Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için

8.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56325

⸱

12 Ekim 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

Bu makalede

Özet

Biz burada bir Fluorometrik boş hücre biyokimyasal tahlil HDL-lipid peroksidasyon belirlenmesi için tarif. Bu hızlı ve tekrarlanabilir tahlil anlayışımız HDL fonksiyonunu kullanabilirsiniz insan hastalık katkıda bulunabilir ve büyük ölçekli çalışmalarda HDL işlevini belirlemek için kullanılabilir.

Özet

Düşük yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL-C) kolesterolü aterosklerotik kardiyovasküler hastalık (CVD) en güçlü bağımsız negatif belirleyicileri bulunmaktadır. Yapısı ve fonksiyonu HDL-C yerine HDL daha doğru ateroskleroz tahmin. Ateroskleroz gibi inflamatuar Birleşik Devletleri, HDL fonksiyonu zarar HDL protein ve lipit kompozisyon değişiklikler oluşur. HDL işlevi genellikle deneyleri kolesterol sızma tahlil ama bu deneyleri gibi sayısız sakıncaları standardizasyon eksikliği var dayalı hücre tarafından belirlenir. Boş hücre deneyleri HDL işlevi hücre tabanlı deneyleri için kıyasla daha sağlam önlemler verebilir. HDL oksidasyon HDL işlevini bozar. HDL lipid peroksit taşımacılığında önemli bir rolü vardır ve yüksek miktarda lipid peroksitler anormal HDL fonksiyonuyla ilişkilidir. Lipid-sonda etkileşim ne zaman enzimatik olmayan floresan Spektrometre sonuçlarını yorumlama lipid oksidatif devlet ölçmek için deneyleri düşünülmelidir. Bu bize HDL disfonksiyon katkıda bulunan HDL lipid peroksit içeriği (HDLox) değerlendirmek için bir boş hücre biyokimyasal enzimatik yöntem geliştirmek için motive. Bu yöntem enzim horseradish peroksidaz (HRP) ve fluorochrome (kolesterol oksidaz) HDL-c mg başına lipid peroksit içeriği ölçmek Amplex kırmızı dayanır Burada bir iletişim kuralı fluorochrome reaktif kullanarak HDL-lipid peroksidasyon belirlenmesi describedfor. Tahlil değişkenlik deneysel koşullar sıkı Standartlar Kuruluşu tarafından azaltılabilir. Daha yüksek HDLox düşük HDL antioksidan işlevi ile ilişkili değerlerdir. Bu testin okuma doğrulanmış hücre tabanlı deneyleri, kalp-damar hastalıkları, sistemik inflamasyon, immün disfonksiyon ve ilişkili kardiyovasküler ve metabolik risk fenotipleri vekil önlemler çıktıları ile ilişkilidir. Bu teknik yaklaşım HDL işlevi insan hastalığında sistemik inflamasyon, oksidatif stres ve okside lipidler (ateroskleroz gibi) önemli bir rol olduğu değerlendirmek için sağlam bir yöntemdir.

Giriş

Aterosklerotik kardiyovasküler hastalık (CVD) ölüm dünya çapında1,2önde gelen nedenidir. Epidemiyolojik çalışmalar yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) kolesterol seviyesinin düşük genellikle ters ateroskleroz1,2gelişimi için risk ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Çeşitli çalışmalarda HDL1,2için bir atheroprotective rol desteklese de, hangi tarafından HDL başlama ve ilerleme ateroskleroz zayıflar karmaşık 3,4mekanizmadır. Bu nedenle, karmaşık yapısı ve fonksiyonu mutlak düzeyi yerine HDL ateroskleroz 5,6,7,8daha doğru tahmin sürülmüştür. Ateroskleroz gibi inflamatuar Birleşik Devletleri, HDL fonksiyonu zarar HDL protein ve lipit kompozisyon değişiklikler oluşur. Bunlar i) azaltmak onun kolesterol sızma potansiyel 9, II) azaltın anti-enflamatuar ve artış pro-inflamatuar proteinler HDL ilişkili 6,7, III) azalma antioksidan faktör düzeyleri ve etkinlik ve HDL Düşük yoğunluklu Lipoprotein (LDLox)10 ve IV oksidasyonu inhibe yeteneği) lipid hydroperoxide içerik ve Redoks etkinliği (HDLox)9,11artırın. HDL pleotropic işlevleri (örneğin, kolesterol sızma, antioksidan işlevi) çizimle sağlam deneyleri HDL-HDL-C klinikte belirlenmesi tamamlayıcı.

