Method Article

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

DOI:

10.3791/56261

⸱

November 18th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, Zebra balığı embriyo rahim embriyo gelişimi ve optik şeffaflık gibi özellikleri nedeniyle gelişim biyolojisi eğitim için popüler bir model olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, Zebra balığı embriyo omurgalı böbrek organogenesis yanı sıra multiciliated hücre (mm) gelişimini incelemek için önemli bir organizma haline gelmiştir. Embriyonik Zebra balığı böbrek MCCs görselleştirmek için bütün Dağı Floresan situ hibridizasyon (balık) kombine bir protokol geliştirdik ve tüm yüksek kararlılık düşsel sağlayan ayirt (Eğer) mount. Bu el yazması RNA transkript ve protein birlikte gelişim programları aracılığıyla çeşitli soy faktörleri ifade Yönetmeliği daha iyi anlamak için bir araç olarak yerelleştirme için bizim teknik anlatılmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son birkaç on yıl içinde Zebra balığı (Danio rerio) gelişim biyolojisi çalışmak için ana model organizma ortaya çıkmıştır. Embriyoların anne dışında geliştirmek ve optik saydamdır. Ayrıca, göz, böbrek ve ön gibi hayati organların oluşumunu hızla, sadece 24 saat sonrası döllenme tarafından (hpf) oluşan yapılar ile oluşur. Önemlisi, Zebra balığı genom son derece memeliler1,2,3ile korunmuş. Ayrıca, Zebra balığı ve memeli organları benzer anatomisi ve fizyolojisi olması. Zebra balığı embriyonik böbrek veya pronephros, erken nephrogenesis ve korunmuş epitel hücre popülasyonlarının omurgalı nefron4, kader tayini sırasında gen fonksiyon incelenmesi için modeli sistem değerini gösterir 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. benzer şekilde, Zebra balığı embriyo MCCs11,12,13,14,15, ontogeny incelerken giderek daha önemli hale gelmiştir 16 , 17.

Onların adından da anlaşılacağı gibi MCCs epitel hücrelerinin apikal yüzey17tarihinde yer alan hareketli kirpikler bir bohça ile karakterize vardır. Zebra balığı, MCCs sıvı akışı çalışması ve 24 hpf11,12,13,14tarafından, pronephros her nefron yarısı boyunca moda gibi bir "salt-and-pepper" içinde dağınık 15 , 16 , 17. her ne kadar onlar sadece bir avuç dikkat edilmiştir insan böbrek hastalığı18,19,20,21durumlarda, MCCs yaygın beyin gibi memeli diğer dokularda ve deneysel tasarım zorluklar bir dizi pozlar Trakea22,23,24. Zarif Zebra balığı da dahil olmak üzere çeşitli omurgalı modelleri çalışmalarda mm kaderin korunmuş bir patika yol mm geliştirme12,17,25 bir inhibitörü olarak sinyal çentik ile göstermiştir ,26,27. Bu nedenle, Zebra balığı pronephros mm geliştirme vivo içinde11,12,13,14, genetik mekanizmaları incelemek için kolayca erişilebilir modeli sağlar 15 , 16 , 17.

Şeffaflık ve genetik manipülasyon kolay: Zebra balığı embriyoların hücre kaderi, doku büyüme ve gelişme erken embriyo1,2 düzenleyen genetik ve moleküler yolları okurken çok değerli özellikleri olduğu kanıtlanmıştır ,3. Situ hibridizasyon ve bütün Dağı Eğer gibi protein ve gen transkript görselleştirmek, edilmiş uygulanan ve Zebra balığı16,28,29içinen iyi duruma getirilmiş için böyle, geleneksel teknikleri, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Balık ve eğer için popüler iletişim kuralları birleştirerek, etiket ve MM'ler vivo16,28,37,38analiz etmek mümkündür.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki iletişim kuralı muhafaza ve Merkezi tarafından Zebra balığı araştırma Üniversitesi Notre Dame, bakım Zebra balığı yetişkin kullanır. Zebra balığı yetişkin ve embriyo ile çalışmak için tüm yöntemleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. embriyo fiksasyon

