Yöntem makalesi

İnşaat ve bir fare grefti Osteoliz modeli aseptik gevşeme içinde CoCrMo parçacıklar maruz tarafından değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/56276

⸱

17 Şubat 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması CoCrMo parçacıklar, aşınma partikülleri ve aseptik gevşeme çeşitli hücreler arasındaki etkileşimler değerlendirmek için ideal bir hayvan modeli oluşturan maruz bir fare grefti Osteoliz modeli açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşınma parçacık kaynaklı Osteoliz aseptik gevşeme artroplasti başarısızlık büyük bir nedeni ama altta yatan mekanizma belirsizdir. Algılama ve sporadik oluşumu için gerekli takibi nedeniyle uzun, Patogenez ofparticle kaynaklı Osteoliz klinik durumlarda değerlendirmek için davet ediyor. Bu nedenle, en iyi hayvan modelleri daha fazla çalışmalar için gereklidir. Grefti Osteoliz CoCrMo parçacıklar maruz tarafından kurulan fare modeli parçacıklar ve aseptik gevşeme çeşitli hücreler arasındaki etkileşimler değerlendirmek için etkili ve geçerli bir araçtır. Bu modelde, CoCrMo parçacıklar ilk yüksek vakum üç elektrot doğru akım tarafından elde ve fosfat tamponlu tuz konsantrasyonu 50 mg/mL, resuspended. Sonra sonra kafatası kapaklarini tarafından ayrılması keskin diseksiyon elde edilen süspansiyon 50 µL fare calvaria ortasına kadar uygulandı. İki hafta sonra fareler kurban edildi ve calvaria numuneler hasat edildi; nitel ve nicel Değerlendirmeler Hematoksilen ve Eozin boyama ve mikro bilgisayarlı tomografi tarafından yapıldı. Bu modelin güçlü yordamı basitlik, kemik kaybı kantitatif değerlendirilmesi, hız Osteoliz geliştirme, potansiyel kullanım transgenik veya nakavt modelleri ve nispeten düşük maliyetli içerir. Ancak, bu model mekanik kuvvet ve aseptik gevşeme içinde parçacıklar kronik etkilerini değerlendirmek için kullanılacak uygulanamıyor. CoCrMo parçacıklar maruz tarafından oluşturulan fare grefti Osteoliz modeli aşınma partikülleri ve çeşitli hücreler, örneğin, makrofajlar, fibroblastlar, dokusunu ve aseptik gevşeme içinde Osteoklastlar, arasındaki etkileşimler değerlendirmek için ideal bir araçtır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aseptik gevşeme en yaygın nedeni olan toplam kalça protezi (THA) ve total Diz protezi (TKA) hata, hangi düzeltme ameliyatı1gerektirir. Ancak, altta yatan mekanizma belirsiz2kalır. Uzun bir takip olan bir durum nadirdir, parçacık kaynaklı Osteoliz algılamak için gereklidir; Bu nedenle, klinik durumlarda onun patogenezinde keşfetmeye davet ediyor. Bu nedenle, daha fazla çalışmaları karmaşık cep ve doku mekanizmaları üzerinde odaklanarak hem in vivo deneyler parçacık kaynaklı Osteoliz modelleri ve vitro deneyleri homeostazı3kemik ile ilgili hücrelerde giymek gerektirir. Geçerli bir hayvan modeli daha da hücresel deneyleri için kanıt sağlayan kemik kaybı, aşınma partikülleri etkilerini ortaya önemlidir.

Bir fare grefti Osteoliz model CoCrMo parçacıklar maruz inşa parçacıklar ve aseptik gevşeme çeşitli hücreler arasındaki etkileşimler değerlendirmek için etkili ve geçerli bir yöntemdir. Bu modelde, CoCrMo parçacıklar grefti Osteoliz makrofajlar içinde inflamatuar sitokinlerin inducing, Osteoklastlar etkinleştirme, osteoblast yayılması inhibe ve osteoblast apoptosis teşvik neden.