HDL işlevi genellikle kolesterol sızma tahlil8,12,13,14gibi hücre tabanlı yöntemler tarafından değerlendirilir. Bu yöntemi kullanılan hücre türleri, okuma rapor türünü, standardizasyon eksikliği ve trigliserit 7,15karıştırıcı etkileri açısından önemli heterojenite dahil olmak üzere önemli sınırlamaları vardır. Bu sakıncaları zorluklar büyük klinik çalışmalar16için poz. Boş hücre deneyleri HDL işlevi hücre tabanlı deneyleri için kıyasla daha sağlam önlemler verebilir. Kolesterol sızma HDL en önemli işlevlerinden biridir ama hücre tabanlı deneyleri tarafından yalnızca belirlenebilir. Proteomik17,18,19,20,21,22,23gibi HDL işlevini belirlemek için diğer yaklaşımlar 24 ve hücre tabanlı monosit kemotaksisi deneyleri HDL işlevi 17,22,25 değil standardize ve büyük ölçekli insan çalışmalarda kullanılamaz.

HDL önemli antioksidan atheroprotective etkisi5,6,7,8vardır. Antioksidan işlevi HDL, LDL huzurunda önceki hücre ücretsiz Fluorometrik deneyleri 26yılında belirlenmiştir. Biyokimyasal Fluorometrik yöntemlerin HDL antioksidan işlevi başlangıçta Mohamad Navab ve Alan Fogelman ve onların iş arkadaşları26tarafından geliştirilmiştir. Her ne kadar birçok insan çalışmaları-si olmak kullanılmış bu yöntemler HDL işlevi 17,18,19,20,21,22,23 belirlemek için ,24, lipid (HDL)-lipid (LDL) ve lipid fluorochrome etkileşimleri bu hücre ücretsiz enzimatik olmayan biyokimyasal deneyleri HDL işlevi27,28tekrarlanabilirlik sınırlamak.

Son faiz lipidler ve HDL 27,29,30içinde protein oksidasyon sonucu HDL oksidasyon fonksiyonel sonuçları üzerinde odaklanmıştır. Önceki çalışmalar göstermiştir bu oksidasyonunu HDL HDL işlevi 27,29,30bozar. HDL lipid peroksit taşımacılığında önemli bir rolü vardır ve yüksek miktarda lipid peroksitler anormal HDL fonksiyonuyla ilişkilidir. Böylece HDL lipid peroksit içeriği HDL işlevi 9,17,20,31 belirlemek için kullanılan ve HDL işlev7önceki deneyleri bilinen sınırlamaları verilen, 15,27,32, HDL lipid peroksit içeriği (HDLox) 32quantifies alternatif bir Fluorometrik yöntem geliştirdik. Bu yöntem enzim horseradish peroksidaz (HRP) ve fluorochrome (kolesterol oksidaz) HDL-C 32mg başına lipid peroksit içeriği ölçmek Amplex kırmızı temel alır. Tahlil biyokimyasal prensibi şekil 1' de gösterilen. Biz bu floresan dayalı yaklaşım önceki HDL işlevi deneyleri27,28sınırlamaları yok göstermiştir. Bu tahlil edilmiş daha rafine ve böylece büyük ölçüde insan çalışmaları bile cryopreserved plazma 32,33,34, , güvenilir bir şekilde kullanılabilir bizim laboratuarda standart 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. bu tahlil okuma doğrulanmış hücre tabanlı deneyleri, kalp-damar hastalıkları, sistemik inflamasyon, immün disfonksiyon ve ilişkili kardiyovasküler ve metabolik risk fenotipleri vekil önlemler çıktıları ile ilişkilidir 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. burada, HDL lipid peroksit içeriği (HDLox) ölçmek için bu basit ama güçlü yöntemi açıklanmaktadır. Bu tahlil bir aracı insan hastalığında HDL işlevinin rolü ile ilgili önemli araştırma soruları cevaplamak için sistemik inflamasyon, oksidatif stres ve okside lipidler (ateroskleroz gibi) önemli rol32olduğu kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