  1. Önceden açıklanan yöntemleri39,40kullanarak Zebra balığı embriyo toplamak. 24 hpf, non-spesifik proteaz karışım çözüm (50 mg/mL) bir embriyo E3 500 µL bulaşık Incubate oda sıcaklığında (RT) ekleyin.
  2. Embriyo koryon patlak başladığınızda, tüm sıvı embriyo çanak kaldırın.
  3. Embriyo 2 - 3 kez ile taze E3 E3 yaklaşık 20 mL ekleyerek, yavaşça dönen E3 tabakta ve akışkan bir sıvı atık kabın decanting yıkayın.
  4. Embriyo düzeltmeden önce ötenazi için E3% 0,2 tricaine 2 mL ekleyin.
  5. Embriyo bir plastik Pasteur pipet kullanarak 5 mL cam şişe aktarın. Embriyo şişeyi altına yerleşmiş sonra pipet kullanarak tricaine/E3 çözüm çoğunu kaldırın.
  6. 24 hpf embriyo ajitasyon olmadan RT, 2-4 h %4 paraformaldehyde (PFA) ile 5 mL fix.
    Dikkat: PFA toksik ve araştırmacı göz koruması, eldiven ve önlük giyiyor iken İngiltere'de yılın çözümleri kimyasal bir başlık altında ele alınmalıdır. Olarak toz PFA statik yük dağıtmak eğilimi PFA sabitleştirici toz PFA toz üzerinden hazırlanması olağanüstü dikkatle yapılmalıdır.
    Not: PFA gecede 4 ° C'de % 4 embriyo düzeltebilirsiniz %4 hazırlamak toz PFA tamamen erimesi için çözüm sürekli karıştırarak 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) kaynatın x Isıtma tarafından İngiltere'de yılın. Çözüm geri RT, 4 İngiltere'de yılın 0,45 µm tek kullanımlık sistem vakum filtrasyonu için buradan geçen sterilize filtre % aşağı soğuduktan sonra sonra ve 15 mL veya 50 mL bölümleri için depolama-20 ° C'de içine bölünmemeli
  7. 4 kaldırmak % PFA ve yıkama embriyo ile iki kez 1 X fosfat tamponlu ara-20 (PBST), dik yıkama embriyo 5 mL % 100 metanol (MeOH) de hemen ile RT. eklemek 5 mL taze % 100 % 0,1 ile serum fizyolojik MeOH embriyo için ve en az 20 dakika-20 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Embriyo % 100 saklanabilir-20 ° c kadar embriyo hazırlık için hazır MeOH.

2. embriyo hazırlık ve hibridizasyon

  1. Embriyo 5 mL % 50 de içinde bir kez yıkama tarafından suyla temasa MeOH 1 x PBST embriyo 5 mL % 30 yıkama tarafından RT. devam rehidratasyon, 5 min için MeOH 1 x PBST dik, 5 min için yıkama embriyo 5 mL 1 x PBST 5 dk her için iki kez RT.
  2. Embriyo 5 mL lik 1:1,000 İndinavir K (pK) (10 mg/mL) kuluçka tarafından 1'permeabilize x PBST 2 dk RT. az için
    Not: Yukarıda 5 mg/mL ve kuluçka konsantrasyon zaman ancak az 2 dk pK konsantrasyon 2 dk embriyo 24 genç için önerilen daha uzun büyük embriyo inkübe hpf.
  3. PK çözüm ve yıkama hemen içinde 5 mL 1 x PBST dik, iki kez 5 mL % 4 embriyo düzeltmek de kaldırmak PFA RT için en az 20 dk at.
    Not: PFA gecede 4 ° C'de % 4 embriyo düzeltebilirsiniz
  4. İngiltere'de yılın ve yıkama iki kez içinde 5 mL 1 de kaldırmak x PBST, RT.
  5. 5 mL 1 de embriyo transferi x PBST düz dipli microcentrifuge tüpler içine yerleştirilen dik RT her embriyo ve sonraki hibridizasyon çözüm arasındaki etkileşimler kolaylaştırmak için bir microcentrifuge raf içine.
  6. İki kez 1.5 mL hibridizasyon çözeltisi (Hyb +) embriyo RT. eklemek 1.5 mL taze Hyb + yıkama ve embriyo 70 ° c 4-6 h hibridizasyon fırında kuluçkaya.
  7. Hyb + 1,5 mL sonda çözüm hacmi ile değiştirin (10 µL RNA sonda/500 µL Hyb +) embriyo tam olarak karşılamak yeterli.
    Not: Antisens RNA sonda kullanarak önceden açıklanan yöntemleri39sentez.
  8. 70 ° C'de hibridizasyon fırında gecede sonda ile konumlandırılmış bireysel tüpler dik microcentrifuge rafa sallayarak olmadan melezlemek.

