Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

17.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56301

⸱

22 Kasım 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology - Hellas, 3Center for Molecular Medicine, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 4Laboratory of Neurosciences, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 5Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford, 6Department of Clinical Molecular Biology, University of Oslo and Akershus University Hospital, 7Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 8Danish Center for Healthy Aging, University of Copenhagen

Bu makalede

Özet

Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.

Özet

Mitokondri güçlüdür hücre vardır ve ATP şeklinde hücresel enerji üretmek. Biyolojik yaşlanma ve metabolik hastalıklar, erken yaşlanma sendromları ve nörodejeneratif hastalıklar Alzheimer hastalığı (Ah) ve Parkinson hastalığı (PD) gibi gibi bozukluklar çok çeşitli mitokondrial disfonksiyon katkıda bulunur. Mitokondrial Biyogenez ve işlevsel olmayan mitokondri mitophagy aracılığıyla verimli boşluk mitokondrial sağlık bakım bağlıdır. Doğru bir şekilde autophagy/mitophagy, özellikle hayvan modellerinde, algılamak için deneysel yöntemleri geliştirmek için zor oldu. Mitophagy moleküler mekanizmaları anlama yolunda son ilerleme roman mitophagy algılama teknikleri gelişimini sağlamıştır. Burada, mitophagy insan hücrelerinde Caenorhabditis elegans izlemek için çeşitli teknikler çok yönlü tanıtmak (örneğin, Rosella ve DCT-1 / LGG-1 suşları) ve fare (mt-Keima). Türler arası değerlendirme, dahil olmak üzere bu mitophagy algılama teknikleri bir arada mitophagy ölçümlerin doğruluğunu geliştirmek ve daha iyi sağlık ve hastalığında mitophagy rolünü anlamak için yol.

Giriş

Mitophagy mitokondrial bakımı için önemlidir. Mitokondri birden çok hücre sinyal yolları kesişir ve evrensel alt hücre organelleri hücresel enerji üretimi, hücre metabolizması ve kalsiyum homeostazı1,2,3, sorumlu olan 4. mitokondri sürekli deneyimi zorluklar Reaktif oksijen türleri (ROS) ve mitokondriyal toxicants gibi endojen ve eksojen kaynaklardan sırasıyla hangi kurşun "yaşlı" ve işlevsel olmayan mitokondri üretimi için. Hasarlı mitokondri birikimi zararlı ROS miktarını artırarak sırasında ATP üretim verimliliğini azaltır ve yaşa bağlı hastalıklar gibi metabolik hastalıklar, reklam, bağlı ve PD1,5,6 . Mitokondri indüklenen hücresel fonksiyon bozukluğu önlemek için özellikle zarar mitokondri tanımak ve verimli bir şekilde bir hücresel süreç boyunca kaldırmak için hücreleri ihtiyaç mitokondrial autophagy (mitophagy) olarak adlandırdığı. Bu mitophagy sağlık önemi gösterdi ve hastalığı mitophagy algılamak doğru ve verimli yöntemleri ihtiyacını göstermektedir vitro ve içinde vivo.

Mitophagy pek çok protein ve protein kompleksleri5,7,8içeren çok adımlı bir işlemdir. Kısacası, hasarlı bir mitokondri ilk tanınan ve plazma zarı, endoplazmik retikulum, Golgi kompleksi, çekirdeği veya mitokondri kendisi9,10gerçekleşebilir bir çift membraned phagophore tarafından yuttu. Küresel phagophore uzar ve sonunda içinde mitokondriyal autophagosome (mitophagosome) oluşturan mitokondri mühürler. Mitophagosome sonra bozulması, hasarlı mitokondri bozulmuş ve geri dönüşümlü7,8olduğu bir autolysosome oluşturan lysosome ile birleştirir. Büyük autophagic proteinler de mitophagy içinde yer alan içerir: Autophagy ilgili 7 (ATG7) ve Beclin1 (inisiyasyon), Microtubule-Associated Protein 1A/1B-hafif zincir 3 (LC3-II) (LGG-1 C. elegans) ve p62 (phagophore bileşenleri), ve ilişkili lizozomal membran glikoprotein 2 (LAMP2)6,7. Ayrıca, birkaç temel proteinler PTEN kaynaklı sözde kinaz 1 (pembe-1), Parkin1, nükleer nokta Protein 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 etkileşim Protein 3 gibi (NIX/BNIP3L) (DCT-1, C. elegans') de dahil olmak üzere mitophagy için benzersiz diğerleri arasında5,6,11.

