Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Son birkaç on yıl içinde Zebra balığı (Danio rerio) gelişim biyolojisi çalışmak için ana model organizma ortaya çıkmıştır. Embriyoların anne dışında geliştirmek ve optik saydamdır. Ayrıca, göz, böbrek ve ön gibi hayati organların oluşumunu hızla, sadece 24 saat sonrası döllenme tarafından (hpf) oluşan yapılar ile oluşur. Önemlisi, Zebra balığı genom son derece memeliler^1,2,3ile korunmuş. Ayrıca, Zebra balığı ve memeli organları benzer anatomisi ve fizyolojisi olması. Zebra balığı embriyonik böbrek veya pronephros, erken nephrogenesis ve korunmuş epitel hücre popülasyonlarının omurgalı nefron^4, kader tayini sırasında gen fonksiyon incelenmesi için modeli sistem değerini gösterir ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. benzer şekilde, Zebra balığı embriyo MCCs^{11,12,13,14,15,} ontogeny incelerken giderek daha önemli hale gelmiştir ^{16 , 17}.

Onların adından da anlaşılacağı gibi MCCs epitel hücrelerinin apikal yüzey¹⁷tarihinde yer alan hareketli kirpikler bir bohça ile karakterize vardır. Zebra balığı, MCCs sıvı akışı çalışması ve 24 hpf^11,12,13,14tarafından^, pronephros her nefron yarısı boyunca moda gibi bir "salt-and-pepper" içinde dağınık ^{15 , 16 , 17}. her ne kadar onlar sadece bir avuç dikkat edilmiştir insan böbrek hastalığı^18,19,20,21durumlarda, MCCs yaygın beyin gibi memeli diğer dokularda ve deneysel tasarım zorluklar bir dizi pozlar Trakea^22,23,24. Zarif Zebra balığı da dahil olmak üzere çeşitli omurgalı modelleri çalışmalarda mm kaderin korunmuş bir patika yol mm geliştirme^{12,17,25 bir inhibitörü olarak sinyal çentik ile göstermiştir ,26,27}. Bu nedenle, Zebra balığı pronephros mm geliştirme vivo içinde^11,12,13,14, genetik mekanizmaları incelemek için kolayca erişilebilir modeli sağlar ^{15 , 16 , 17}.

Şeffaflık ve genetik manipülasyon kolay: Zebra balığı embriyoların hücre kaderi, doku büyüme ve gelişme erken embriyo^{1,2 düzenleyen genetik ve moleküler yolları okurken çok değerli özellikleri olduğu kanıtlanmıştır ,3}. Situ hibridizasyon ve bütün Dağı Eğer gibi protein ve gen transkript görselleştirmek, edilmiş uygulanan ve Zebra balığı^16,28,29için^{en iyi duruma getirilmiş için böyle, geleneksel teknikleri, 30,31,32,33,34,35,36,37,38}. Balık ve eğer için popüler iletişim kuralları birleştirerek, etiket ve MM'ler vivo^16,28,37,38analiz etmek mümkündür.

Aşağıdaki iletişim kuralı muhafaza ve Merkezi tarafından Zebra balığı araştırma Üniversitesi Notre Dame, bakım Zebra balığı yetişkin kullanır. Zebra balığı yetişkin ve embriyo ile çalışmak için tüm yöntemleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. embriyo fiksasyon

1. Önceden açıklanan yöntemleri^39,40kullanarak Zebra balığı embriyo toplamak. 24 hpf, non-spesifik proteaz karışım çözüm (50 mg/mL) bir embriyo E3 500 µL bulaşık Incubate oda sıcaklığında (RT) ekleyin.
2. Embriyo koryon patlak başladığınızda, tüm sıvı embriyo çanak kaldırın.
3. Embriyo 2 - 3 kez ile taze E3 E3 yaklaşık 20 mL ekleyerek, yavaşça dönen E3 tabakta ve akışkan bir sıvı atık kabın decanting yıkayın.
4. Embriyo düzeltmeden önce ötenazi için E3% 0,2 tricaine 2 mL ekleyin.
5. Embriyo bir plastik Pasteur pipet kullanarak 5 mL cam şişe aktarın. Embriyo şişeyi altına yerleşmiş sonra pipet kullanarak tricaine/E3 çözüm çoğunu kaldırın.
6. 24 hpf embriyo ajitasyon olmadan RT, 2-4 h %4 paraformaldehyde (PFA) ile 5 mL fix.
   Dikkat: PFA toksik ve araştırmacı göz koruması, eldiven ve önlük giyiyor iken İngiltere'de yılın çözümleri kimyasal bir başlık altında ele alınmalıdır. Olarak toz PFA statik yük dağıtmak eğilimi PFA sabitleştirici toz PFA toz üzerinden hazırlanması olağanüstü dikkatle yapılmalıdır.
   Not: PFA gecede 4 ° C'de % 4 embriyo düzeltebilirsiniz %4 hazırlamak toz PFA tamamen erimesi için çözüm sürekli karıştırarak 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) kaynatın x Isıtma tarafından İngiltere'de yılın. Çözüm geri RT, 4 İngiltere'de yılın 0,45 µm tek kullanımlık sistem vakum filtrasyonu için buradan geçen sterilize filtre % aşağı soğuduktan sonra sonra ve 15 mL veya 50 mL bölümleri için depolama-20 ° C'de içine bölünmemeli
7. 4 kaldırmak % PFA ve yıkama embriyo ile iki kez 1 X fosfat tamponlu ara-20 (PBST), dik yıkama embriyo 5 mL % 100 metanol (MeOH) de hemen ile RT. eklemek 5 mL taze % 100 % 0,1 ile serum fizyolojik MeOH embriyo için ve en az 20 dakika-20 ° C'de kuluçkaya.
   Not: Embriyo % 100 saklanabilir-20 ° c kadar embriyo hazırlık için hazır MeOH.