3. sıcak yıkama ve engelleme

Not: Uygun bir çözüm üzerinde embriyo koyarak ve 70 ° C'de hibridizasyon fırında kuluçka sıcak yıkama yapılmaktadır 70 ° C'de yıkama çözümler tutmak için hibridizasyon fırında 50 mL tüpler her çözümün koyun zaman sonda / Hyb + karışımı eklenir.

  1. Sonda kaldırın. İki kez 70 ° C'de % 50 formamide/2 20-30 dk için serum sodyum sitrat (SSC) arabellek x 1,5 ml embriyo yıkayın.
    Not: Sonda Hyb +-20 ° C'de depolanan ve daha sonraki bir tarihte yeniden kullanılır.
  2. Embriyo bir kez 70 ° C 2 1.5 ml yıkayın. x SSC 15 dakika süreyle iki kez 70 ° C'de 0.2 X SSC için 20-30 dk her 1,5 ml embriyo yıkayın. Değiştir 0,2 x SSC ile 1,5 mL engelleme reaktif ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya
    Not: RT, engelleme reaktif bir gecede yerine 4 h için kuluçkaya mümkündür.

4. antikor kuluçka ve Maleik asit arabellek yıkar

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

  1. Anti-DIG-HAZNESİNDEKİ engelleme reaktif 1:1,000 oranında, 0.2 mL engelleme reaktif yerine ve folyo veya başka bir ışık engelleme kapak RT. adlı altında 3 h için kuluçkaya
    Not: Alternatif olarak, antikor gecede 4 ° C'de kuluçkaya
  2. 3 saat sonra embriyo Maleik asit tampon 2 - 4 kez için 10-15 dk her RT. 1,5 ml taze Maleik asit arabellek 4 ° C'de embriyo gecede Incubate az 1,5 mL yıkayın.
    Not: Bu gecede Maleik asit arabellekte kuluçkaya gerekli değildir, ancak yapıyor çok soruşturma arka plan azaltır.

5. sonda algılama ve kaldırma-in peroksidaz

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

  1. Maleik asit arabellek kaldırın ve 1,5 mL 1 x PBS ile değiştirin. Embriyo iki kez 1.5 mL 1 x PBS 5 min için her dik Incubate embriyo 0.2 ml, Cy3, Floresan, RT. 60 dk için çözüm boyama yıkayın
    Not: Farklı probları için kuluçka süresi değişebilir.
  2. Embriyo bir kez ile aşağıdaki yüzde MeOH 1,5 mL 1 X PBS RT, 10 min için yıkayın: % 30 MeOH, %50 MeOH %75 MeOH ve % 100 MeOH.
  3. Dik Yıkama 30 dk için % 1 H2O2 MeOH 1,5 mL ile embriyo embriyo 1,5 mL 1 x PBS RT, 10 min için aşağıdaki MeOH çözümleri ile bir kez kuluçkaya: %75 MeOH, %50 MeOH ve % 30 MeOH. İki kez 5 min için embriyo RT 1,5 mL 1 x PBS yıkayın.
    Not: Embriyo PBS içinde gecede 4 ° C'de saklanabilir

6. ayirt

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

  1. RT. yıkamada embriyo 1.5'bir kez embriyoların bir kez GKD2O 5 min için 1,5 mL 7 dk RT. az yıkamak için embriyo GKD2O 5 min için 1,5 ml önceden soğutulmuş aseton (-20 ° C'de muhafaza) 1,5 ml embriyo RT. yıkamada yıkama 1 mL x PBST RT, 5 min için % 1 DMSO (PBDT) ile
  2. Embriyo PBDT + % 10 fetal sığır serum (FBS) 1,5 ml 2 h için RT, bir rocker üzerinde kuluçkaya.
  3. Kaldır PBDT + FBS ve birincil antikorlar, anti acetylated tübülin (fare üretilen) ve anti-γ-(tavşan üretilen), birlikte 1: 400 PBDT + % 1, seyreltilmiş tübülin 1,5 mL yerine FBS. Gecede 4 ° C'de embriyo kuluçkaya
    Not: Kuluçka kez birincil antikor bağlı olarak değişebilir. Farklı zaman aralıkları ile test etiketleme en iyi duruma getirmek için gerekli olabilir.