Autophagy seviyelerinde değişiklikleri algılamak için kullanılan genel yöntem tarafından LC3-II/LC3-ı veya LC3-II/aktin oranıdır. Ancak, bu oran artışı artan bir inisiyasyon veya mitophagosome lysosome12Engelli bir füzyonu yansıtıyor olabilir gibi bu yöntem nonspesifik,. Colocalization bir autophagy işaretleyici (örneğin, LC3) ve mitokondriyal bir protein (örneğin, translokaz, dış mitokondri zar 20 (TOMM20, hangi proteasomes tarafından bozulmuş)) arasında değerlendirmek için başka bir yöntemdir. Ancak, bu yalnızca toplam mitophagy seviyelerinde değişiklik gösterebilir ve adım (lar) ayırt edemez hangi tıkanıklık oluşur. Bu mitophagosomes birikimi neden paralel olarak lizozomal inhibitörleri (örneğin, E64d + Pepstatin A, olarak adlandırdığı EP) kullanarak açıklık. Mitophagosomes temel, sayısı ve tedavi EP ile aşağıdaki mitophagosomes sayısı arasındaki farkı mitophagy belirtebilirsiniz. Bu sınırlamalar roman mitophagy algılama teknikleri geliştirilmesi isteniyor. Mitophagy insan hastalıkların geniş bir spektrumda artan alaka içinde görüş-in, biz araştırmacılar için yararlı olabilir birkaç sağlam mitophagy algılama teknikleri mevcut. Vitro ve in vivo teknikler kapak ve mitophagy değişiklikleri doğrulamak için bir çok teknik birleştirerek öneririz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanlar (erkek ve dişi fareler) doğmuş ve uygun olarak ve NIH hayvan bakım ve kullanım Komitesi onay akredite bir hayvan tesisi yetiştirilen. Ötanazi yöntemleri tüm ulusal ve kurumsal düzenlemeler ile tutarlı olması gerekir.