Sadece bu modeli kurmak için iki hafta sürer. Osteoliz görüntülenir ve Hematoksilen Eozin (H & E) boyama ile sayısal ve mikro Bilgisayarlı Tomografi (mikro-CT)2. Buna ek olarak, bu modeli nispeten düşük maliyetli ve transgenik ve nakavt fare modelleri çeşitli dozlarda3bileşikler çok sayıda ekran için kullanılabilir vardır.

Kurmak ve bu model değerlendirmek için basit bir yöntemdir. İlk olarak, CoCrMo parçacıklar yüksek vakum üç elektrot doğru akım tarafından elde edilen ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 50 mg/mL bir konsantrasyon, resuspended. Sonra sonra kafatası kapaklarini tarafından ayrılması keskin diseksiyon elde edilen süspansiyon 50 µL fare calvaria ortasına kadar uygulandı. Fareler iki hafta sonra kurban edildi ve calvaria örnekleri hasat edildi; nitel ve nicel analizler H & E andmicro-CT boyama tarafından gerçekleştirilmiştir

Bir fare grefti Osteoliz model CoCrMo parçacıklar maruz inşa CoCrMo parçacıklar ve makrofajlar, fibroblastlar, dokusunu ve aseptik gevşeme içinde Osteoklastlar, gibi çeşitli hücreler arasındaki etkileşimler değerlendirmek için ideal bir araçtır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Nanjing Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. CoCrMo parçacık hazırlık

  1. CoCrMo parçacıklar bir fabrikasyon yüksek vakum üç elektrot doğru akım4kullanarak elde. 10-3 Pa vakum, 0,04 MPa argon ve hidrojen 3:2 (v/v) altında alet CoCrMo alaşım ve 650 A katot geçerli yerleştirin.
  2. CoCrMo parçacıklar çapı ölçmek.
    1. 1 mg CoCrMo parçacıkların susuz etanol 1,5 mL ekleyin.
    2. CoCrMo parçacıklar susuz etanol ultrasonik 28 kHz ve 5 min için 600 W sallayarak resuspend.
    3. Bir damla (yaklaşık 20 µL) elde edilen süspansiyon transmisyon elektron mikroskobu (TEM) objektif masaya uygulanır. 200 kV ivme gerilim ve 0,24 nm çözünürlük TEM fotoğraf serisi yakalamak.
    4. TEM Filmler ortalama çap ve parçacık boyutu dağıtım hesaplamak için sağlanan yazılımı kullanın.
  3. Endotoxins dezenfekte etmek
    1. Basınçlı kap 15dk 121 ° C ve 15 psi için parçacıkların 50 gr.
    2. Endotoxins bir nicel Limulus Amebocyte Lysate (LAL) tahlil tarafından tespit (< % 0.25 EU/mL endotoksin devamsızlık belirtmek için olarak kabul)5.
  4. Parçacıklar fosfat tamponlu tuz (PBS) 50 mg/mL konsantrasyonu hisse senedi çözüm6olarak, resuspend.

2. inşaat grefti Osteoliz modeli

  1. 6 haftalık C57BL/J6 fareler (grup başına altı fareler) withpentobarbital (50 mg/kg) anestezi. Çimdik testi anestezi düzeyini değerlendirmek için kullanın. Gözleri normal salin ile kurutma önlemek.
  2. Fareler yüzükoyun sígara yerleştirin. Kafatası üzerinde kürk bir tıraş makinesi ile kaldırın ve % 75 etanol içeren tıbbi pamuk topları kullanarak cilt dezenfekte.
  3. Noktası yerelleştirme için de dahil olmak üzere iki gözüm kulağım arasında orta sırasıyla iki nokta tanımlayın. Sonra iki puan yukarıda arasındaki çizgi belirlemek ve yukarıdaki hattı boyunca cilt (şekil 1A) makasla deşmek.
  4. Kafatası kapaklarini bir neşter (şekil 1B)6calvaria kaldırın.
  5. Her iki ucunda deri ile basit kesintiye uğramış Dikiş dikiş.
  6. Belgili tanımlık kesme ortasına dikiş hattından knotting olmadan olun. Dikiş hattı iki ucu tut.
  7. CoCrMo parçacık süspansiyon (50 mg/mL, PBS), 50 µL ortasında calvarias (şekil 1 c)2gömün.
  8. Basit kesintiye uğramış dikiş (şekil 1 d) içinde son dikiş düğüm.
  9. Fareler için başka bir 2 hafta korumak.