tüm deneylerin insan biyolojik numuneleri kullanılarak etik onayıyla California Los Angeles, Los Angeles ve Alfred hastane insan Etik Komitesi, Melbourne Üniversitesi'nden gerçekleştirilmiştir.

Not: fluorochrome HDL işlevi tahlil (bkz: tartışma) 32 birçok varyasyonu vardır. Aşağıda en tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar verir Protokolü anlatacağız. Genel testin Şekil 2 ' deki.

1. numune işleme

  1. Kullanım taze, Sigara hemolyzed serum (serum ayırıcı tüplerde toplanan olabilir) veya sitrat plazma elde edilen 12-14 saat sonra oruç. Bu protokol için açıklandığı gibi uygun denetim cryopreserved örnekleri kullanıyorsanız, dahil.

2. Tahlil için gün 0-hazırlık

  1. hazırlama çalışma düzenini uygun denetimleri ile deneme örnekleri ve çoğaltır. Her örnek en az triplicates içinde çalıştırın. Bir temsilcisi 96 iyi düzen şekil 3 ' te gösterilen.
  2. Örnekleri ve çoğaltır sayısına göre tahlil için kullanılan reaktifler tüm birimleri hesaplamak.
    Not: her çalışma hisse senedi yeterli hacim belirli deneme için her reaktif için olduğundan emin olmak için ek bir % 10 birim içerir.
  3. Etiket HDL, HDL-C (isteğe bağlı) ölçümü ve fluorochromeassay ayrılması için testin tüm farklı adımlar için gerekli tüm tüpler.

3. Gün 1-hazırlık denetimleri

  1. çalışma özel havuza alınan denetim hazırlanması
    1. oluşturma bir denetimi örneğini havuza alınan plazma veya serum tüm çalışma örnekleri. 20 örnekleri her plaka nüsha olarak çalışıyorsa, her örnek üzerinden 10 µL 200 µL havuza alınmış denetime birleştirin. Bu denetimin HDL-C değeri belirlemek için klinik laboratuvar için havuza alınan bu denetimin ayrı bir aliquot verin.
      Not: Bu havuza alınan denetim tahlil standartlaştırmak ve olası tüm bilinen için hesap için kullanın (örneğin plazma, donma-çözülme çevrimleri, dondurma karşı bir matris serum yazın) ve deneysel değişkenlik etkileyebilir bilinmeyen kaynaklanan 27 , 28.
  2. Özel kalite kontrol (QCs) hazırlanması
    1. her laboratuvar (örneğin 5 mL plazma 10 sağlıklı bağışçılardan de gelen izole HDL) HDL büyük bir hazır hazırlamak ve bu birkaç aliquots cryopreserve hisse senedi donma-çözülme döngüsü en aza indirmek için.
    2. Kullanımı en az 10 farklı HDLox ortalama değerini belirlemek için bu stoktan çoğaltır. Ölçülen HDLox kabul edilebilir bir aralık değerleri için her QC örnek her tahlil dahil içinde < bu ortalama değer of varyasyon katsayısı % 15.
    3. Vermek ayrı bir aliquot havuza alınan bu denetimin bu denetimin (örneğin 40 mg/dL) HDL-C değeri belirlemek için klinik laboratuvar.
      Not: Daha detaylı bir yaklaşım kan kan bankalardan bu denetimleri oluşturmak için nasıl kullanılacağı açıklanan 27 , 28 , 32 olmuştur. Gerektiğinde ek QCs kullanın (örneğin bir sağlıklı bir donörden normal HDL işlevi ve bir büyük ölçüde anormal HDL iþlevi için bilinen bir donörden bilinmektedir.
  3. En iyi duruma getirme arka plan sinyal ve boş değerleri (isteğe bağlı)
    1. arka plan en aza indirmek için kurulan H 2 O hızla kaldırmak için kuluçka ortamda katalaz (1-4 U/mL) uygun miktarda ekleyin 2 nedeniyle kendiliğinden hava oksidasyon arabelleklerinin.
      Not: değerleri boş kuyulardan (HDL) HDL örnekleri değerleri çıkarılan ve sonuçları olmak beri (yani aynı 96 iyi plaka dahil) bir havuza alınan denetimi göre rapor bu adımı değil pratikte affec mu bulduk t sonuçları. Böylece, katalaz ile arka plan sinyal duruma getirilmesi, gerekirse atlanabilir.