1. insan hücrelerinde Mitophagy tespiti

  1. Mt-Keima plazmid kullanarak mitophagy tespiti
    Not: mt-Keima basitleştirilmiş bir mitokondri hedef sinyal için erimiş Keima protein, in vivo mitophagy algılama için yararlı olmuştur. MT-Keima hangi yeşil Floresans temel veya tarafsız koşullarda (uyarma 458 nm) ve kırmızı Floresans (uyarma 561 nm) asidik ortamlarda sergileyen bir ratiometric pH duyarlı floresan proteindir. Sağlıklı mitokondri temel ya da tarafsız koşullarda (pH 7-8) gelişirler ve mt-Keima ile transfected zaman yeşil Floresans gösterilir. Mitokondri mitophagy geçmesi ve asidik organellerin ile sigorta, pH 4.5'e düşer ve kırmızı Floresans6,13,14mt-Keima içeren mitokondri sergilemek. Önemlisi, mt-Keima mitophagy değerlendirilmesi daha uzun süre üzerinden etkinleştirme lizozomal proteaz için dayanıklıdır. İletişim kuralı aşağıdaki 6-şey plakalar için tasarlanmıştır.
    1. 1. gün: birincil insan hücreleri (örneğin, fibroblastlar) ya da ölümsüzleştirdi insan hücreleri (örneğin, Hela hücreleri veya U2OS hücre) kullanın. Tohum yaklaşık 0,3-1 × 106 hücreler/iyi (bağlı olarak hücreleri % 70 confluency ertesi gün ulaşmak izin vermek için hücre büyüme hızı) bir 6-şey tabak içinde. Tam hücre kültür orta hücreleri korumak (Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) orta % 10 ile desteklenmiş FBS ve % 1'karışık penisilin-streptomisin çözümü) ve bir hücre kültür kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya (%20 O2, % 5 CO2 ). 1 mL tam hücre kültür orta/iyi bir 6-şey tabak içinde ekleyin.
      Not: Bu sahne6' gen overexpression/nakavt veya ilaç tedavisi yapılabilir.
    2. 2. gün: Mix mt-Keima plazmid DNA6 ve DNA transfection reaktifi (6-şey plaka bir kuyu karışımı).
      1. Bir DNA transfection reaktif 15 µL serum-Alerjik orta üreticinin protokolüne göre 150 µL ile sulandırmak.
      2. Mt-Keima plazmid DNA 2-5 µg 150 µL serum-Alerjik orta ile sulandırmak.
      3. Seyreltilmiş DNA transfection reaktif, 10 için girdap seyreltilmiş mt-Keima plazmid eklemek s ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
        Not: DNA transfection koşulları duruma getirilmesi plaka boyutuna bağlı olarak gerekebilir (bkz: ayrıntılı bilgi için üretici firmaların iletişim kuralları).
      4. DNA/transfection reaktif karışımı dropwise hücrelere ekleyin, sonra kadar çözüm tamamen karışık plakaları 5-10 s için hafifçe sallayın.
    3. 3. gün: medya ile taze tam hücre kültür orta (1 mL/de) DNA transfection reaktif içeren orta değiştirerek değiştirebilirsiniz.
    4. 4. gün: confocal mikroskobu6kullanarak hücreleri görüntü. İki görüntüleme kanal kullanın: yeşil kanal (uyarma 458 nm, emisyon 570-695 nm) normal mitokondri ve kırmızı kanalı (uyarma 561 nm, emisyon 570-695 nm) mitokondri görselleştirmek için mitophagy geçiren görselleştirmek için. Rasgele 20 alanları toplam 100-200 hücre her iyi karşılamak için 40 x büyütme altında görüntü.
    5. Veri çözümlemesi gerçekleştirin. "Mitophagy endeksi" hesaplanır (mitokondri mitophagy geçiren yüzdesi), kırmızı ve yeşil kanalları Floresans miktarını ölçmek için görüntü analiz yazılımı kullanarak: kırmızı + yeşil floresan için kırmızı Floresans oranı almak ve 100 ile çarpmak6.
      Not: Alternatif transfection mt-Keima stabil ifade HeLa hücre hatları14kullanarak içerir. HeLa hücreleri Parkin ifade değil beri Parkin stabil Parkin bağımlı mitophagy bu hücre doğrultusunda çalışmaya ifade gerekir.
  2. Sitokrom C oksidaz alt birim II (COXII) ve LAMP2 arasında colocalization kullanarak mitophagy tespiti
    Not: COXII bir mitokondriyal genom kodlanmış iç membran proteinidir. 'mitophagy index' COXII toplam miktarı yüzdesi cinsinden ifade edilen LAMP2 ile colocalized COXII oranı eşittir.
    1. HeLa hücreleri (veya diğer hücrelere 1.1.1 adımda belirtilen faiz) tohum kuluçka 37 ° c (%20 O2, % 5 CO2) 4-şey odası slayt (1-5 × 104 hücreleri 1 mL tam hücre kültür orta/iyi) bir hücre içinde gecede kültür.
    2. 10 mM karbonil 3.0 µL - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) siyanür ve 3 h hücre kültür kuluçka (Adım 1.2.1) kuluçkaya ekleyin.
      Not: mitophagy etkileyen diğer ilaçlar kullanılabilir.