3. mikro-CT tarama grefti Osteoliz modeli değerlendirilmesi

  1. Karbon dioksit ile fareler kurban. Yatay düzlemde farelerde başını kesmek. Beyin dokusu içinde ve cilt kaldırın ve dışarı kürk. Calvarias daha fazla deneyler için hasat.
  2. Yavaşça yukarı calvaria üzerinde tüm yumuşak doku cımbız ile temizleyin. %4 paraformaldehyde temizlenen calvarias calvarias mikro-CT tarama önce PBS 24 h 24 h bırakın için 4 ° C'de tamir et.
  3. Yüksek çözünürlüklü mikro-CT 18 µm izometrik bir çözünürlükte ve x-ışını enerji ayarları 45 tarafından fareler calvarias analiz kV ve 550 anne.
  4. Mikro-CT veri yazılımı ile üç boyutlu yeniden yapılandırma kuralları.
  5. Kalitatif ve kantitatif analiz.
    1. İlk olarak, kare bölgenin orta hat dikiş çevresinde faiz bölgesi olarak seçin.
    2. İkinci olarak, ölçmek kemik mineral yoğunluğu (KMY), birim/toplam kemik birim (BV/TV), Trabeküler numarası (Tb.N), Trabeküler kalınlığı (Tb.Th), Trabeküler ayırma/aralığı (Tb.Sp) ve mikro-CT için sağlanan yazılımı ile toplam gözeneklilik yüzdesi
    3. Üçüncü olarak, tek yönlü ANOVA tarafından çeşitli ölçümler için üç grup karşılaştırın. Öğleden hoc Varyans analizi için Bonferroni yöntem2uygulayın.