7. ikincil antikor

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

  1. PBDT + %1 1,5 mL fazla ilişkisiz antikor embriyo kaldırmak için FBS + 0.1 M NaCl bir rocker üzerinde RT, 1 dk. için yıkayın.
  2. Embriyo yıkama PBDT + %1 1,5 mL 5 kere FBS + 0.1 M NaCl RT. adlı bir rocker üzerinde her 30 dk için embriyo 1.5 mL PBDT + %1 yıkama FBS RT, bir rock'çı üzerinde 30 dk için.
  3. Gecede 4 ° C'de ikincil antikorların 200 µL içinde embriyo kuluçkaya birlikte 1:500 PBDT içinde seyreltilmiş Alexa 488 keçi Anti-fare IgG ve Alexa 647 keçi Anti-tavşan IgG,.

8. DAPI boyama

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

  1. Embriyo hızlı bir şekilde iki kez 1.5 mL PBDT RT yıkayın. PBDT DAPI 1,5 mL ile değiştirin, seyreltilmiş 1 X PBST 1:15000 ve RT, 15 dk bir rocker üzerinde kuluçkaya.
  2. Embriyo 1.5 mL PDBT + %1 yıkama FBS + 0,1 M NaCl üç kez RT 15-20 dk her. Mount ve görüntü için hazır kadar embriyo PBDT 1,5 mL 4 ° C'de depolayın.

9. montaj ve Zebra balığı Pronephros için görüntüleme

  1. Küçük hacimli, PBDT, yaklaşık 10 µL cam slayt üzerinde yatıyordu embriyo lateral.
  2. Embriyo gözlerinin arkasında iyi forseps baş kaldırmak için bir çift ve bazı sarısı topu ile sıkmak.
  3. İyi forseps yavaşça uzakta kalan sarısı topu embriyo vücuttan kazımak için kullanın. Disosiye sarısı ve sıvı ilave ince bir doku ile slayt kaldırın.
  4. Embriyo kalan kuyruğunun medyaya montaj bir damla ekleyin ve kuyruk yanal koydu şekilde yerleştirin. Bir coverslip kuyruk örnek Düzleştir'i, sonra kapalı slayt kutusunda yer için üstüne yerleştirin.
  5. Görüntü aşağıdaki kanallar kullanarak confocal mikroskop üzerinde 60 X büyütme, böbrek kirpikler: DAPI mavi (lazer 408.0 set nm), yeşil FITC (lazer 488.0 set nm), Cy3 boya kırmızı etiketli (lazer 561.0 set nm) ve Alexa 680 beyaz (lazer 637.0 set nm).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vahşi-türü Zebra balığı embriyo 24, sabit hpf ve hemen yukarıda açıklandığı gibi hazır. Şekil 1 seçili resimli aşamaları birlikte deneysel bir iş akışı gösterilmektedir. 1-8 adımda belirtilen iş akışı örnek ihale, fiksasyon ve antianlamlı riboprobes ayirt tarafından takip için etiket protein(s) ilgi ile endojen transkript etiketlemek için sabit doku manipülasyonu süreçleri kapsar. Adım 9 iş akışında montaj ve görselleştirme Zebra balığı embriyonik gövde en iyi duruma getirmek için özel olarak tasarlanmış teknikleri görüntüleme anlamına gelir. Adım 9 eşlik çizimlerde doku bir cam slayt üzerinde konumlandırma için düzenleme yöntemi göstermektedir. Bu adımda, embriyo baş ve sarısı top kaldırıldı, yanal bir cam slayt ve coverslip arasında konumlandırılmış olması için kuyruk bırakarak. Sarısı topu otomatik fluoresces ve montaj işlemi engelleyen kaldırma sarısı topu ve kafa pronephros ikamet mm nüfusun en iyi görüntüleme için önerilmektedir.