    3. 1 mL pipet kullanarak kültür orta kaldırmak için hücreleri iki kez ile 1 mL/de soğuk yıkama (0-4 ° C) 1 x PBS. 10-30 s sonraki yıkama önce oturup çözüm ver. Sonra 0.5 mL % 3.7 paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS içinde her şey için ekleyebilirsiniz ve hücreleri tamir buzda 10 min için kuluçkaya.
      Dikkat: PFA toksindir. Bir duman mahallede PFA kullanarak çalışır.
    4. 1 mL pipet kullanarak PFA çözüm atmak, soğuk 1 iki kez hücrelerle yıka X PBS (1 mL/iyi; izin çözüm için 10 oturup sonraki yıkama önce s) ve hücreleri ile 1 mL/de buz üzerinde 10 dakika (içinde 1 x PBS) % 0.25 deterjan permeabilize.
    5. Permeabilizing arabellek atmak, soğuk 1 x PBS ve atma iki kez hücrelerle nazikçe yıkayın (10 için oturup çözüm izin s arasında yıkar). 1 mL/4 ° C'de 1 x PBS FBS gecede % 5'lik de hücre block Nem kaybını önlemek için odaları kapsar.
    6. 0.5 mL/iyi bir karışık antikor çözüm COXII antikor (fare, 1:250 seyreltme) ve LAMP2 antikor (tavşan, 1:20-1:50 seyreltme) 1 x PBS ile %5 FBS ve buz üzerinde mağaza içinde 0,5-1 için hazırlamak h.
    7. 4-iyi odası kaymak dışarı soğuk oda almak ve 1 mL pipet ile engelleme çözüm atın. Hücreleri iki kez 1 mL/x PBS ve atma soğuk 1'in de nazikçe yıkayın (10 için oturup çözüm izin s yıkama arasında), daha sonra 0.5 mL ekleyin/iyi karışık antikor çözüm. Bir shaker düşük hızda 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
    8. 1 mL pipet kullanarak ilk antikor çözüm atmak ve yavaşça hücreleri üç kez ile 1 mL/soğuk 1 x PBS, iyi yıkama ve atmak. Çözüm için 10 oturur izin sonraki yıkama önce s. 1:250 seyreltme % 5 ile 1 mL/iyi (örneğin, kırmızı floresan protein LAMP2 için; (RFP) dalga boyu 568 nm ile Anti-tavşan keçi ve keçi Anti-fare ile COXII için yeşil flüoresan protein (GFP) nm dalga boyu 488) floresan ikincil antikorların Ekle 1 x PBS içinde FBS. 4-iyi odası slayt alüminyum folyo ile kapak ve düşük hızda bir shaker 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
    9. İkinci antikor çözüm 1 mL pipet ile atmak. Altı kez ile 1 mL/de soğuk 1 x PBS hücreleri nazikçe yıkayın. 1dk sonraki yıkama önce oturup çözüm ver.
    10. 50 µL/iyi antifade montaj orta DAPI ile hücrelerle bağlama ve kapak notları ekleyin.
    11. 66 x büyütme ve daldırma yağ confocal mikroskop altında hücreler görüntü (kiremit tarar / mozaik hücreleri tarafından yazılım görüntüsü sayısını artırmak için kullanılan). Kanal pozlama süresi, dijital kazanç, dijital ofset, vb tüm görüntüleme işlemleri (Ayrıntılar için bkz: yazılım yönergeleri)15boyunca gibi aynı ayarları kullanır.
    12. Kullanım colocalization analiz yazılımı kantitatif analiz 100 en az 20 rasgele görüntüler için15hücreleri. Tüm tek tek hücreleri seçmek için "Kapalı Bezier" işlevini kullanın. Pearson'ın colocalization katsayısı analiz hücrelerdeki mitophagy düzeylerini belirlemek için RFP, ağırlıklı veya unweighted, GFP karşılaştırın. Colocalization analiz yazılımı analiz boyunca yatay ve dikey ince artı değerleri korumak. Bu hedef işaretini doğru bir şekilde ayarlamak için fazladan iki hücre hazırlamak ve bir COXII ve diğer LAMP2 etiket. Sonra hemen her kanal15 piksel dağıtıma üstüne crosshairs ayarlayın (Ayrıntılar için yazılım talimatlara bakın).
  3. Ölçüm mitophagy tarama için Imaging yüksek işlem hacmi
    Not: yüksek işlem hacmi ekranları mitophagy indükleyici veya mitophagy inhibe bileşiklerin büyük bileşik kitaplıklardan gerçekleştirme teknik olarak istiyor. Mitokondri autophagosomes ile colocalization dayalı bir görüntüleme tekniği16eleme mitophagy daha basit, henüz son derece hassas bir alternatiftir.
    1. 1. gün: Tohum hücreleri (örneğin, 5. 000 hücre/100 mL hücre kültür medya/iyi, insan birincil fibroblastlar) bir 96-şey plaka (bkz. Adım 1.1.1).
    2. 2. gün: belirlenen kuluçka kez FCCP veya diğer bileşikler ilgi ile ikinci günden hücreleri tedavi (bkz. Adım 1.2.2).
    3. Adımları 1.2.2-1.2.9 takip COXII için birincil antikorları kullanarak (fare, 1:250 seyreltme % 5 ile 1 x PBS FBS) ve LC3B (tavşan, 1: 100-1: 200 seyreltme % 5 ile 1 x PBS FBS). Alternatif olarak, COXII ve LAMP2 için birincil antikorlar kullanılabilir.
    4. Hücreleri floresan okuyucu16kullanarak görüntü. Görüntüleri rastgele yerleştirilmiş alanları ve en az 500 hücre/kuyu ile toplamak.
    5. Bir hücre özelleştirilmiş analyzer protokolü16kullanarak veri analiz.