4. Gün 1-ayrılık HDL kolesterol HDL yağış kullanarak

Not: bir ticari olarak mevcut standart HDL kolesterol Hizlandirici reaktif tükenmiş apoB serum üreticiye göre ayırmak için kullanın ' s talimatları. Bu reaktifler Renkölçer deneyleri HDL kolesterol düzeylerini belirlemek için yaygın olarak kullanılan.

  1. Plazma veya serum örneği kullanmak taze (veya çözülme).
  2. Karışımı eşit miktarda (örneğin 80 µL) plazma ve HDL kolesterol reaktifi (% 20 w/v polietilen glikol glisin tampon pH 10.0 (25 ° C)) presipite.
  3. Mix de tarafından yukarı ve aşağı pipetting.
  4. , Santrifüj kapasitesi 1000-2000 g 10 dakika süreyle x
  5. Süpernatant (HDL kesir) Aspire edin.
  6. İdeal hemen izole HDL HDL lipid peroksidasyon fluorochromeassay için kullanın. Ancak, aynı gün içinde çeşitli örnekleri çalıştırmak ve HDL-kolesterol konsantrasyonu ölçümü yapılır Ayrıca gibi diğer adımları, sonra 4 ° C'de izole HDL kapaklarý takýlý bu ertesi gün fluorochromeHDL işlevi tahlil için.

5. Gün 1-HDL-C izole HDL tayini

Not: HDL-C klinik laboratuvar değerini HDLox normale HDL-C miktar kadar kullanılırsa, isteğe bağlıdır.

  1. Miktarını HDL-kolesterol plazma üzerinden, standart Renkölçer kullanarak 27 deneyleri. Kolesterol reaktif 50 µL her kuyuya ekleyin ve kolorimetrik plaka okuyucu ve bir kolesterol standart her Seti'nde sağlanan kullanarak kolesterol konsantrasyonu belirlemek.

6. Gün 2-reaktifler hazırlanması

  1. HRP 5 U/mL solüsyon (aralığı 1-10 U/mL) hazırlamak HRP ve kolesterol çözümler.
  2. 20 mM fluorochrome (örneğin, Amplex kırmızı) çözümleri hazırlamak: bir şişe fluorochrome reaktif ve DMSO için oda sıcaklığında erimek. Kullanılmadan önce fluorochrome reaktifi (1 mg) DMSO 200 µL geçiyoruz. Saklamak hisse senedi çözüm dondurulup ≤-20 ° C, ışıktan korunan.
  3. Pozitif ve negatif kontrolleri hazırlayın: Kullanım 1 X ' reaksiyon arabellek ' kolesterol ve 20 mM H 2 O 2 çalışma çözüm negatif ve pozitif kontrol sırasıyla.

