışık ve renk görme ve görme keskinliği⁵için gerekli olan, koniler akromatik vizyon için sorumlu olan ile başlayan iki PR hücre tipleri, artımlı kaybı açıklanabilir. RP neden için yeterli bir tek gen kusurdur. Defa 130'dan fazla 45'in üzerinde genlerdeki mutasyonlar hastalığı⁶ile ilişkili bulunmuştur. Bu değişen hastalığı fenotipleri yol açar ve gen tedavisi olmayan genelleştirilebilir bir neden ve böylece karmaşık bir tedavi yaklaşımı. Bu nedenle, hastalıklar kör olarak retina dejenerasyonlar tedavisinde yeni genel tedavi yaklaşımları geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır.

Retina dejenerasyonu kez PR kaybı içerir; Bu nedenle, PR hücre ölümü dejeneratif süreçleri retina⁷özelliğidir. Zaten PR hücre ölümü Müller glia hücre (MC)⁸harekete geçirmek ve nükleer silahların yayılmasına karşı uyarır gösterilmiştir. MCs, omurgalı retina büyük gliyal hücre tipinde bir kez kabul "yapıştırıcı" başka bir şey olmak arasında retina sinir hücreleri. Son yıllarda, birçok çalışma daha fazla sadece yapısal⁹çekmek gibi MCs hareket göstermiştir. Farklı fonksiyonları arasında MCs da neurogenesis içinde katılmak ve¹⁰onarmak. Nitekim, karşılık diffusible faktörler degenerating retina, MCs önemli ölçüde gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) ifade artırın. Bu nedenle, retina hasarı ve dejenerasyon¹¹ikincil bir tepki olarak MC harekete geçirmek için bir işaret olarak GFAP'nin etiketleme kullanılabilir.

Son zamanlarda, Zebra balığı (Danio rerio) retinal dejenerasyon ikna etmek için bir lazer kullanarak odak yaralanma bir roman uyarlaması geliştirdik. Odak yaralanma hücre yaralı siteye geçiş ve retina rejenerasyon¹²sırasında gerçekleşen olayların hassas zamanlama gibi bazı biyolojik süreçlerin eğitimi için avantajlıdır. Ayrıca, Zebra balığı onun görsel sistem ve bu diğer omurgalıların arasındaki benzerlikleri nedeniyle görsel araştırma önemli hale gelmiştir. İnsan ve teleost retinae brüt morfolojik ve histolojik özellikleri bazı farklılıklar görüntüler. Buna göre insan ve Zebra balığı retinae retina projeksiyon nöronlar, ganglion hücrelerinin en içteki içinde ikamet ederken nerede ışık algılama photoreceptors en dış katmanı işgal aynı katmanlı model düzenlenen aynı büyük hücre sınıfları içerir nöronal katmanı, lens proksimal. Retina interneurons, amacrine, bipolar ve yatay hücreler, photoreceptor ve ganglion hücre katmanları¹³arasında yerelleştirilmesine. Ayrıca, Zebra balığı retina koni egemen olduğu ve bu nedenle daha, örneğin, çalışılmış kemirgen retina insan retina için yakın olduğunu. Büyüleyici bir fark teleost ve memeliler arasında balık retina ve retina yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra hasar kalıcı neurogenesis vardır. Zebra balığı, MCs dedifferentiate ve rejenerasyon yaralı retina^14,15dakika sonra arabuluculuk. Tavuk, MCs aynı zamanda hücre döngüsü yeniden girmek için ve dedifferentiate için bazı kapasitesine sahiptir. Retina yaralanma yetişkin balık MCs Dede ve kök hücre belirli özellikleri kabul, hasarlı retina dokusu ile göç ve yeni nöronlar¹⁶üretmek. Gen ifadesi memeli MCs profil oluşturma retina ataları beklenmeyen benzerlikler ortaya ve MCs içsel Nörojenik potansiyelini tavuk, kemirgen ve insan bile retina için kanıt¹⁷büyüyor. Yine de, neden kuşlar ve memeliler rejeneratif yanıtta düşük güçlü yanıt olarak balık ile karşılaştırıldığında henüz anlaşılamamıştır. Bu nedenle, Zebra balığı endojen tamir mekanizmaları anlama stratejileri uyarıcı retina rejenerasyon memeliler ve insanlar için önerebilir miyim? MCs retina dejenerasyonu olan hastaların tedavisi için endojen onarım mekanizması bir tedavi aracı olarak istihdam bizim toplum için olağanüstü bir etkisi olurdu.