2. C. elegans Mitophagy tespiti

Not: Yuvarlak solucanlar C. elegans mitophagy organizma düzeyinde tahlil için bir platform sağlar. İki soy mitophagy izlemek için kullanılabilir: (1) mitokondri hedefli Rosella (mtRosella) veya (2) mitophagy reseptör DCT-1 erimiş GFP ile birlikte LGG-1 erimiş Discosoma sp. kırmızı floresan protein (DsRed)5ile, autophagosomal işaret 17.

  1. Rosella Biyoalgılayıcı kullanarak izleme Mitophagy
    Not: Rosella bir pH duyarlı GFP türevi erimiş bir pH-duyarlı DsRed birleştiren bir moleküler Biyoalgılayıcı var. Rosella Biyoalgılayıcı asidik lysosome (pH ~ 4.5) ve diğer hücresel kompartmanlarda pH farklılıkları yararlanır. Bu Biyoalgılayıcı başarılı bir şekilde mitophagy Saccharomyces cerevisiae ve HeLa, HEK293 ve HCT11618,19gibi birçok memeli hücre satırlarını izlemek için kullanılmıştır. Bu çok yönlü çift floresan muhabir uyarlanmış ve transgenik C. elegans oluşturulan nematodlar vücut-duvar kas hücrelerindeki mitokondri hedefli Rosella (mtRosella) ifade. Mitophagy indüksiyon mtRosella floresan azaltılmış GFP/DsRed oranında tarafından belirtilir.
    1. 1. gün: L4 larva bir diseksiyon mikroskop5kullanarak E. coli ile (OP50) numaralı seribaşı bir yuvarlak solucanlar büyüme medya (NGM) plaka üzerine vücut-duvar kas hücrelerindeki mitokondri hedefli Rosella (mtRosella) ifade Worms seç. 10-20 kurt/plaka üzerinde en az üç 3,5 cm tabak koyun. Standart sıcaklık 20 ° C5nematodlar kuluçkaya.
      Not: L4 larva20ve solucanlar bir konumdan başka bir21' e aktarmak için kullanılan bir seçim yapmak için yol tanımlamasını içeren solucan Anatomi için bkz.
    2. 5. gün: 15-20 L4 transgenik larva seçerek nematodlar eşitleyin ve taze aktarmadan OP50 NGM plaka numaralı seribaşı. Deneysel koşul başına en az beş tabak kullanın.
    3. 7. gün: araç plakaları mitophagy etkileyen ilaçlar faiz veya pozitif denetimler için hazır olun.
      1. NGM kaplamalar mitophagy-inducing bileşikler bakteriler tarafından metabolize edilir değil emin olmak için UV ışığın 222 µW/cm2 (yoğunluğu) ile 15 dakika açarak numaralı seribaşı E. coli (OP50) bakterileri öldürmek. Tabak 2.000 J/m2ile maruz gerekir.
        Not: Saniye gerekli teshir edilmesi 2000/((intensity in µW/cm2) = * 100).
      2. Compound(s) ilgi numaralı seribaşı NGM levhalar üstüne ekleyin. Bileşik araç (bileşim, Dimetil sülfoksit (DMSO) gibi çözülmeye kullanılan çözücü) eşit miktarda araç plakaları bir negatif kontrol ekleyin. Mitophagy indüksiyon, mitokondriyal toxicant olumlu denetim için bozması (8 mM son konsantrasyonu) kullanıldı. GKD2O tedavi grubunda agar plaka üstüne 190 µL ile 8 M bozması stokunun 10 µL içeren bir çözüm ekleyin. Araç grubu için DMSO 10 µL 190 µL GKD2O tu agar plaka ile içeren bir çözüm ekleyin.
        Not: Bozması-çalışma çözüm 4 ° C'de 1 ay için tutulabilir
      3. Yavaşça kadar uyuşturucu plakaları girdap veya araç tüm yüzey kat. Solucanlar aktarmadan önce oda sıcaklığında en az 1 h için kapalı göz kapakları ile kuru plakaları izin.
        Not: Uyuşturucu plakaları bu katılaşır önce sıvı NGM uyuşturucu ekleyerek da hazırlanabilir.
    4. 7. gün: 10-20 adım 2.1.2 bozması, compound(s) faiz veya araç (DMSO) içeren kaplamalar için hazırlanan 2 gün eski yetişkin Transjenik hayvanlar aktarın. 20 ° C'de Transjenik hayvanlar için 2 gün kuluçkaya.
    5. 9. gün: (Bkz. Ek malzeme) % 2 özel pedleri hazırlayın. M9 içinde 20 mM levamisole yastık başı, sonra bir damlacık (10 µL) ekleyin. Transjenik hayvanlar görüntüleme için M9-levamisole düşüş yerleştirerek hareketsiz. Yavaşça bir coverslip üstüne yerleştirin.