4. grefti Osteoliz Model H & E boyama tarafından değerlendirilmesi

  1. Calvaria örneklerinde % 15 etilen diamin tetraacetic asit (EDTA) decalcify-4 ° C'de PBS Kalsiyumun çözüm 3 hafta boyunca her gün değiştirin.
  2. Parafin bir 2 cm x 1 cm x 1 cm küp için decalcified örnekleri katıştır ve onları 2 µm bölümlere partikül yükünün alanında dilim.
  3. Hematoksilen bölümlerle leke ve Eozin daha önce7açıklandığı gibi.
  4. Genel pathomorphism Filmler tarafından ışık mikroskobu yakalamak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kurum içi üretilen Nano CoCrMo parçacıklar 50 civarında olduğunu TEM (Şekil 2) tarafından sayısal olarak çapı, nm (3,56 standart hatası). Fare calvarias maruz CoCrMo parçacıklar, hayvanlar için kaldıktan sonra (n = 6 grup başına) için başka bir iki hafta muhafaza. İki hafta içinde grefti kesi tamamen iyileşmiş olarak ve dikişi düşebilir. Herhangi bir yerel enfeksiyon veya sendikasız Mayıs kemik kaybı değerlendirme etkiler. Fare kurbandan sonra calvaria örnekl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşınma parçacık kaynaklı Osteoliz farelerde için iki ana yöntem vardır: hava kesesi modeli ve grefti Osteoliz modeli. Hava kesesi modelinde, subkutan oluşturulan bir hava kesesi ilk, aşınma parçacık giriş ve implantasyon kemik doku8ardından kuruldu. Kese duvar aseptik gevşeme içinde kapaklarini taklit eder. Ancak, kemik implantasyon parçacıklar ve kemik doku arasındaki doğrudan etkileşim değerlendirmek zordur hiçbir biyolojik etkinlik ile nonvascular. Grefti Osteoliz model hava kesesi muadili birç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81572111), klinik bilim ve teknoloji proje Vakfı, Jiangsu Province (BL2012002), bilimsel araştırma projesi, Nanjing (201402007), Doğa Bilimleri tarafından desteklenmiştir Jiangsu eyaleti (BK20161385) temeli ve Çince Tıp doktor Derneği (2015COS0810) özel temeli.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Protez Waldemar Link GmbH'den CoCrMo alaşımı& CoGEMINI MK IICoCrMo nanopartiküllerini elde etmek için hammadde
Fabrikasyon yüksek vakumlu üç elektrotlu doğru akımMalzeme Bilimi ve Koleji Mühendislik, Nanjing TeknolojiKendi kendine tasarlanmış makine
6 haftalık erkek C57BL / 6J farelerNanjing Üniversitesi Model hayvan araştırma merkeziN000013
% 100 EtanolNanjing ReaktifiC0691514023Transmisyon elektron mikroskobu taraması için CoCrMo nanopartiküllerinin Çözücüsü
1.5 ml Mikrosantrifüj tüpleriTaizhou Weierkang Tıbbi Malzemeler co., LTDW603
Mikroanalitik dengeShenzhen Qun long Enstrüman Ekipmanları Co,. LTDEX125DZH
Ultrasonik çalkalayıcıŞangay Yuhao bilimsel enstrüman co., LTDYH-200DHCoCrMo nanopartiküllerini askıya almak için
Transmisyon Elektron MikroskobuFEITecnai G20
SimplePCI yazılımıCompix Inc.6.6 versiyonuOrtalama çap ve parçacık boyutu dağılımını hesaplamak için.
Yüksek elli sterilizasyon tavasıQIULONGYIQIKYQL-100DSEndotoksini dekontamine etmek için
Limulus Amebosit Lizat (LAL) TestiCharles RiverR13025Endotoksini ve nbsp'yi tespit etmek için;
15 ml Mikrosantrifüj tüpleriTaizhou Suyi MedicalB122
Fosfat tamponlu tuzlu su BosterBiyolojik TeknolojiAR0030CoCrMo nanopartikül stok çözeltisinin çözücüsü
Pentobarbital SodyumSigmaP3761Fareleri uyuşturmak için
Normal tuzluSACKLERSR8572EP-15Farelerin gözlerinin kurumasını önlemek için
% 75 EtanolNanjing ReaktifiC0691560275Dezenfeksiyon
Tıbbi pamuk topuShuitao1278298933Dezenfeksiyon
Tıraş MakinesiKemeiKM-3018Kürkü tıraş etmek için
MakasRWD LIFE SCIENCES12005-10Cildi kesmek için
Sütür RWD LIFE SCIENCEF34001-01Cildi dikmek için
İğne tutucuRWD LIFE BİLİMF33001-01Cildi dikmek için
İğneRWD LIFE SCIENCER14003-12Cildi dikmek için
Damar forsepsleriRWD LIFE SCIENCEF22003-09Cildi dikmek için
Neşter NEŞTERRWD LIFE SCIENCES31010-01Calvaria toplamak için
CımbızRWD LIFE SCIENCEF12006-10Calvaria
100 & micro'yu hasat etmek için; L pipetlerEppendorf3120000240Calvatias 100 & micro'ya partikül süspansiyonu gömmek için
; L pipet uçlarıAXYGENT-200-YBuzağılara partikül süspansiyonu gömmek için
5 ml MikrotüplerTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW621
%4 ParaformaldehitServicebioG1101Fiksasyon
Mikro Bilgisayarlı Tomografi SkyScanSkyScan1176
Etilen Diamin Tetraasetik AsitServicebioG1105Dekalsifikasyon
ParafinServicebio#0001
Parafin dilimleme makinesiLeicaRM2125RTS
Cam slaytServicebioG6004
Kapak camıServicebio200
HE boyama kitiServicebio#1-5HE boyama
Işık mikroskobuNikonE200
Üniversitesi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
  2. Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
  4. Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
  5. Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
  6. Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
  7. Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
  8. Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
  9. Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
  10. Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).
  11. Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
  12. Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853(2015).
  13. Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
  14. Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
  15. Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Murin ModelMikro BT AnaliziH ve E BoyamaPartik l S spansiyonuKranyal PeriostKemik Mineral Yo unlu uTEM G r nt leme

İlgili makaleler