Burada, biz göze ait araştırma dejenerasyon/rejenerasyon modelinde istihdam için gerekli adımları sağlar. Biz ilk neurosensory retina görüntüleme yaralanma site ve son olarak görüntülenmesi bitişik MCs katılımı gelişen olayların ardından üzerinde odak hasar inducing üzerinde duruldu. Genel iletişim kuralı gerçekleştirmek nispeten kolay ve çok çeşitli retina daha sonra değerlendirmek için olanaklar açar.

tüm deneylerin hayvanlar kullanım Ophthalmic ve vizyon araştırma vizyon ve Oftalmoloji (ARVO) Araştırmaları Derneği için beyannameyi yapıştırılır ve hükümet yetkilileri ilgili düzenlemelerin saygı.

1. hayvanlar

1. TgBAC korumak (gfap:gfap-GFP) Zebra balığı 167 (AB) zorlanma yaşları 6-9 ay içinde su sıcaklığını 26.5 ° C ile standart koşullar altında ve 14/10 h açık/koyu döngüsü ¹⁸ arasında.
2. Hayvan bakımı yönergeleri hayvan deneyleri için ilgili kurumların hükümet yetkilileri tarafından onaylandıktan sonra izleyin.

2. Tersine çevrilebilir sistemik anestezi

1. hazırla tricaine tozu 97,9 ml su tankı ve Tris 1 m 2.1 mL 400 mg eriterek tarafından etil 3-aminobenzoate methanesulfonate tuz (tricaine) stok çözüm tamponlu tuz (TBS). PH 7,0 1 M Tris (pH 9) ve mağaza içinde bir ay karanlık ilâ 4 ° C'de uyum.
   Not: Tricaine gibi doğal yaşam koşulları hayvanın suda hazırlanmalı, tercihen orijinal tank su kullanılmalıdır.
2. Tank su içinde hisse senedi çözüm 1:25 sulandırmak ve hemen kullanın.
3. 10 cm Petri kabına kadar hareketsiz hale ve dış uyaranlara karşı (yaklaşık 2-5 dk, ağırlık ve yaş bağlı olarak) yanıt vermeyen 50 mL anestezi çözeltisi içeren Zebra balığı yerleştirin.
4. Transfer her balık el ile lazer tedavisi ( şekil 1A) için bir özel silikon pim tutucu.
   DİKKAT! Balık tank için 10 dakikaya kadar sadece dışında imzalat kalabilir.
5. Anestezi tedavi ve/veya görüntüleme sonra tersine çevirmek için Zebra balığı su tankı içeren kapsayıcısına getirin.
6. Kurtarma desteklemek için bir akışı taze tank su üzerinde solungaçları Zebra balığı suyun içinde ileri geri hareket ettirerek oluşturun.

3. Lazer odak yaralanma Retina üzerinde

Not: A 532 nm diode lazer Zebra balığı retina üzerinde odak hafif hasar oluşturmak için kullanılır. Lazer deneysel up yetişkin Zebra balığı tekrarlanabilir bir odak retina yaralanma kurulması sağlar.

1. Lazer çıkış gücü kadar ayarla: 70 mW; hava çapı: 50 µm; darbe süresi: 100 Bayan
   dikkat! Uygun kişisel koruma ve bölgesinin kalbinde etiketleme lazer ışık kullanımı gerektirir.
2. 1-2 damla % 2 hydroxypropylmethylcellulose topikal tedavi öncesi gözünde uygulayabilir ve lazer hedefleyen ışın retina üzerinde odaklanmaya 2.0 mm fundus lazer lens kullanabilirsiniz.
   DİKKAT! hydroxypropylmethylcellulose damla viskoz ve solungaçları üzerinde giderse nefes sorunlara neden olabilir.
3. Yer dört lazer noktalar görme sinirine soldaki çevresinde göz ve doğru tedavi edilmezse göz iç kontrol kullanın.