    6. Tek Transjenik hayvanlar için bir epifluorescence mikroskobu bağlı bir kamera ile yakalamak. Floresan mtRosella 10 X büyütme5vücut-duvar kas hücrelerindeki ifade tüm transgenik nematodlar görüntülerini elde etmek. Toplanan görüntüleri kaydetmek.
    7. ImageJ yazılımı ile alınan görüntüleri işlemek. Autofluorescence bağırsak dokusunda önlemek için solucan başkanı yer alan vücut duvar kas hücreleri analiz. Ortalama piksel yoğunluğu değeri ve toplam alanı, her hayvanın baş bölgesinin sadece floresan her resim için ölçmek. İlgi belirli alan analiz etmek için:
      1. 'Kanal split' görüntüleri dönüştürmek için 'resim' ve 'renk' açılır menüsünde seçin.
      2. Kullanmak ilgi floresan alan yakalamak için 'serbest seçim' alet.
      3. 'Ölçüm' komut 'analiz' aþaðý açýlan menüsünden seçin ve piksel yoğunluğu çözümlemesi gerçekleştirin.
      4. Piksel yoğunluğu yoğunluk analiz toplam alanına göre bölerek normalize. Normalleştirme DsRed oranı22GFP hesaplayın.
    8. Kullanmak istatistiksel analiz yazılımı ya kuralları öğrenci t-testi (iki grup arasında karşılaştırma) veya ANOVA (birden çok grupları arasında karşılaştırma) olarak önemli5,17 p < 0,05 ile istatistiksel analiz için .
  2. DCT-1 ile LGG-1 arasında ortak yerelleştirme kullanarak mitophagy değerlendirilmesi
    Not: DCT-1 koşulları, onun sözde orthologues BNIP3 ve NIX/BNIP3L memeliler5benzer stres yanıtında mitophagy reseptör görevi görür dış mitokondrial membran proteinidir. Böylece, mitophagy başlatma DCT-1 mitophagy reseptör ve autophagosomal membran proteini LGG-1 (memeli LC3 homolog) arasında ortak yerelleştirme tarafından değerlendirilir.
    1. 1. gün: Bir OP50 üzerine vücut-duvar kas hücreleri5 DCT-1::GFP ve DsRed::LGG-1 ifade Transjenik hayvanlar Pick L4 larva NGM plaka numaralı seribaşı. 5-10 solucan/3.5 cm tabak ve en az üç tabak kullanın. 20 ° C'de nematodlar kuluçkaya
      Not: Transgenes ayrı plazmid bulunmaktadır ve onlar genom entegre olmayan. Rol-6(su1006) ve pmyo-2 GFP contransformation işaretleri taşıyan nematodlar kadar seç. Yalnızca her iki contransformation işaretçileri olan transgenik solucanlar DCT-1::GFP ve DsRed::LGG-1 vücut-duvar kas hücrelerindeki ifade eder.
    2. 2.1.2-2.1.5 adımları.
    3. Görüntü tek vücut-duvar kas hücreleri bir confocal mikroskop5,23için bağlı bir kamera ile. Tüm vücut-duvar kas hücrelerinin kenarlıklarının algılamak ve almak z-yığını altında 63 x büyütme görüntü. Yüksek büyütme de kullanılabilir.
    4. Açın ve confocal yazılımı ile alınan görüntüleri işlemek. Mitophagy inisiyasyon co yerelleştirme autophagosomal işaretleyici (DsRed::LGG-1) mitophagy reseptör (DCT-1::GFP) simgesiyle gösterilir. El ile her yığın vücut-duvar kas hücre5etkinlikte co yerelleştirme ölçmek. (Objektif ve Büyüteç, filtreler, pozlama süresi, çözünürlük, lazer yoğunluğu, kazanç, vb) tüm mikroskop ve kamera ayarlarını deneyler tutarlı tutmak için önemlidir. Tüm ayarları belirtmek gerekir.
    5. Kullanmak istatistiksel analiz yazılımı ya kuralları öğrenci t-testi (iki grup arasında karşılaştırma) veya ANOVA (birden çok grupları arasında karşılaştırma) olarak önemli5,17 p < 0,05 ile istatistiksel analiz için . İki yönlü karşılaştırmalar öğrencinin tkullanmak için-test (p < 0.05 olarak kabul edilir önemli). Birden fazla karşılaştırmalar için post hoc Bonferroni testi ile düzeltilmiş tek faktör (ANOVA) Varyans analizi kullanın. Biz en az 50-70 hayvanlar veya 30-50 beden-duvar kas hücreleri deneysel her koşul için analiz öneririz. Denemenin en az üç kere tekrar edin.

