G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

Summary

Akış Sitometresi ve yüksek işlem hacmi sıralama genom kopyası geç kopyalayan bölgeleri tanımlamak için birleştirme tekniği tarif.

Abstract

DNA ikileşmesi S aşaması hücre döngüsünün ilerlemesini takip etmek çok sayıda teknikleri geliştirilmiştir. Bu tekniklerin çoğu aydınlatma konumunun ve inisiyasyon tamamlanması yerine genom çoğaltma zamanlaması doğru yönetti. Ancak, bu bölgelerde yüksek seviyede kromozom kırılma ve mutasyon muzdarip çünkü son çoğaltma, tamamlamak üzere olan bölgeler genom kopyası anlıyoruz ve hastalık ve yaşlanma ile ilişkili olmuştur önemlidir. Burada nasıl yerine bölgelere genom kopyası son tam çoğaltma için tanımlamak için çoğaltma başlatma izlemek için kullanılan bir teknik genişletilmiş var açıklar. Bu yaklaşım Akış Sitometresi ve yüksek işlem hacmi sıralamanın kombinasyonuna dayanmaktadır. Bu rapor bu tekniği uygulamaya Maya üzerinde duruluyor olsa da, yaklaşım, bir Akış Sitometresi DNA içeriği göre sıralanan hücreler ile kullanılabilir.

Introduction

Ökaryotik genom çoğaltma çoğaltma, hangi çoğaltma dışında çatal (Fragkos ve ark.içinde 2015¹gözden) her iki yönde devam kökenleri denilen birden çok ayrı site başlatılır. Kökenleri değişir hem kendi zamanlama ve ateş verimliliğini ve çoğaltma kaynağı etkinliğini izlemek ve bu değişim nedenleri aydınlatmak için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Etkinlik bireysel kökenli tek iplikçikli DNA², hangi formların etkin kökenleri, çevresinde düzeylerinden anlaşılmaktadır olabilir veya 2D Jel Elektroforez belirli çoğaltma ara ürün³izlemek için kullanarak, her ikisi ile tespit edilebilir radyoakti....

Protocol

1. hazırlık için hücre Akış Sitometresi sıralama

1. 15 mL test tüpleri kültürler 1,5 mL başına 10⁷ hücre x 5 x 10⁶ yoğunluğu sonra gece büyüme ulaşmak öyle ki 8 mL her YEPD suyu içeren aşılamak (bkz: tartışma Not 1).
2. Spin aşağı 15 mL vidalı kapak santrifüj tüpü 5 min için Maya hücrelerinde (1400 x g, oda sıcaklığında veya 4 ° C), 1,5 mL % 70 etanol ve oda sıcaklığında 1 h veya buz (en az 3 h için bu oturup icar transferi bir 1.6 mL microfuge tüp hücrelerde resuspend süresiz olarak 4 ° C-ebilmek var olmak stok) (bkz: tartışma noktası (2)).
3. Spin aşağı Maya hücrelerinde microfuge (14.000 x g, 4 ° C'de) 1 dakika, 1 mL 50 mM....

Results

Mayası geç kopyalayan siteleri belirlemek için yukarıda açıklanan yordamı kullandık. Bu yaklaşım bir bilinen geç kopyalayan bölgesi yapay bir kromozom üzerinde kullanmayı test doğru ve güvenilir olduğu için teknik kanıtladı. Sonuçlarımız de çoğaltma zamanında tamamlanması biyolojik önemi kromozom 7, biz geç çoğaltma olarak G2-seq sonuçlarımız temelinde tanımlanan, bir geç kopyalayan bölge kayıp göstererek yaklaşık göstermiştir üç kat daha sık sık--dan bir karşılaştırılabilir kontrol bölge.......

Discussion

Bu teknik sağlamdır ve nispeten düz ön, özellikle dikkat için aşağıdaki ayrılmış ise:

(1) biz yoksa kültürleri istenen yoğunluk sadece 4 h aşı sonra ulaşmış sonra hasat farklılıklar hücre döngüsü dağıtımları içinde tezahür beri onlar log fazı, ulaşmadan kültürler en az 12 h için büyümek öneririz. Varsayımımız nispeten istikrarlı bir denge ulaştı bir hücre döngüsü dağıtım daha iyi doymuş bir kültür son zamanlarda taze ortamına Transfer edildiğinde hala Flux bir dağıtım daha bir "gerçek" günlük .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
YeaStar Genomik DNA kiti	Genesee Scientific	11-323
1 & mikro; M SYTOX Green	ThermoFisher	57020	, 50 mM sodyum sitrat, pH 7.2
50 mM sodyum sitrat, pH 7.2
RNaz çözeltisi (0.25 mg / mL)	Sigma	R6513	0.25 mg / mL RNaseA, 50 mM sodyum sitrat, pH 7.2 içinde yeniden süspanse edilir, RNase çözeltisini yalnızca ilk kullanımdan önce 10 dakika kaynatın ve bundan sonra -20 ° C'de saklayın;
proteinaz K çözeltisi (20 mg / mL)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	, 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2,% 50 gliserol içinde yeniden süspansiyon, -20 ° C'de saklayın; C
Model 50 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Zymo-spin III sütunları	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS Test Kiti	ThermoFisher	Q32851
Qubit 3.0 Florometre	ThermoFisher	Q33216
Covaris Model LE220 Odaklanmış Ultrasonikatör	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT Numune Hazırlama Kiti	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500 cihazı	Illumina	SY– 401– 2501
Gsnap Alignment Yazılımı	Açık Kaynak Yazılım / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap