Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

5.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56286

⸱

22 Mart 2018

 ,  , 
1Division of Clinical Research, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

Bu makalede

Özet

Akış Sitometresi ve yüksek işlem hacmi sıralama genom kopyası geç kopyalayan bölgeleri tanımlamak için birleştirme tekniği tarif.

Özet

DNA ikileşmesi S aşaması hücre döngüsünün ilerlemesini takip etmek çok sayıda teknikleri geliştirilmiştir. Bu tekniklerin çoğu aydınlatma konumunun ve inisiyasyon tamamlanması yerine genom çoğaltma zamanlaması doğru yönetti. Ancak, bu bölgelerde yüksek seviyede kromozom kırılma ve mutasyon muzdarip çünkü son çoğaltma, tamamlamak üzere olan bölgeler genom kopyası anlıyoruz ve hastalık ve yaşlanma ile ilişkili olmuştur önemlidir. Burada nasıl yerine bölgelere genom kopyası son tam çoğaltma için tanımlamak için çoğaltma başlatma izlemek için kullanılan bir teknik genişletilmiş var açıklar. Bu yaklaşım Akış Sitometresi ve yüksek işlem hacmi sıralamanın kombinasyonuna dayanmaktadır. Bu rapor bu tekniği uygulamaya Maya üzerinde duruluyor olsa da, yaklaşım, bir Akış Sitometresi DNA içeriği göre sıralanan hücreler ile kullanılabilir.

Giriş

Ökaryotik genom çoğaltma çoğaltma, hangi çoğaltma dışında çatal (Fragkos ve ark.içinde 20151gözden) her iki yönde devam kökenleri denilen birden çok ayrı site başlatılır. Kökenleri değişir hem kendi zamanlama ve ateş verimliliğini ve çoğaltma kaynağı etkinliğini izlemek ve bu değişim nedenleri aydınlatmak için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Etkinlik bireysel kökenli tek iplikçikli DNA2, hangi formların etkin kökenleri, çevresinde düzeylerinden anlaşılmaktadır olabilir veya 2D Jel Elektroforez belirli çoğaltma ara ürün3izlemek için kullanarak, her ikisi ile tespit edilebilir radyoaktif sondalar. Kökeni eski belirli bilinen sıralarını sınırlı olduğu için bu tekniklerin her ikisi de daha kolay S. cerevisiae memeli hücrelerinde uygulanır. Microarrays gelişiyle, genel olarak ateş kökenli değerlendirmek mümkün oldu. Bu ilk DNA ile ağır izotoplar etiketleme, orta içeren hafif izotopların bir G1 blok hücrelerden serbest ve ağır-hafif hibrid DNA genom4arasında oluşumu izleme tarafından yapıldı. Yüksek işlem hacmi sıralama giriş benzer genom geniş izleme kökenli faaliyet pahalı izotopik etiketleme zorunluluğu olmadan izin. Hücreleri DNA içeriği göre Akış Sitometresi ve derin sıralama için tabi DNA'ları sıralanmış. Sıra kapsama 1 x 2 x S faz boyunca devam eder çünkü göreli çoğaltma zamanlaması S aşamasında G1 veya G25,6, olanlar için hücre okuma derinliği karşılaştırarak tespit edilebilir. Bu teknikler, özellikle Maya için uygulanan kaynak zamanlaması ve verimlilik nasıl DNA dizisi, Kromatin yapısı ve DNA çoğaltma proteinler düzenleyen daha derin bir anlayış için yol açtı.

Sadık iletim hücresel proliferasyonu sırasında genetik bilgi DNA ikileşmesi, kökeni yer alan yalnızca başarılı inisiyasyon, aynı zamanda başarılı bir şekilde tamamlanması, çoğaltma, çoğaltma çatal buluştuğu oluşur gerektirir. Çoğaltma başlatma gibi genom arasında bile geç Hücre döngüsünde çoğaltılmamış kalan belirli bölgelerde tamamlama çoğaltma zamanlaması göre değişir. Gibi bölgelerden özellikle etkin çoğaltma kökeni uzak olabilir veya dizileri veya DNA polimerazlar engel Kromatin yapıları içerebilir. Geç bölgeleri çoğaltma kendilerini kromozom kırılma ve yüksek mutasyon oranları ile ilişkili olan ve kanser ve yaşlanma7,8,9karıştığı kırılgan siteler olarak bildirilebilir. Ancak, uygun bakım DNA ikileşmesi genom istikrar tamamlanması önemini rağmen bizim anlayış nerede ve nasıl bu gerçekleşir kadar bu çoğaltma başlatma gecikmeli. Ve bireysel genler olan geç çoğaltma hastalığı ile ilişkili olduğu süre ile örneğin, qPCR10, yerleri elucidating ve nedenleri geç çoğaltma eksik yatan, yönetmen küresel çalışmalar incelenmiştir. Burada "Biz Akış Sitometresi ile yüksek işlem hacmi sıralama genom çoğaltmasında tamamlanması ışık içinde birleştirmek G2 seq" olarak11Maya anlamlara bir tekniğini tanımlamak. Küçük değişiklikler ile bu iletişim kuralı akışı DNA içeriği göre sıralanmış olabilir herhangi bir hücre için adapte edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hazırlık için hücre Akış Sitometresi sıralama

  1. 15 mL test tüpleri kültürler 1,5 mL başına 107 hücre x 5 x 106 yoğunluğu sonra gece büyüme ulaşmak öyle ki 8 mL her YEPD suyu içeren aşılamak (bkz: tartışma Not 1).
  2. Spin aşağı 15 mL vidalı kapak santrifüj tüpü 5 min için Maya hücrelerinde (1400 x g, oda sıcaklığında veya 4 ° C), 1,5 mL % 70 etanol ve oda sıcaklığında 1 h veya buz (en az 3 h için bu oturup icar transferi bir 1.6 mL microfuge tüp hücrelerde resuspend süresiz olarak 4 ° C-ebilmek var olmak stok) (bkz: tartışma noktası (2)).
  3. Spin aşağı Maya hücrelerinde microfuge (14.000 x g, 4 ° C'de) 1 dakika, 1 mL 50 mM sodyum sitrat, pH 7.2, (14.000 x g, 4 ° C) aşağı spin için 1 dk resuspend, süpernatant Aspire edin, 1 mL 50 mM sodyum sitrat pH 7.2 resuspend , 0.25 mg/mL 1 h 50 ° C veya gecede 37 ° C ısı blok veya su banyosunda RNAse çözüm içeren.
  4. 50 µL İndinavir K çözüm (20 mg/mL 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl2, % 50 ağırlık birimi gliserol için resuspended) ekleyin ve 50 ° C'de 1 h için kuluçkaya
  5. (14. 000 x g, 4 ° C) hücreleri aşağı spin, 1 mL 50 mM sodyum sitrat, pH 7.2 hücrelerde resuspend, (14.000 x g, 4 ° C) spin, vakum süpernatant Aspire edin, 1 mL 1 µM yeşil nükleik asit zorlanma 50 mM sodyum sitrat içinde resuspended içinde resuspend , pH 7.2 ve karanlık oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya, 2 x 2 için solüsyon içeren temizleyicide s her (çıkış gücü 2 watt).

2. hücre sıralama

  1. Bir hücre sıralayıcısı kullanarak, her hücre döngüsü aşama olduğu gibi Resim 1 en az 1.6 milyon haploit hücreleri toplama hücreleri DNA içeriği aşamada G1, S, "erken G2" ve "geç G2", içine göre sıralamak (bkz: tartışma noktası (3)).
  2. Hücreleri microfuge tüpler için transfer ve hücreler için 14.000 x g microfuge 4 ° C'de 20 dakika aşağı spin ve süpernatant vakum ile Aspire edin (Pelet süresiz-20 ° C'de dondurulmuş depolanabilir; nokta (4) tartışma bakın).

3. DNA ekstraksiyon ve kitaplıkları sıralama hazırlık

Not: Aşağıdaki adımları "protokol ben" Maya genomik DNA ekstraksiyon kiti temel alır ( Tablo malzemelerigörmek).

  1. "Sindirim arabelleği," Maya litik enzim hücre duvarı ve Maya litik enzim 5 µL sindirmek, vortexing tarafından resuspend ve 40-60 dk 37 ° C'de kuluçkaya sağlar özel bir arabellek 120 µL ekleyin.
  2. "Lizis arabelleği," deterjan ve girdap için 10-20 s sabit içeren özel bir arabelleği 120 µL ekleyin.
  3. 250 µL kloroform add - iyice karıştırın 1 dk için.
  4. Bir microfuge 2 min için maksimum hızda çevir.
  5. Süpernatant DNA bağlama sütun ve 1 dk. için bir microfuge maksimum hızda santrifüj üzerine yükleyin.
  6. "DNA yıkama arabelleği," etanol ve bir microfuge maksimum hızda 1 dk santrifüj içeren özel bir arabelleği 300 µL ekleyin. Aracılığıyla akış atmak, DNA yıkama arabelleği 300 µL eklemek ve yıkama işlemi yineleyin.
  7. Spin sütun bir taze microfuge tüp transferi, su (değil TE) 60 µL eklemek - 1-3 dakika bekleyin ve 10 için santrifüj kapasitesi s DNA elute.
  8. Konsantrasyon dsDNA yüksek hassasiyet arabelleği seyreltilmiş 1: 200 ve sonra sağlanan standart 10 µL için ayarı'nı kullanarak bir yer ölçü Floresans dsDNA yüksek hassasiyet reaktif 195 µL DNA'ın 5 µL ekleyerek ölçün; DNA toplam verim 10 ve 50 ng arasında bekliyoruz.
  9. Solüsyon içeren temizleyicide (Peak olay gücü 450, görev faktörü % 30, döngüleri patlama başına 200, tedavi süresi 60 s, su seviyesi 6) DNA ' 250-350 bp parçalara kırmak için.
  10. DNA örneği hazırlık seti kullanarak bir kitaplığı hazırlamak ve bu (en az 10 milyon 50 bp tek taraflı kenar okuma) DNA sıralama cihazda hızlı modda sıra (bkz: tartışma Not (5)).

4. analiz veri ve çoğaltma nesil Sekanslama profilleri

  1. Saccharomyces cerevisiae sacCer3 genom Gsnap12 kullanarak serileri hizalamak (tartışma Not (6) bakınız).
  2. Ücret baz çifti derinliklerinde Bedtools' "genomeCoverageBed" yazılım13kullanarak okundu öğrenmek.
  3. Artefactual sivri okuma derinliklerinde varsa kaldırın (tartışma Not (7) bakınız).
  4. Düz okumak derinlikleri kromozom 20 kayar pencere "runMean" işlevi R kullanarak KB medians kullanarak tarafından paket "caTools" (bkz: tartışma Not (8)).
  5. Arsa derinlikleri S faz, erken G2 ve geç G2 (bkz: tartışma Not (9)) tamamen çoğaltılmış okuma derinliklerinde bir yüzdesi olarak okuyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mayası geç kopyalayan siteleri belirlemek için yukarıda açıklanan yordamı kullandık. Bu yaklaşım bir bilinen geç kopyalayan bölgesi yapay bir kromozom üzerinde kullanmayı test doğru ve güvenilir olduğu için teknik kanıtladı. Sonuçlarımız de çoğaltma zamanında tamamlanması biyolojik önemi kromozom 7, biz geç çoğaltma olarak G2-seq sonuçlarımız temelinde tanımlanan, bir geç kopyalayan bölge kayıp göstererek yaklaşık göstermiştir üç kat daha sık sık--dan bir karşılaştırılabilir kontrol bölge...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu teknik sağlamdır ve nispeten düz ön, özellikle dikkat için aşağıdaki ayrılmış ise:

(1) biz yoksa kültürleri istenen yoğunluk sadece 4 h aşı sonra ulaşmış sonra hasat farklılıklar hücre döngüsü dağıtımları içinde tezahür beri onlar log fazı, ulaşmadan kültürler en az 12 h için büyümek öneririz. Varsayımımız nispeten istikrarlı bir denge ulaştı bir hücre döngüsü dağıtım daha iyi doymuş bir kültür son zamanlarda taze ortamına Transfer edildiğinde hala Flux bir dağıtım daha bir "gerçek" günlük ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser hibe A.B. NIH GM117446 tarafından desteklenmiştir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
YeaStar Genomik DNA kitiGenesee Scientific11-323
1 & mikro; M SYTOX GreenThermoFisher57020, 50 mM sodyum sitrat, pH 7.2
50 mM sodyum sitrat, pH 7.2
RNaz çözeltisi (0.25 mg / mL)SigmaR65130.25 mg / mL RNaseA, 50 mM sodyum sitrat, pH 7.2 içinde yeniden süspanse edilir, RNase çözeltisini yalnızca ilk kullanımdan önce 10 dakika kaynatın ve bundan sonra -20 ° C'de saklayın;
proteinaz K çözeltisi (20 mg / mL)ThermoFisher / Invitrogen25530-015, 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2,% 50 gliserol içinde yeniden süspansiyon, -20 ° C'de saklayın; C
Model 50 Sonic DismembratorFisher ScientificFB50A220
BD Biosciences FACSAria IIBD Biosciences644832
Zymo-spin III sütunlarıZymo ResearchC1005
Qubit dsDNA HS Test KitiThermoFisherQ32851
Qubit 3.0 FlorometreThermoFisherQ33216
Covaris Model LE220 Odaklanmış UltrasonikatörCovaris500219
Illumina TruSeq DNA LT Numune Hazırlama KitiIllumina15026486
Illumina HiSeq 2500 cihazıIlluminaSY– 401– 2501
Gsnap Alignment YazılımıAçık Kaynak Yazılım / Genentechhttp://research-pub.gene.com/gmap
içinde yeniden süspanse edilmiş

Kaynaklar

  1. Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
  2. Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
  3. Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
  4. Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
  5. Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
  6. Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
  7. Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
  8. Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
  9. Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
  10. Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
  11. Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
  12. Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
  13. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
  14. Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).
  15. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  16. Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
  17. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Akış SitometrisiDNA ReplikasyonuHücre Döngüsü AyıklamaGenomik DNA EkstraksiyonuMaya Genomik AnaliziSir2 DeasetilazTY Elementi KapanmasıKayan Pencere Analizi
G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.