7. Gün 2-Fluorochrome tahlil

  1. Ekle 50 µL tepki arabellek boş (negatif kontrol) olarak x 1.
  2. İsteğe bağlı: olumlu denetim her plaka olarak 20 mM çalışma çözüm H 2 O 2 ekleyin.
  3. Deneysel değişkenlik en aza indirmek ve reaktifler ve örnekleri bu ek sağlamak için sürekli olarak yapılır ve zamanında, bir ayrı 96 de yuvarlak-alt, açık, polistren veya polipropilen plaka (plaka 1) örneklerinin tüm eklemeler gerçekleştirmek. Belirli birimlerdeki 3 96-şey kalıplara aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın (2-4 tabaklar: Polipropilen, düz botTom, siyah) (Bu aynı düzene sahip) ( Şekil 2, şekil 3).
    1. Örneğin, önce izole HDL 160 µL plaka 1 her şey/örnek ekleyin ve sonra çok kanallı pipet kullanımı ile HDL-kolesterol 50 µL 96-şey siyah kalıplara her şey/örnek aktarmak. Değiştirmek ipuçları arasında her satır/sütun ve filtre edilmemiş su ipuçlarını tüm transferler için kullanın.
  4. Bırakın örnekleri wells. Atmayın. Reaktifler eklenmesi arasında hiçbir yıkama adım vardır.
  5. Ekle 50 µL HRP çözüm 5 U/mL (0.25 U) her şey.
    Not: Kullanım fluorochrome reaktif eklenmesi önce HRP.
  6. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Örnekleri kuluçka (reaktifler eklemeler arasında hiçbir yıkama adımları) sonra atmayın.
  7. Fluorochromereagent 300 son bir konsantrasyon için Ekle 50 µL µM. Bu noktada, toplam reaksiyon birimdir 150 µL. iyice karıştırın ve ışıktan korumak.
  8. Değerlendirmek (karanlıkta) floresan okuma her dakika 120 dk bir floresan plaka okuyucu (530/590 nm filtreleri) ile 37 ° C'de.
    Not: daha kısa bir 60 dakika aralığı ile taze örnekler kullanın. O 120 dakikalık tahlil cryopreserved örnekleri kullanımı ile daha fazla tekrarlanabilir veri verir bulduk.
  9. Kaydetmek uygun yazılımı kullanarak veri.