4. Vivo Retina morfolojisi Imaging

1. gün 0, Zebra balığı retina doğrudan lazer indüksiyon sonra anesteziden canlandırıcı olmadan görselleştirmek. Tüm diğer zaman puan, istihdam genel anestezi (Bölüm 2 bkz: geri dönüşümlü sistemik anestezi). Özel yapım silikon pim tutucu ( şekil 1 B, B.1) üzerinde immobilize Zebra balığı yerleştirin.
En iyi görüntü elde etmek
2. kesmek Zebra balığı göz sığdırmak için piyasada bulunan hidrojel Kontakt lens (Ø 5.2 mm, r = 2.70 mm, Merkezi kalınlık = 0.4 mm =) aracılığıyla bir delik yumruk. Objektif içbükey yüzeyi methylcellulose ile doldurmak ve kornea yerleştirin.
3. 78 D temassız slit lamba camı OCT sistemiyle teçhiz.
4. Kızılötesi (IR) görüntünün IR içinde odak + OCT modu (fundus göz görselleştirmek ve IR almak şekil 2A) resimleri tıklayarak " edinme " düğmesini ( şekil 2B yerelleştirmek için) Lazer sistemiyle retina lekeler ' s yazılım.
5. Visualize IR + OCT retina katmanlarda üç boyutlu bir bölümünü modu ve tıklatarak resimleri almak " edinme " düğmesini ( şekil 2B). Dış nükleer tabaka (yalnız) yaralanma şiddeti gözlemlemek (bkz. Bölüm 3: lazer odak yaralanma retina üzerinde) bu görüntüler.
6. Tedavi ve/veya görüntüleme tank su içeren bir kap içinde Zebra balığı yerleştirdikten sonra anestezi tersine çevirmek için.
7. Kurtarma desteklemek için bir akışı taze tank su üzerinde solungaçları Zebra balığı suyun içinde ileri geri hareket ettirerek oluşturun.
8. Retina morfolojisi benzer vivo içinde görüntüleme gerçekleştirmek 1 gün, 3, 7, 14 ve hafta 6.

5. Hematoksilen & Eozin (H & E) Staining

1. batma içine soğuk (4 ° C) tarafından Zebra balığı ötenazi anestezi çözüm için en az 10 dk ve anlatabilirsin buzda gözleri hemen tarafından anlamına gelir küçük eğri forseps.
2. Fosfat tamponlu tuz (PBS) 20 h için 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde (PFA) bütün gözünde düzeltin ve sonra kademeli alkol serisi örneklerinde kurutmak (Ksilen %100 5 min iki kez için etanol %100 5 min iki kez için etanol %96 3 dk iki kez ve etanol %70 3 mi n bir kez).
   DİKKAT! İngiltere'de yılın gözler, burun ve üst solunum yolu izlemek için rahatsız edici olabilir. İngiltere'de yılın olduğu bilinen bir insan kanserojen ve şüpheli bir üreme tehlike.
3. Parafin içinde örnekleri katıştır, optik sinir başı düzeyde 5 µm bölümleri kesilmiş ve cam slaytlarda mount.
4. % 0.1 asit Hematoksilen çözüm 5 min için deparaffinized bölümlerle leke ve hidroklorik asit karışımı slaytları daldırma sonra iki kez distile su içindeki slaytları daldırma (250 mL HCl % 25 2 mL distile su) ve amonyak (2 mL % 25 amonyak 250 ml karışımı distile su). Musluk suyu en az 10 dakika süreyle tarafından boyama Hematoksilen gelişimi sonra Eozin G sulu çözüm %0,5 3 dk bölümlerle leke
5. Akrilik Reçine montaj orta susuz slaytları mount ve slaytları ışık mikroskobu altında dikkat.