3. Mitophagy farelerde tespiti

Not: mitophagy farelerde algılamak için Önceki yöntemler hantal, büyük küçük harf duyarlı ve ölçmek zordur. Floresan muhabir Keima mitokondrial hedefli şeklinde ifade bir transgenik fare modeli (mt-Keima) şimdi mitophagy fizyolojik ve patofizyolojik koşulları geniş bir alanda düzeylerini değerlendirmek için kullanılabilir.

  1. Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi14tarafından onaylanmış bir iletişim kuralı kullanılarak fareler ötenazi.
  2. Bacaklarda iğne kullanarak çalışma platformu için fare (ventral tarafı yukarı) güvenli. Bir kesik karaciğer24ortaya çıkarmak için mikrocerrahi makas ve forseps kullanarak alt karın içinde olun. Karaciğer (örneğin, bir parça 1 × 1 × 1 cm, sağ LOB) bir parça kesip mikrocerrahi makas ve forseps kullanarak.
    Not: Mitophagy farelerde algılama karmaşıktır ve bilgi fare anatomi ve son derece yetenekli fare işleme ve fare ameliyat gerektirir. Bu iletişim kuralının temel, anahtar adımları bu yöntemi sağlar ve kullanılabilir24daha ayrıntılı bir yöntemdir.
  3. Karaciğer örnek buz hızla doku soğutmak için metal bir tabağa yerleştirin. Mümkün olduğunca çabuk işlemek ve doku soğuk metal plaka üzerinde tutun. En iyi şekilde, diseksiyon içinde 1 h kullanın.
  4. Eğri forseps kullanarak karaciğer örnek kaldırın ve buz gibi 1 x PBS ile 5 mL durulayın.
  5. Karaciğer Petri kabına (Ø 100 mm) için kaşık sonuna bir spatula kullanarak buza aktarın.
  6. Karaciğer örnek el ile tek-kenar bıçaklar kullanma mm kalın bölümlerine 0.5-1 kesti.
  7. Dikkatle doku bölümleri mikrocerrahi forseps kullanarak cam alt çanak aktarın.
  8. Dikkatli bir şekilde karaciğer bölümünde alt düzleştirmek için Forseps ile ayarlayın.
  9. 3-5 damla soğuk 1 x PBS ile dilimlenmiş karaciğer kapsar.
    Not: DAPI boyama bazı dokularda (örneğin, beyin)24ilgi bölge tanımlamak için önerilir. Kırmızı mt-Keima sinyal lysosome ile ortak yerelleştirme doğrulamak için kullanılan24lizozomal boya, dextran art arda sıralı mavi ve lysosensor, gibi olabilir.
  10. İki sıralı uyarilmalar24üzerinden confocal mikroskobu altında doku bölümleri görüntü. İki görüntüleme kanal ayarla: "yeşil" mt-Keima kanal (uyarma 458 nm, emisyon 570-695 nm aralığı) ve "kırmızı" mt-Keima (uyarma 561 nm, emisyon 570-695 nm aralığı). Deneysel koşullar arasında görüntüleme ayarlarını korumak. Daha verimli görüntüleme için iki hayvan hemen analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mitophagy insan hücrelerinde tespiti:

Burada sunulan yordamını kullanarak insan HeLa hücreleri mt-Keima plazmid ile transfected. Sağlıklı hücreleri gösterdi iyi organize edilmiş bir mitokondri ağ (GFP, 488 nm) ile mitophagy birkaç olaylar (RFP, 561 nm). Ancak, hücreleri mitokondriyal uncoupler FCCP ile ön işleme (3 h için 30 µM) derin bir artış mitophagy insidansı (şekil 1A) sergilenmektedir. Mitophagy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mitophagy doğru ölçüm teknik olarak talep ediyor. Burada, biz mitophagy her iki nitel algılama ve miktar mitophagy düzeylerinin en yaygın laboratuvar deneysel modeller için izin birkaç güçlü teknikleri sundu.

Yinelenebilir verisini almak için en az üç biyolojik tekrarlar deneysel bir tasarımla gereklidir. Tüm araştırmacılar deneme ve analiz dahil deney grubu kimliklere kör olmalı. Ayrıca, alanları görüntüleme rastgele resim alma sırasında seçilmelidir. Hücre kültürü ve C. elegans çalı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Bohr laboratuvar CRADA düzenlemeler ChromaDex ve GlaxoSmithKline ile vardır.

Teşekkürler

Biz doktor Atsushi Miyawaki ve Dr Richard J. Youle mt-Keima plazmid paylaştığınız için teşekkür ederiz ve mt-Keima Hela hücreleri entegre. Raghavendra A. Shamanna ve Dr Deborah L. Croteau el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu araştırma Intramural araştırma programı NIH (VAB) tarafından desteklenen, yaşlanma, hem de 2014-2015 Ulusal Enstitüsü ve 2016-2017 NIA Intra-laboratuvar (EFF, VAB) verin. EFF HELSE SOR-OST RHF tarafından desteklenen (Proje No: 2017056) ve Norveç Araştırma Konseyi (Proje No: 262175).

YAZAR KATKILARI:

EFF el yazması tasarlanmış ve taslak hazır; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH ve ED kağıdın farklı bölümlerini yazdı; NT, JP, HN ve VAB el yazması gözden geçirilmiş ve uzmanlık sağlanan.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
mt-Keima fareJackson Laboratuvarı
Lipofektamin 2000 DNA transfeksiyon reaktifiThermofisher#11668027
Opti-MEM ortamı (Gibco)Thermofisher#31985062serumsuz ortam
mtKemia plazmidi: pCHAC-mt-mKeimaaddgene#72342
COXII antikoru (fare)abcam#ab110258
LAMP2 antikoru (tavşan)NOVUS
568 nm dalga boyuna sahip keçi-anti-tavşan (RFP)Thermofisher#Z25306Alexa Fluor 568 boya
keçi-anti-fare, dalga boyu 488 nm yeşil floresan proteini (GFP)Thermofisher#Z25002Alexa Fluor 488 boyası
Invitrogenile altın antifadesini uzatır#P36931
6 oyuklu plakaSIGMA
Corning Costar		#CLS3516
4 oyuklu oda kaydırağıŞOFÖR, Nunc Lab-Tek#171080
Nunc F 96 kuyulu plakaThermofisher#152038
LC3B antikor tavşanıNOVUS#NB100-2220
DNA antikoruProgen Biotechnik#anti-DNA fare monoklonal, AC-30-10
DAPIThermofisher#D1306ile antifade montaj ortamı
GEHealthcare Life Sciences#IN Hücre analizörü 2200
Eclipse TE-2000e konfokal mikroskopNikon#TE-2000e
Kolokalizasyon yazılımıVolocity#Volocity 6.3alternatif Zeiss ZEN 2012 yazılımı
İÇİNDE Hücre Araştırmacı YazılımıGE Sağlık Yaşam Bilimleri#28408974
hücre kültürü ortamıThermofisher#DMEM– Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı
(10.000 U/mL)Thermofisher#15140122
Fetal Sığır SerumuSigma-Aldrich#12003C-1000ML
Hücre kültürü İnkübatörüThermofisher#Thermo Forma 3110 CO2 Su Ceketli İnkübatör
epifloresan mikroskobuZeissZeiss Axio Görüntüleyici Z2
kameraOlympusOlympus DP71
konfokal mikroskopZeissZeiss Axio Observer Z1
konfokal yazılımZeissZEN 2012
görüntü analiz yazılımıImage Jkolokalizasyon analizi, vb
https://imagej.nih.gov/ij/ istatistiksel analiz yazılımıGraphPad Software Inc., San Diego, ABDSolucan seçimi yapmak için GraphPad Prism yazılım paketi
malzemesiSurepure Chemetals# 4655Seçim 30 gauge %90 platin %10 iridyum telden yapılmıştır
IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]Tavernarakis Nektarios'aTransgenik hayvanları 20 derecede koruyun; C
IR: N2; Örn[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::RosellaTavernarakis Nektarios'a
pdct-1 DCT-1::GFPTavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed:: LGG-1Tavernarakis Nektarios
M9 tamponununhazırlanması
için ek verilere bakın
Cerrahi forsepsSTERIS Hayvan Sağlığı19 Parça Köpek Kısırlaştırma Paketi Ekonomi
Cerrahi makasSTERIS Hayvan Sağlığı19 Parça Köpek Kısırlaştırma Paketi Ekonomi
1x PBSThermofisher#AM962510x PBS'nin ddH2O çalkalayıcı kullanılarak 1x PBS'ye seyreltilmesi gerekir
Fisher Scientific#11-676-178Thermo Scientific MaxQ HP Masaüstü Orbital Küçük Açık Hava Platform Çalkalayıcı Paketi %
2 agaroz pedHazırlık
Vibroslice bıçaklarıDünya hassas aletleri#BLADES-2tek kenarlı bıçak
metal plakaMSC# 788039880.012 inç kalınlık x 6 inç genişlik x 12 inç uzunlukta, 430 Paslanmaz Çelik Sac
Triton X-100deterjan
Metil violojen diklorür hidratSigma-Aldrich# 856177
nematodlar için paraquat İnkübatörüAQUALYTICİnkübatörü; C
Diseksiyon stereomikroskobuOlympusSMZ645
Konfokal mikroskopZeissAxioObserver Z1Nematodlar için (aşama 2)
epifloresan mikroskobuZeissAxioImager Z2Nematodlar için (aşama 2)
UV çapraz bağlayıcıVilber LourmatBIO-LINK – BLX-E365UV ışık kaynağı; 356 nm
#CD107b ,DAPI DAPI IN Hücre analizörü (floresan okuyucu) Penisilin-Streptomisin malzeme araştırması malzeme sorgulamasıParaquat çözeltisine malzeme sorgulaması için ek verilere bakın M9-levamisol tamponunun hazırlanması Cam Mikroskobu Slaytları ve Lameller Fisher Scientific#B9992000 için ek verilere bakın 20 ° C'yi korumak için

Kaynaklar

  1. Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
  2. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
  3. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  6. Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
  7. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  8. Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
  9. Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
  10. Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
  11. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  12. Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16(2012).
  13. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  14. Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  15. Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
  16. Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
  17. Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
  18. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  19. Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397(2015).
  20. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293(2011).
  22. Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215(2017).
  23. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
  24. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  25. Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
  26. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mitofaji TespitiMitokondriyal Sa l kKonfokal MikroskopiMito Keima PlazmidiC Elegans Su larnsan HeLa H creleriFare Karaci er DokusuParaquat UygulamasFCCP Ayr t r cLAMP2 COXII Ko lokalizasyonu
Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.