Fonksiyonel analiz bağırsak kök ve niş hücre Organoid sulandırma tahlil (ORA)

Özet

Bağırsak organoid kültürler tüm kriptalarının kurulur ve kendini yenileme ve farklılaşma analizi bir hücre özgü biçimde izin vermez. Bu iletişim kuralı sulandırma sıralanmış kök (Lgr5⁺) açıklar ve neden olmaktadır organoids için onların önceki biyokimyasal ve genetik modifikasyon ve fonksiyonel analiz etkinleştirilirken (Paneth) hücreleri niş.

Özet

Bağırsak epiteli tarafından son derece hızlı devir hızı ile karakterizedir. Memelilerde, 4-5 gün içinde tüm epitel astar yenilenir. Yetişkin bağırsak kök hücre Lieberkühn kriptalarının alt kısmında bulunan, Lgr5 gen ifade tarafından ayrılmış bulunmaktadır ve ile onların karakteristik yüksek proliferatif oranı¹homeostazı korumak. İnce bağırsak boyunca Lgr5⁺ kök hücre Paneth hücreleri denilen özel salgı hücreleri ile iç içe. Paneth hücreleri antibakteriyel bileşikler (Yani, lizozim ve cryptdins/defensins) salgılar ve bağırsak florasının denetleme rolünü uygulamayın. Son zamanlarda, yeni bir işlev Paneth hücreleri, yani kendi kapasitesi Wnt3, EGF ve Dll1²olarak birkaç anahtar ligandlar ile Lgr5⁺ kök hücreleri için niş destek sağlamak için keşfetti.

Ne zaman ex vivo izole ve belirli büyüme faktörleri ve hücre dışı matriks bileşenlerinin huzurunda kültürlü, tüm bağırsak kriptalarının için uzun ömürlü ortaya çıkmasına ve 3D yapılar kendini sürekli yenileyen denilen son derece crypt villus benzer organoids ³yetişkin ince bağırsak epitel mimarisi. Organoid kültürler, tüm kriptalarının kurulan zaman bireysel bileşenleri, yani Lgr5⁺ katkısı olsa adresleme olmadan kendini yenileme, çalışma ve bağırsak kök hücre niş farklılaşma izin ve Paneth hücreleri.

Burada, biz Paneth yeteneği yararlanır organoid tahlil için yeni bir yaklaşım tarif ve Lgr5⁺ hücreleri ilişkilendirmek ve organoids oluşturmak için zaman ortak kültürlü. Burada "organoid sulandırma tahlil" olarak adlandırılan bu yaklaşım (ORA), Paneth genetik ve biyokimyasal modifikasyonu sağlar veya Lgr5⁺ organoids sulandırma tarafından takip, kök hücre. Bu nedenle, iki ana bileşen bağırsak kök hücre niş fonksiyonel analiz sağlar.

Giriş

Bağırsak epitel memeli vücuttaki en hızlı kendini yenileyerek doku ve, bu nedenle, nesne kimliği ve Türbenin alt kısmında bulunan yetişkin kök hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu yönelik çalışmalar bir bolluk olmuştur Lieberkühn, ifade Lgr5 gen tarafından ayrılmış ve kurallı Wnt sinyal¹bağımlı. Özellikle Lgr5⁺ kök hücre çevrili ve özel niş hücreleri, Yani da kendi olgunlaşma²için Wnt sinyal üzerinde bağlıdır Paneth hücreleri tarafından desteklenen. Birlikte, bu iki hücre tipleri öz-yenileme bağırsak epitel astar altında yatan ve günlük homeostatik denge korumak: Lgr5⁺ kök hücre hızla Böl ve yaratıcı için ortaya çıkmasına ve daha fazla bağırsak İhtisas epitel hücreleri; Paneth hücreleri sağlamak temel niş faktörler (örneğin, Dll1, Wnt3, EGF) için Lgr5⁺ kök hücreleri². Kapasite organize ve kendini yenileyerek yapıları oluşturmak için kaplama ex vivo organoids veya "mini-cesaret", çağrıldığında bağırsak kriptalarının kendini yenileme gibi süreçleri içgörü sağlamak için deneysel bir araç olarak kullanan ve farklılaşma kanser⁴de dahil olmak üzere normal ve patolojik koşullarda. Organoid kültürlerden gelen çeşitli dokular, bağırsak, pankreas, karaciğer ve böbrek, fare ve insan örnekleri⁴de dahil olmak üzere kurulmuştur. Çıkarma yöntemi ve bu organoid kültürler geliştirmek için istihdam büyüme faktörleri doku özgü ve çoklu soy farklılaşma sürücü ve mümkün olduğunca özgün kök hücre niş taklit etmek için tasarlanmış içinde vivo. Organoids genetik hastalıklar tedavi, kanser tedavi edici etkinliği, ilaç toksisitesi analizi veya organogenesis vitro⁵çalışmanın değerlendirilmesi de dahil olmak üzere potansiyel uygulamalar olabilir.