6. İmmünhistokimya MC harekete geçirmek için

1. antijen alma arabelleği (Tris-EDTA + %0,05 non-iyonik deterjan, pH 9.0) için uygun bir vapur veya bir mikrodalga fırında 10-15 dk 3 dk deparaffinized bölümlerde ısı ve yıkama üç kez TBS ile 5 için Min her.
2. Bir silikon bölümlerle kalem ve 100 µL eklemek daire, oda sıcaklığında 1 h. için çözüm (TBS + %10 keçi normal serum + %1 sığır serum albümin, pH 7,6) engelleme
3. Leke anti-gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) tavşan poliklonal antikor ve anti-glutamin sentetaz (GS) fare Monoklonal antikor, 1: 200 seyreltme (örnek başına 40 µL) her ikisi de. Slayt 4 ° C'de oksijen odasında gecede kuluçkaya. Üç kez TBS + % 0.1 ile yıkama ara 20 5 min için.
4. Bitiş görselleştirme ile uygun ikincil antikorlar. Bu iletişim kuralı bir keçi Anti-tavşan IgG H kullanılan & GFAP'nin ve bir keçi Anti-fare IgG H L yeşil ikincil antikor & L parlak kırmızı GS, 1 h için oda sıcaklığında 1:500 seyreltme her ikisi için
5. Slaytlar ile montaj orta DAPI içeren dağ ve floresan mikroskop altında slaytlar gözlemlemek.

Gerçek zamanlı OCT: MCs rol retina tamir amacıyla, biz iyi arasındadır bölgenin Zebra balığı retina hasar inducing bir lazer yaralanma modeli kullanılır. Hasar sitenin içinde vivo OCT yaralanma (şekil 3) takip 60 dakika içinde ilk kez (0 gün) aracılığıyla görüntüsü. Balık gözü optik için telafi etmek için özel yapım bir kontakt lens kornea üzerinde yerleştirildi. Hemen sonra lazer tedavisi, diffüz bir yansıtıcı hiper sinyal dış retina (oklar) Lokalize. Retina Pigmentli epitel (RPE) dış Pleksiform tabaka (OPL) için genişletilmiş. Benzer bir sinyal de 1 gün algılanabilir. 3 gün sonra bu yaygın sinyal daha düzenli ve yoğun oldu. Sürekli dış nükleer tabaka (yalnız) photoreceptor katmanın uzanan görülmüş. İlk hafta (7 gün), ortalama lezyon boyutu önemli bir azalma olduğunu ve sadece küçük bir yansıtıcı hiper sinyal algılandı. En son zaman noktası (hafta 6) soruşturma kadar 14 günden başlayarak, lazer noktalar artık IR ve OCT Albümdeki görünür edildi.

Histolojik değerlendirme retina dejenerasyonu/rejenerasyon: ölçüde ve Kinetik retina dejenerasyonu/rejenerasyon, H araştırmak için & E boyama sonra hasar indüksiyon (gün 0, 1, 3, 7, 14 farklı zaman noktalarda istihdam yapıldı. ve hafta 6) (şekil 4). Üç balık üç gözlü üzerinde deneyler yapıldı. Ancak, bu yazının amacı yöntem göstermektir hiçbir istatistiksel analiz gerçekleştirildi. İç nükleer tabaka (INL) ince değişiklikleri ve dit lazer tedavi aşağıdaki 60 dakika içinde görülen hemen sonrası lazer (Örneğin, hafif ödemi dit) ve hücreler arası uzayda azaltılmış: INL olabilir. Dejenerasyon lazer yaralanma indüksiyon sonra 6 hafta boyunca izledi. Morfolojik değişiklikler sürekli PRs dağınıklığı ve yalnız ve subretinal uzay boşluğuna oluşumu ile 1 gün sonra gözlendi. Gerçekten, çekirdek içinde 1-7 gün arasında hasar alanında dit kaybı oldu. Maksimum PR kaybı 3 günde bulundu. 14 gün sonra 6 haftalık başlayarak, dış retina yeniden normal morfolojisi kurmuştu.