Confocal mikroskop kullanılarak elde temsili resimleri 60 X büyütme, aynı vahşi tipi embriyo ve dijital zoom aynı büyütmede gösteren Şekil 2, sağlanır. Alt iki panel kompozit kaplama bu görüntüleme veri iken üst paneller, tek tek her kanal görüntüleri sağlar. Beyaz kutu (sol sütun görüntüde) dijital zoom (sağ sütun görüntü) odak alan özetliyor. Dijital zoom final Masası'nda vurgulanan, çekirdeği içinde DAPI etiketli ve MM'ler burada γ-tübülin antikorlar Bazal organları göstermek ve α-tübülin kirpikler gösterir odf3b, tanımak için tasarlanmış bir antianlamlı riboprobe üzerinde dayalı tespit edildi. Kompozit kaplama dijital yakınlaştırma sarı çizgili daire odf3b Tutanaklar, birden fazla Bazal organları ve kirpikler sahibi nedeniyle tespit edildi bir mm tarafını gösterir. Sarı noktalı daireyle etiketli bitişik mono siliyer hücreyi tek bir Bazal vücut ve tek bir cilium sahip fenotip üzerinde dayalı tespit edilmiştir.

figure-results-1
Şekil 1: deneysel akış çizelgesinin şematik. Bu deneysel bir iş akışı akış gösterir eşlik tarafından kritik etap kar tanesi soğuk kuluçka gösterir çizimler, üç eğik çizgiler ısı temsil ve uzun bir kuluçka kez saat temsil eder. Bazı adımlar iletişim kuralında belirtildiği gibi daha uzun süreler içinde gerçekleştirilebilir olsa iş akışını en az (sağ üst köşesinde gün sayısını işleminin her aşamasında görmek) 6 gün içinde gerçekleştirilebilir. Montaj işlemi ayrıntılı bir tasviri, cam slayt ve coverslip arasındaki son takılı embriyo kuyruk gösteren çizilir. Siyah bir Kesikli kutu 60 X büyütme oranında görüntüsü alan özetliyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: temsilcisi sonuçları Zebra balığı pronephros MCCs görüntülenmesi için. Maksimum görüntü projeksiyonları 24 hpf vahşi tipi Zebra balığı embriyo 60 X büyütme yanı sıra confocal, 60 X büyütme aynı embriyo üzerinde dijital zoom. Beyaz kutuları için yakınlaştırma odaklı alanını gösterir. Bireysel lekeleri DAPI (çekirdek), odf3b (MCCs), γ-tübülin (Bazal organları) ve α-tübülin (kirpikler) etiketli ve alttaki iki panellerinde birlikte birleştirilmiş. Dijital zoom, biz aşağıdaki gibi yaklaşımları, hücre konumları sağlar: bir mm Kesikli sarı daire tarafından özetlenen ve noktalı sarı daire mono siliyer bir hücre özetler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda ayrıntılı iletişim kuralı pronephros odf3b transkriptler ve α-tübülin içinde 24 hpf Zebra balığı embriyo ile MCCs etiketleme için optimize edilmiştir. En iyi sonuçlar için bu taze sabit ve hazırlanmış embriyo kullanmak için tavsiye edilir. Ama istenmeyen arka plan boyama ile embriyo depolama biriminde tutulur zaman artar olasılığı sabit ve ya MeOH veya Hyb + bir haftadan uzun-20 ° C'de saklanan embriyolar kullanılabilir.

Değişiklikler ve bu tekniğin sorun giderme bu yöntem diğer suites özel işaretleri, örneğin diğer antianlamlı riboprobes ve diğer antikorları için terzi gereklidir. Bütün Dağı in situ hibridizasyon sürecinde adımları parametrelerini ayarlamak için pek çok yöntem olmuştur daha önce31,34,36,38, bizim grup ve diğerleri tarafından belgelenen 39. Aynı şekilde, her protein antikoru bazı kere boyama açısından sorun giderme gerektirecektir ve dilutions ve kuluçka süreleri her birincil antikor için yaklaşık aralıkları en iyi belgelenmiş sonuçları28, değerlendirilmesi tarafından tahmin edilir 35. embriyo 24 genç için hpf, pK tedavi 2 dk kısa olmalıdır nerede embriyo 24 büyük hpf pK 2 dk daha uzun süre ile tedavi. Ayrıca, embriyo 24 büyük hpf pigment pK tedavi öncesi ağartılmış.