Genel olarak, doku örnekleri kuruldu organoid kültürlerin ana sınırlama hücre-özgüllük olmaması. Örneğin, tüm bağırsak kriptalarının kurulan bağırsak organoids içinde doku kaynağı kapsıyordu hücresel bileşenleri tek tek analiz izin verme (örneğin, tüm kriptalarının içeren Lgr5⁺, Paneth, ve progenitör hücre).

Burada, ORA anılacaktır ve bağırsak organoid kültürler avantajlarını en temel bileşenleri, yani kök (Lgr5⁺) ve niş (Paneth) hücrelerin fonksiyonel analiz ile birleştiren yeni bir yöntem, açıklayın. Bu Paneth benzersiz yeteneği elde edilir ve fiziksel olarak ortak inkübe ve organoids^2,6,10' a ortaya çıkmasına birbirleri ile ilişkilendirmek için Lgr5⁺ hücreleri. Biz bu özelliğin avantajlarından aldı ve iki hücre türleri tek tek izin vermeden önce onları organoids reconstitute önceden tedavi. Bunu yaparken, her hücre bileşeni herhangi bir verilen ilaç, büyüme faktörü, biyokimyasal inhibitörü, genetik modifikasyon veya önce sulandırma ve organoid oluşumu kimyasal işleme maruz kalabilirler. Bu nedenle, ORA tahlil kullanarak bir özel uyuşturucu tedavi veya genetik değişiklik kök hücre veya onların niş karşılığı belirli bir etkiye sahip olup olmadığını belirler belirlenmesi sağlayacaktır.

Protokol

Tüm yordamları yerel hayvan refah kanun ve kurallara göre yapıldı.

1. hazırlanması aletleri, kültür medya ve yemekleri

1. Otoklav 1 dizi bağırsak makas, normal makas ve forseps steril bir kap içinde.
2. Bir kuluçka 37 ° C'de bir 96-iyi (düz dipli) tabak yerleştirin
3. 10 mL tam kültür ortamının malzemeleri tabloda listelenen reaktifleri ile hazır olun.
4. Bir su banyosu içinde 37 ° C'de tam orta kuluçkaya.
5. Tezcan bir buz kovası yerleştirerek membran Claudia adıyla yeniden düzenlendi. Sulandırılan membran 4 ° C'de sıvı hale gelir.
6. 4 Petri yemekler soğuk fosfat tamponlu tuz veya kısaltılmış PBS (4 ° C) doldurun.