8. Gün 3-veri analizi

  1. fluorochrome reaktif ilavesi sonra 120 dakika boş wells de dahil olmak üzere tüm örnekleri için kayıt Floresans birimleri (rasgele adet) ve tüm denetimleri.
  2. Floresan birimleri ortalama değerini hesaplamak (temel alan en az triplicates) (HDL ox_sample). Aykırı kabul ediyor (> 2 ortalama değer üzerinden SDs) içine dikkat.
  3. Aşağıdaki denklemi kullanarak arka plan Floresans çıkarma:
    figure-protocol-1
  4. normalleştirme HDL kolesterol miktarı (HDL-C) için: HDL-C tarafından HDLox lipid peroksidasyon değeri (havuzda çalıştırılır denetimi dahil) her örnek için Normalize) (mg/dl). Sonuçları bölümü HDL öküz n HDL-c Duzeltme yansıtacak şekilde (HDL-C) HDLox ölçü olarak sunulur Aşağıdaki denklemi kullanın:
    figure-protocol-2
  5. HDLox lipid peroksidasyon değeri her örnek havuza alınan bir denetimin değerini karşı ifade standartlaştırmak. (HDL-C) HDLox lipid peroksidasyon değeri (HDL-C için ayarlanabilir) her örnek için n n (HDL-C) HDLox lipid peroksidasyon havuza alınan denetiminin değerini normalleştirmek. Sonuçları bölümü HDL öküz deneysel değişkenliği ve HDL-c Duzeltme yansıtacak şekilde nHDL öküz ölçü olarak sunulur Aşağıdaki denklemi kullanın:
    figure-protocol-3
    Not: Bu yaklaşım diğer kurulan deneysel yaklaşımlar gibi deneysel ölçümler değişkenliği azaltmak için benzer Uluslararası oranı (INR) 44 , 45 normalleştirilmiş. Bu yaklaşım klinik çalışmalar 32 , 33 , 34 , 35 , 36 yılında doğrulandı , 37 , 38 , 39.
  6. kalite kontrol deneysel sonuçların standart kalite kontrol örnekleri kullanarak gerçekleştirmek. Her laboratuar kendi kalite denetimleri (QCs) oluşturmanız gerekir. İdeal olarak bir QC bilinen işlevsiz HDL ile bir örnekten nHDLox için ve bir QC için sağlıklı donör [örneğin kullanım havuza alınan örnekten kurulan kan Bankası bağışçılar ve hiçbir bilinen ektanı ve risk faktörleri için genç yetişkin bir örnekten nHDLox olduğunu Kardiyovasküler hastalık] yasaktır dahil olmak üzere. İkinci denetim sonuçları farklı laboratuvarlar arasında standartlaştıran. Ortalama bu QCs kurulan bağlı olarak en az 5 çoğaltır (genellikle 10 çoğaltır bu önemli adım için kullandığımız) değerleridir.
    1. Onay her tahlil ölçülen QCs olup olmadığını değerleri değer beklenen Aralık içinde. Bir kabul edilebilir en fazla deneysel değişkenliğin % 15 varsayarsak, deneysel ölçülen değerlerin kurulan QC bilinen ortalama değerlerden % 15'lik düşmek gerekir. Aşağıdaki denklemler kullanın:
      figure-protocol-4
      figure-protocol-5
      Not: ya dahil kalite kontrol örnekleri Eğer () normal işlevsiz HDL karşı) HDLox değerleri (her laboratuvar kurulu) beklenen aralığın dışında verir sonra denemeyi tekrarlamak.
  7. Kalite kontrol deneysel sonuçlar deneysel değişkenlik ölçmek için (CV) varyasyon katsayısı kullanarak gerçekleştirmek: MF % ile tüm örneklerini tekrar > % 15. Aşağıdaki denklemi kullanın:
    figure-protocol-6
    Not: bir tipik Intra-tahlil (içinde aynı plaka) ve (arasında farklı tabak) arası tahlil deneysel değişkenlik < . 2) tipik bir 1-%7 ve CV % 3-10 arasında olduğunu tipik bir interassay içi-tahlil CV olduğunu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Her HDL örneğinin 50 µL adım 7,3 olduğu gibi her kuyuya eklenir. 50 µL HRP çözüm 5 U/mL (0.25 U) sonra adım 7.5 olduğu gibi her kuyuya ekledi. Örnekleri adım 7,6 olarak 37 ° C'de 30 dakika inkübe. Fluorochrome reaktif 50 µL sonra adım 7,7 (300 µM son konsantrasyonu) olduğu gibi her kuyuya eklenir. (Karanlıkta) floresan okuma sonra her dakika bir floresan plaka okuyucu (530/590 nm filtreleri) ile 37 ° C'de 120 dakika içinde değerlendirilir. Boş, havuza alınan denetim temsilcisi Floresans v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol HDL işlev ateroskleroz ve insan hastalık rolü ile ilgili önemli araştırma soruları cevaplamak için güçlü bir araç sunar. Tahlil HDL lipid peroksit içeriği HDL-C enzimatik amplifikasyon (HRP) kullanarak mg başına quantifies. Bu yaklaşım kullanılan hücre türleri, okuma rapor türünü, standardizasyon eksikliği ve karıştırıcı etkileri açısından önemli heterojenite dahil olmak üzere önceki HDL işlevi deneyleri (örneğin kolesterol sızma tahlil) bilinen sınırlamaları önler trigliserid7...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Bu iletişim kuralı ve tahlil patent PCT/US2015/018147 için uygundur.