Floresan boyama çözüm ile boyama sonra kalan leke, antikor ve peroxidases metanol ve hidrojen peroksit yıkar dizi gerçekleştirerek kaldırmak için önemlidir. Hemen ardından PBS yıkar aşırı metanol embriyo kaldırmak için hayati önem taşımaktadır. Önemlisi, eğer antikorlar ile devam etmeden önce biz daha az bir başka ve/veya santrifüj tüpleri için uygun olasılığı embriyoların yapmak aseton ve deiyonize suyla yıkama bulduk. Bizim deneyim, antikorlar belirli transkripsiyon faktörleri ve diğer genler için onlar verimli çalışabilir olsa Western engelliyor, Zebra balığı Eğer için iyi çalışmıyor. Ancak, α-tübülin ve β-catenin, gibi son derece korunmuş ve bol protein de Zebra balığı Eğer16,37için çalışır.

Balık ile henüz belirli antikor içinde Zebra balığı var mı genler RNA Tutanaklar görselleştirmek mümkündür. Balık Eğer ile birleştirerek, bu iletişim kuralı tarafından gösterildiği gibi protein ve RNA transkript co yerelleştirme görülen vivo içinde (Şekil 2) olabilir. Esnek doğası çeşitli RNA transkriptler ve proteinler arasında çok sayıda doku ve zaman Puan görselleştirme için hızlı sorun giderme sağlar. Zebra balığı embriyo zaten saygın özellikleri ile birleştirildiğinde, bu iletişim kuralı balık + Eğer genler ve proteinler önemli ifade gelişimsel yolu düzenleme için keşfetmek için başka bir araç sağlar.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser kısmen R.A.W. ve Ulusal Bilim Vakfı yüksek lisans araştırma bursu No R01DK100237 grant tarafından desteklenmiştir DGE-1313583 A.N.M. için Ayrıca üniversite, bilim yaz lisans araştırma bursu programı M.U. destek için teşekkür ederiz Bizim Zebra balığı özel onların bakımı için University of Notre Dame, Zebra balığı Araştırma Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Biyolojik Bilimler Bölümü üyeleri laboratuarımızın tüm destek ve değerli bakış açısı için teşekkür etmek istiyoruz.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
spesifik olmayan proteaz karışım çözeltisiRoche11459643001, Streptomyces griseus'tan pronaz50mg / mL stok çözeltisi yapmak için E3 olmadan< / güçlü> metilen mavisi ile seyreltin; -20 ° C'de saklayın; C
E3 çözeltisi50X E3'ü (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, damıtılmış suda 16.5 mM MgSO4) damıtılmış suda seyreltin; kontaminasyonu önlemek için 1 x 10-5 M metilen mavisi (sigma M9140) ekleyin
tricaine (etil 3-aminobenzoat metansülfonat)FlukaA5040-250G% 0.2'lik bir stok çözeltisi yapmak için, 1 g trikin tozunu 10 mL Tris içinde çözün, pH 9.5 ve 500 mL'ye kadar damıtılmış su
embriyo tabaklarıVWR351029
5 mL cam şişelerWheaton225012
tek kullanımlık plastik Pasteur pippettesVWR414004-004
%4 paraformaldehit (PFA) çözeltisiElektron Mikroskobu Hizmetleri19210%4 PFA'yı 1X PBS'de çözün ve çeker ocak altında kaynatın. Soğutun ve alın, ardından -20 ° C'de saklayın. Kullanım için çözüldükten sonra tekrar dondurmayın.
10X PBSAmerikan BiyoanalitikAB110721X stok yapmak için damıtılmış suda seyreltin
Tween-20 stoğuAmerikan BiyoanalitikAB02038Damıtılmış suda seyrelterek %0,1 Tween-20 stoğu yapın.
% 0.1 Tween 20 (PBST)SigmaP9416içinde% 0.1 Tween-20 ile
Sigma34860-4L
proteinaz KRoche311587900110 mg / mL'lik bir stok yapmak için damıtılmış suda çözün; alikot ve -20&°C'de saklayın; C
düz tabanlı mikrosantrifüj tüpleriVWR87003-300; 87003-298
formamidAmerikan BiyoanalitikAB00600-20 ° C'de saklanır; C
hibridizasyon çözeltisi (HYB+)%50 formamid, 5X SSC, %0.1 Tween-20, 5 mg/mL maya torula RNA, 50 & mu; g/μ L heparin; -20&�C'de saklayın; C
hibridizasyon fırınıFisher Scientific13-247-10Q
20X tuzlu su-sodyum sitrat (SSC) tampon çözeltisiAmerikan BiyoanalitikAB131562X ve 0.2X stok bloke edici reaktif çözeltisi yapmak için damıtılmış suda seyreltin
Ro1109617600110'luk bir stok çözeltisi yapmak için maleik asit tamponunda seyreltin; 4 & deg'de saklayın; C
maleik asit tampon çözeltisiSigmaM0375 ve S7653150mM maleik asit, 100mM NaCl (pH 7.5)
anti-Digoksigenin-POD, Fab parçalarıRoche112077399104 ° C'de saklanır; C
Cy3 floresan boyama çözeltisiPerkinElmer, Inc.NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 sistemmağazası 4 & derece; C; kit tamponunda 1:50 seyreltme TSA reaktifi (60 uL DMSO içinde çözülmüş) yaparak boyama solüsyonunu taze hazırlayın
Hidrojen peroksit (H2O2)SigmaH1009-500mL4 ° C'de saklayın; C
moleküler dereceli damıtılmış su (ddH2O)Mediatech25-055-CM
asetonAmerikan BiyoanalitikAB00636-01000, -20 ° C'de bir alikot saklar; C
DMSOAmerikan BiyoanalitikAB00435-01000
fetal sığır serumu (FBS)Gibco10438-034alikot ve -20 ° C'de saklayın; C
monoklonal anti-asetillenmiş tübülin klonu 6-11B-1Sigma-AldrichT6793alikot ve -20&�C'de saklayın; Tavşan
Sigma-AldrichT5192alikotunda üretilen C anti-&gama;-tubulin anitbodyve -20&°C'de saklanır; C
odf3b cDNA klonu MGC:63985OpenBiosystemsIMAGE:6792478bakteri gliserol stoğunu -80 ° C'de depolar; C
NaCLAmerikan BiyoanalitikAB01915-05000
Alexa unu 647 keçi anti-tavşan IgGYaşam TeknolojileriA212454 & deg'de saklayın; C; ışıktan koruyun
Alexa fluor 488 keçi anti-fare IgGLife TechnologiesA110294 & deg'de saklayın; C; DAPI
Life TechnologiesD1306alikotunu ışıktan koruyun ve -20 ° C'de saklayın; C
cam kaydırakThermo-Fisher4445
cam lamelThermo-Fisher12-540A18 x 18 mm
ince forsepsRobozRS-1050Dumont Cımbız Desen #55
montaj ortamıPolysciences, Inc.18606, Aqua-Poly / Mountmağazası 4 derece; C
konfokal mikroskop ve ilgili yazılımile bir Nikon C2plus Konfokal Mikroskop kullanıyoruz
1X PBS metanol (MeOH) 1X fosfat tamponlu salin che% NIS elemanları AR yazılımı rocker Bio-Rad 1660710EDU