2. embriyo hazırlık ve hibridizasyon

1. Embriyo 5 mL % 50 de içinde bir kez yıkama tarafından suyla temasa MeOH 1 x PBST embriyo 5 mL % 30 yıkama tarafından RT. devam rehidratasyon, 5 min için MeOH 1 x PBST dik, 5 min için yıkama embriyo 5 mL 1 x PBST 5 dk her için iki kez RT.
2. Embriyo 5 mL lik 1:1,000 İndinavir K (pK) (10 mg/mL) kuluçka tarafından 1'permeabilize x PBST 2 dk RT. az için
   Not: Yukarıda 5 mg/mL ve kuluçka konsantrasyon zaman ancak az 2 dk pK konsantrasyon 2 dk embriyo 24 genç için önerilen daha uzun büyük embriyo inkübe hpf.
3. PK çözüm ve yıkama hemen içinde 5 mL 1 x PBST dik, iki kez 5 mL % 4 embriyo düzeltmek de kaldırmak PFA RT için en az 20 dk at.
   Not: PFA gecede 4 ° C'de % 4 embriyo düzeltebilirsiniz
4. İngiltere'de yılın ve yıkama iki kez içinde 5 mL 1 de kaldırmak x PBST, RT.
5. 5 mL 1 de embriyo transferi x PBST düz dipli microcentrifuge tüpler içine yerleştirilen dik RT her embriyo ve sonraki hibridizasyon çözüm arasındaki etkileşimler kolaylaştırmak için bir microcentrifuge raf içine.
6. İki kez 1.5 mL hibridizasyon çözeltisi (Hyb +) embriyo RT. eklemek 1.5 mL taze Hyb + yıkama ve embriyo 70 ° c 4-6 h hibridizasyon fırında kuluçkaya.
7. Hyb + 1,5 mL sonda çözüm hacmi ile değiştirin (10 µL RNA sonda/500 µL Hyb +) embriyo tam olarak karşılamak yeterli.
   Not: Antisens RNA sonda kullanarak önceden açıklanan yöntemleri³⁹sentez.
8. 70 ° C'de hibridizasyon fırında gecede sonda ile konumlandırılmış bireysel tüpler dik microcentrifuge rafa sallayarak olmadan melezlemek.

3. sıcak yıkama ve engelleme

Not: Uygun bir çözüm üzerinde embriyo koyarak ve 70 ° C'de hibridizasyon fırında kuluçka sıcak yıkama yapılmaktadır 70 ° C'de yıkama çözümler tutmak için hibridizasyon fırında 50 mL tüpler her çözümün koyun zaman sonda / Hyb + karışımı eklenir.

1. Sonda kaldırın. İki kez 70 ° C'de % 50 formamide/2 20-30 dk için serum sodyum sitrat (SSC) arabellek x 1,5 ml embriyo yıkayın.
   Not: Sonda Hyb +-20 ° C'de depolanan ve daha sonraki bir tarihte yeniden kullanılır.
2. Embriyo bir kez 70 ° C 2 1.5 ml yıkayın. x SSC 15 dakika süreyle iki kez 70 ° C'de 0.2 X SSC için 20-30 dk her 1,5 ml embriyo yıkayın. Değiştir 0,2 x SSC ile 1,5 mL engelleme reaktif ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya
   Not: RT, engelleme reaktif bir gecede yerine 4 h için kuluçkaya mümkündür.