Gliyal katılımı sırasında retina dejenerasyonu/rejenerasyon: MC aktivasyon (günü 0, 3, 14) farklı zaman noktalarda değerlendirmek için retina dejenerasyonu indüksiyon, gliyal hücreye veri işaretleyicilerini GS için immunohistokimyasal analizleri gerçekleştirilen ve GFAP'nin (şekil 5). Deneyler tekrar üç gözlü kantitatif analiz olmadan üç balık üzerinde yapıldı. GS ekstraselüler Glutamat düzeyini kontrol önemli bir rol oynar ve sadece MC soma ve onun işlemler19,20ifade edilebilir kabul edilir. GFAP'nin upregulated yaşlanma ve retina hasar veya vurguladı sırasında var. MC son ayaklarda yerelleştirilmiştir ve21işler. Zayıf GFAP'nin ifade de etiketleme diğer gliyal hücre tipleri, Örneğin, astrocytes yaralanmamış kumandalı retina iç kısmında bulundu. PR dış segmentleri autofluorescence da dit sinyal sağlanan ama bu açıkça ayırt edici olabilir. 3. gün sonrası yaralanma upregulated GFAP'nin sinyaldi. Böylece, yalnızca içinde retina dit yaralanma sitedeki GFAP'nin pozitif MCs gösterdi gün 3 lazer tedavisinden sonra analizleri gerçekleştirilen. 14 günden rejenerasyon büyük ölçüde tamamlandı ve GFAP'nin sinyal downregulated temel düzeye hasar alan oldu. GFAP'nin farklı olarak GS ifade düzeyini önemli bir değişiklik vardı. Ancak, GS yaralanma yerinde yerelleştirilmiş bir downregülasyon olabilirdi.

Şekil 1: Kurulum için lazer yaralanma Zebra balığı retina ve OCT analiz takip indüksiyon. (A) lazer sistemi tedavi öncesi tanzimi. (A.1) Zebra balığı silikon pim tutucu fundus Kontakt lens yerde hemen önce uygulanması lazer ışını ile yerleştirilir. (B) görüntüleme önce OCT sistemin düzenlenmesi. (B.1) Zebra balığı yer 78D slit lamba camı hasar sitelerinin algılanmasını önce önce Ekim yoluyla Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: Kurulum IR ve OCT görüntüleri elde etme için. (A) görüntüleme sırasında yazılım penceresinin ekran görüntüsü. IR ve OCT modları tasvir edilmektedir. (B) görüntüleri elde etmek için kullanılan panel genel bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: IR (solda) ve OCT (sağda) görüntüleri aynı retinada yaralı ve yaralı sitelerin farklı zamanda göz puan (gün 0, 1, 3, 7, 14 ve hafta 6) lazer kaynaklı retina dejenerasyonu sonra. IR görüntülerde vardır retina bölümü analiz yeşil bir kutu gösterir ve yeşil hat OCT görüntülerin retina üzerinde gösterir. Okları gösterir siteler Ekim ölçek çubuğu yansıtıcı hiper sinyalleri olarak belirlenen lazer noktalar 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: H & E yaralı ve kontralateral yaralanmamış boyama Zebra balığı göz farklı zamanda puan (gün 0, 1, 3, 7, 14 ve hafta 6) lazer kaynaklı retina dejenerasyonu sonra. GC, ganglion hücre katmanı; INL, iç nükleer tabaka; DİT, dış nükleer tabaka. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: MC harekete geçirmek tespiti immunohistokimyasal. GFAP'nin (yeşil) ve GS (kırmızı) lazer kaynaklı retina dejenerasyonu sonra puan (gün 0, 3, 14) yaralı ve yaralı Zebra balığı retinada farklı zamanda boyama. PR o autofluorescence nedeniyle dit içinde yeşil sinyalidiruter kesimi. Hücre çekirdeği ile DAPI (mavi) lekeli. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.