Teşekkürler

Yazarlar minnetle Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman ve Srinivasa Reddy iş geliştirme, önceki yineleme bu modelin içindeki anahtar rolü için kabul. T.A.A. bir RMIT Üniversitesi-Şansölye Yardımcısı'nın doktora sonrası bursu tarafından desteklenir. AJ ve AA NHMRC proje desteği 1108792 tarafından desteklenir. TK tarafından desteklenmektedir NIH NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124 verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Deneysel Reaktifler
HDL PEG (Polietilen Glikol) Çökeltici ReaktifPointe ScientificH7511
Amplex Red reaktifi.Yaşam Teknolojileri, Grand Island, NYA12216Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti.
&boğa; ≤ – 20&derece; C ve boğa; Kurutma
&boğa; Işıktan
koruyun DMSO.Yaşam Teknolojileri, Grand Island, NYA12216Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti.
&boğa; ≤ – 20&derece; C ve boğa; Kurutma
&boğa; Işıktan koruyun
At Turpu Peroksidaz (HRP)Life Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti.
& boğa; ≤ – 20&derece; C ve boğa; Kurutma
&boğa; Hafif
Kolesterol Esterazdan koruyunuz.Yaşam Teknolojileri, Grand Island, NYA12216Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti.
&boğa; ≤ – 20&derece; C ve boğa; Kurutma
&boğa; Işıktan koruyun
Kolesterol Referans standardıLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti.
&boğa; ≤ – 20&derece; C ve boğa; Kurutma
&boğa; Işıktan koruyun
Resorufin floresan Referans standardıLife Technologies, Grand Island, NYA12216Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti.
&boğa; ≤ – 20&derece; C ve boğa; Kurutma
&boğa; Işıktan koruyun
5x Reaksiyon Tamponu.Yaşam Teknolojileri, Grand Island, NYA12216Amplex Kırmızı Kolesterol Test Kiti.
&boğa; ≤ – 20&derece; C ve boğa; Kurutma
&boğa; Işıktan koruyun
HDL Kolesterol Otomatik ReaktifThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, ABD.TR39601
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Plasticware
96 oyuklu plakalar (polipropilen, düz dipli, şeffaf).Sigma AldrichM0687
96 oyuklu plakalar (polipropilen, düz tabanlı, siyah).Sigma AldrichM9936
1.5 mL Eppendorf tüpleriEppendorf0030 125.150
ClipTip 200, sterilThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, ABD.14-488-058
Thermo Scientific Çok Kanallı Pipetler, 8 kanallı, 125 ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, ABD.  14-387 - 955
< güçlü > İsim< / strong>Company< / strong>Katalog Numarası< / strong>Comments< / strong>
Software< / strong>
Gen5 2.01 yazılımBiotek, Vermont, ABDNA
strong>Name< / strong> ŞirketKatalog NumarasıComments
Equipment
Gen5 Plaka okuyucuBiotek, Vermont, ABDNA
<

Kaynaklar

  1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
  2. Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
  3. Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
  4. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  5. Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
  6. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
  7. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  8. Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  9. Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
  10. Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
  11. Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
  12. Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
  13. Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
  14. Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
  15. Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367(2016).
  16. Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
  17. Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
  18. Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
  19. Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
  20. Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
  21. Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
  22. Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
  23. Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
  24. Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
  25. Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
  26. Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
  27. Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
  28. Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87(2012).
  29. Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
  30. Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
  31. Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
  32. Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716(2014).
  33. Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23(2013).
  34. Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
  35. Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
  36. Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
  37. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
  38. Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
  39. Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
  40. Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
  41. Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
  42. Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
  43. Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
  44. von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342(1987).
  45. de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
  46. Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
  47. Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
  48. Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
  49. Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
  50. Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
  51. Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
  52. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
  53. Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
  54. Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
  55. Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
  56. Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
  57. Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
  58. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
  59. Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lipid Peroksidasyon AnaliziH cre D Biyokimyasal AnalizFlorometrik Enzimatik Y ntemHorseradish PeroksidazAmplex Red ReaktifiFloresan Plaka OkuyucuHDL Lipid Peroksit eri iHDL Fonksiyon l mHDL Oksidasyon Analizi
Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.