4. antikor kuluçka ve Maleik asit arabellek yıkar

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

1. Anti-DIG-HAZNESİNDEKİ engelleme reaktif 1:1,000 oranında, 0.2 mL engelleme reaktif yerine ve folyo veya başka bir ışık engelleme kapak RT. adlı altında 3 h için kuluçkaya
   Not: Alternatif olarak, antikor gecede 4 ° C'de kuluçkaya
2. 3 saat sonra embriyo Maleik asit tampon 2 - 4 kez için 10-15 dk her RT. 1,5 ml taze Maleik asit arabellek 4 ° C'de embriyo gecede Incubate az 1,5 mL yıkayın.
   Not: Bu gecede Maleik asit arabellekte kuluçkaya gerekli değildir, ancak yapıyor çok soruşturma arka plan azaltır.

5. sonda algılama ve kaldırma-in peroksidaz

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

1. Maleik asit arabellek kaldırın ve 1,5 mL 1 x PBS ile değiştirin. Embriyo iki kez 1.5 mL 1 x PBS 5 min için her dik Incubate embriyo 0.2 ml, Cy3, Floresan, RT. 60 dk için çözüm boyama yıkayın
   Not: Farklı probları için kuluçka süresi değişebilir.
2. Embriyo bir kez ile aşağıdaki yüzde MeOH 1,5 mL 1 X PBS RT, 10 min için yıkayın: % 30 MeOH, %50 MeOH %75 MeOH ve % 100 MeOH.
3. Dik Yıkama 30 dk için % 1 H₂O₂ MeOH 1,5 mL ile embriyo embriyo 1,5 mL 1 x PBS RT, 10 min için aşağıdaki MeOH çözümleri ile bir kez kuluçkaya: %75 MeOH, %50 MeOH ve % 30 MeOH. İki kez 5 min için embriyo RT 1,5 mL 1 x PBS yıkayın.
   Not: Embriyo PBS içinde gecede 4 ° C'de saklanabilir

6. ayirt

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

1. RT. yıkamada embriyo 1.5'bir kez embriyoların bir kez GKD₂O 5 min için 1,5 mL 7 dk RT. az yıkamak için embriyo GKD₂O 5 min için 1,5 ml önceden soğutulmuş aseton (-20 ° C'de muhafaza) 1,5 ml embriyo RT. yıkamada yıkama 1 mL x PBST RT, 5 min için % 1 DMSO (PBDT) ile
2. Embriyo PBDT + % 10 fetal sığır serum (FBS) 1,5 ml 2 h için RT, bir rocker üzerinde kuluçkaya.
3. Kaldır PBDT + FBS ve birincil antikorlar, anti acetylated tübülin (fare üretilen) ve anti-γ-(tavşan üretilen), birlikte 1: 400 PBDT + % 1, seyreltilmiş tübülin 1,5 mL yerine FBS. Gecede 4 ° C'de embriyo kuluçkaya
   Not: Kuluçka kez birincil antikor bağlı olarak değişebilir. Farklı zaman aralıkları ile test etiketleme en iyi duruma getirmek için gerekli olabilir.

7. ikincil antikor

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

1. PBDT + %1 1,5 mL fazla ilişkisiz antikor embriyo kaldırmak için FBS + 0.1 M NaCl bir rocker üzerinde RT, 1 dk. için yıkayın.
2. Embriyo yıkama PBDT + %1 1,5 mL 5 kere FBS + 0.1 M NaCl RT. adlı bir rocker üzerinde her 30 dk için embriyo 1.5 mL PBDT + %1 yıkama FBS RT, bir rock'çı üzerinde 30 dk için.
3. Gecede 4 ° C'de ikincil antikorların 200 µL içinde embriyo kuluçkaya birlikte 1:500 PBDT içinde seyreltilmiş Alexa 488 keçi Anti-fare IgG ve Alexa 647 keçi Anti-tavşan IgG,.

8. DAPI boyama

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

1. Embriyo hızlı bir şekilde iki kez 1.5 mL PBDT RT yıkayın. PBDT DAPI 1,5 mL ile değiştirin, seyreltilmiş 1 X PBST 1:15000 ve RT, 15 dk bir rocker üzerinde kuluçkaya.
2. Embriyo 1.5 mL PDBT + %1 yıkama FBS + 0,1 M NaCl üç kez RT 15-20 dk her. Mount ve görüntü için hazır kadar embriyo PBDT 1,5 mL 4 ° C'de depolayın.