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).">Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341(2012).">Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341(2012).
  3. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).">Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  4. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).">Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
  5. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).">Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  6. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).">Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  7. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).">Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  8. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).">Chambers, B. E., Wingert, R. A. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).
  9. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).">Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
  10. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).">Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).
  11. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).">Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
  12. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).">Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).
  13. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18(2007).">Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18(2007).
  14. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).">Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
  15. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).">Wang, L., et al. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).
  16. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).">Marra, A. N., Wingert, R. A. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).
  17. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).">Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).
  18. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).">Duffy, J. L., Suzuki, Y. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).
  19. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).">Katz, S. M., Morgan, J. J. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).
  20. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).">Hassan, M. O., Subramanyan, S. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).
  21. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).">Ong, A. C., Wagner, B. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).
  22. Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).">Worthington, W. C., Cathcart, R. S. III Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).
  23. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).">Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).
  24. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).">Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).
  25. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).">Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).
  26. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).">Tan, F. E., et al. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).
  27. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).">Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).
  28. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).">Jowett, T. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).
  29. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).">Schulte-Merker, S. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).
  30. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).">Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).
  31. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).">Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).
  32. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).">Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).
  33. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).">Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).
  34. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).">Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).
  35. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060(2013).">Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060(2013).
  36. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).">Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).
  37. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).">Julich, D., et al. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
  38. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).">Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).
  39. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604(2014).">Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604(2014).
  40. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063(2014).">Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiciliated CellsZebrafish EmbryoWhole Mount FISHImmunofluorescence ProtocolRNA Protein Co localizationConfocal MicroscopyODF3BAcetylated Alpha TubulinGamete TubulinPronephros Imaging

Related Articles