9. montaj ve Zebra balığı Pronephros için görüntüleme

1. Küçük hacimli, PBDT, yaklaşık 10 µL cam slayt üzerinde yatıyordu embriyo lateral.
2. Embriyo gözlerinin arkasında iyi forseps baş kaldırmak için bir çift ve bazı sarısı topu ile sıkmak.
3. İyi forseps yavaşça uzakta kalan sarısı topu embriyo vücuttan kazımak için kullanın. Disosiye sarısı ve sıvı ilave ince bir doku ile slayt kaldırın.
4. Embriyo kalan kuyruğunun medyaya montaj bir damla ekleyin ve kuyruk yanal koydu şekilde yerleştirin. Bir coverslip kuyruk örnek Düzleştir'i, sonra kapalı slayt kutusunda yer için üstüne yerleştirin.
5. Görüntü aşağıdaki kanallar kullanarak confocal mikroskop üzerinde 60 X büyütme, böbrek kirpikler: DAPI mavi (lazer 408.0 set nm), yeşil FITC (lazer 488.0 set nm), Cy3 boya kırmızı etiketli (lazer 561.0 set nm) ve Alexa 680 beyaz (lazer 637.0 set nm).

Vahşi-türü Zebra balığı embriyo 24, sabit hpf ve hemen yukarıda açıklandığı gibi hazır. Şekil 1 seçili resimli aşamaları birlikte deneysel bir iş akışı gösterilmektedir. 1-8 adımda belirtilen iş akışı örnek ihale, fiksasyon ve antianlamlı riboprobes ayirt tarafından takip için etiket protein(s) ilgi ile endojen transkript etiketlemek için sabit doku manipülasyonu süreçleri kapsar. Adım 9 iş akışında montaj ve görselleştirme Zebra balığı embriyonik gövde en iyi duruma getirmek için özel olarak tasarlanmış teknikleri görüntüleme anlamına gelir. Adım 9 eşlik çizimlerde doku bir cam slayt üzerinde konumlandırma için düzenleme yöntemi göstermektedir. Bu adımda, embriyo baş ve sarısı top kaldırıldı, yanal bir cam slayt ve coverslip arasında konumlandırılmış olması için kuyruk bırakarak. Sarısı topu otomatik fluoresces ve montaj işlemi engelleyen kaldırma sarısı topu ve kafa pronephros ikamet mm nüfusun en iyi görüntüleme için önerilmektedir.

Confocal mikroskop kullanılarak elde temsili resimleri 60 X büyütme, aynı vahşi tipi embriyo ve dijital zoom aynı büyütmede gösteren Şekil 2, sağlanır. Alt iki panel kompozit kaplama bu görüntüleme veri iken üst paneller, tek tek her kanal görüntüleri sağlar. Beyaz kutu (sol sütun görüntüde) dijital zoom (sağ sütun görüntü) odak alan özetliyor. Dijital zoom final Masası'nda vurgulanan, çekirdeği içinde DAPI etiketli ve MM'ler burada γ-tübülin antikorlar Bazal organları göstermek ve α-tübülin kirpikler gösterir odf3b, tanımak için tasarlanmış bir antianlamlı riboprobe üzerinde dayalı tespit edildi. Kompozit kaplama dijital yakınlaştırma sarı çizgili daire odf3b Tutanaklar, birden fazla Bazal organları ve kirpikler sahibi nedeniyle tespit edildi bir mm tarafını gösterir. Sarı noktalı daireyle etiketli bitişik mono siliyer hücreyi tek bir Bazal vücut ve tek bir cilium sahip fenotip üzerinde dayalı tespit edilmiştir.

Şekil 1: deneysel akış çizelgesinin şematik. Bu deneysel bir iş akışı akış gösterir eşlik tarafından kritik etap kar tanesi soğuk kuluçka gösterir çizimler, üç eğik çizgiler ısı temsil ve uzun bir kuluçka kez saat temsil eder. Bazı adımlar iletişim kuralında belirtildiği gibi daha uzun süreler içinde gerçekleştirilebilir olsa iş akışını en az (sağ üst köşesinde gün sayısını işleminin her aşamasında görmek) 6 gün içinde gerçekleştirilebilir. Montaj işlemi ayrıntılı bir tasviri, cam slayt ve coverslip arasındaki son takılı embriyo kuyruk gösteren çizilir. Siyah bir Kesikli kutu 60 X büyütme oranında görüntüsü alan özetliyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: temsilcisi sonuçları Zebra balığı pronephros MCCs görüntülenmesi için. Maksimum görüntü projeksiyonları 24 hpf vahşi tipi Zebra balığı embriyo 60 X büyütme yanı sıra confocal, 60 X büyütme aynı embriyo üzerinde dijital zoom. Beyaz kutuları için yakınlaştırma odaklı alanını gösterir. Bireysel lekeleri DAPI (çekirdek), odf3b (MCCs), γ-tübülin (Bazal organları) ve α-tübülin (kirpikler) etiketli ve alttaki iki panellerinde birlikte birleştirilmiş. Dijital zoom, biz aşağıdaki gibi yaklaşımları, hücre konumları sağlar: bir mm Kesikli sarı daire tarafından özetlenen ve noktalı sarı daire mono siliyer bir hücre özetler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.