2. izolasyon küçük bağırsak kriptalarının

1. CO₂ inhalasyon tarafından Lgr5- eGFP-DDE'ler-CreER^t2 fare C57BL6/J arka plan üzerinde kurban. Karın zarını boyuna makas çifti ile incelemek.
2. Mide Forseps ile tutun ve transversally ikiye kesilmiş.
3. Şu andan itibaren bağırsak makas kullanırken, bağırsak çekin ve PBS içeren bir kabında yerleştirin.
   Not: Bağırsak makas keskin bir ve künt bir ipucu var. Bu makas künt ucu crypt-villus mimari bağırsak açılırken zarar vermemesi gerekiyordu.
4. Künt ipucu mide yerleştirerek başlayın ve yavaşça mide itin. Makas ile kesme ve Forseps ile çekerek devam edin.
5. Bir kez tüm ince bağırsak boyuna açıldı, soğuk PBS Forseps ile tutarak yıkayın ve yavaşça U şeklindeki hareketleri ile PBS çözümde durulayın.
6. Bir kez tüm dışkı artıkları temizlenir, bağırsak luminal tarafı yukarı bir kesme tahtası üzerinde dümdüz devam edin. Kan damarları yokluğu ve dış kısmı ile karşılaştırıldığında soluk görünümü tarafından kolayca tanınabilir luminal takımıdır.
7. Bir cam slayt ile düzleştirilmiş bağırsak kazıma villus yavaşça çıkarın. İki kez dokunun tüm uzunluğu boyunca bu adımı gerçekleştirin.
8. Bağırsağın bir steril cerrahi bıçak ile 2-5 mm parçalar halinde kesin.
9. Küçük bağırsak parçaları buz soğuk PBS 10 mL içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirin.
10. Onları yukarı ve aşağı içinde PBS pipetting tarafından kalan herhangi bir yabancı maddelerin kaldırılması doku parçaları, temiz. Süpernatant atın ve PBS tamamen temizlenene kadar bu adımı yineleyin.
11. 15 mL soğuk PBS PBS son hacmi 25 mL getirmek için ekleyin. 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) eklemek ve bir silindir 4 ° C'de 45 dk için kuluçkaya
12. PBS/EDTA atmak.
13. PBS 10 mL ekleyin ve doku parçaları yukarı ve aşağı (en az üç kez) pipetting sert tarafından kriptalarının ayır. Süpernatant toplamak.
14. Adımı yineleyin 2,13 dört kez. Kültür son hacmi 50 mL ulaşmak için orta ekleyin.
15. Santrifüjü (5 min için 300 x g) tarafından hücreleri cips.
16. Pelet 10 mL kültür orta resuspend ve aralıklarla (3 dk 80 x g) tarafından kriptalarının cips.

3. tek hücre hazırlık

1. Süpernatant pelleted kriptalarının atın ve onları 1 mL tripsin benzeri-enzimler ile birlikte 50 µL resuspend Dnaz (50 µg/mL).
2. Bir su banyosu için 2 dk 32 ° C'de hücrelerde kuluçkaya.
3. Kültür orta 10 mL ekleyin. Kriptalarının sert yukarı ve aşağı en az 5 kez pipetting tarafından tek hücrelere ayırmak.
4. Çözüm (kümeleri ve diğer yabancı maddelerin ortadan kaldırmak için) 40 µm süzgeç aracılığıyla filtre ve 300 x g 5 min için de tek hücre.

4. Akış Sitometresi ve kaplama

1. 50 mL 1 x Hank tamponlu tuz solüsyonu veya HBSS/2% fetal inek serum (FCS) çözüm hazırlamak ve Pelet her 10⁶ hücreler için 1 ml resuspend
2. Hücre süspansiyon BV421 Lin^- (CD31, CD45, TER119), 1: 100 ve CD24 APC ve CD117-PE her iki konsantrasyon için 30 dk 1:250 antikorların bir konsantrasyon, ekleyin.
3. Sıralama Lgr5⁺ kök hücre ve ayrı düşük Paneth hücreleri bağlamak tüpler. İletişim kuralları için sıralama hakkında ayrıntılı bilgi için Lgr5⁺ ve Paneth hücreleri, lütfen bakın Roth vd. ⁷ ve Schewe vd. ⁶
   1. 300 x g 5 dakika süreyle de sıralanmış hücreleri 1.3 olduğu gibi açıklanan bileşenleri ile 100 µL orta hücrelerde Resuspend santrifüj ( Tablo reçetesigörmek).
4. Paneth hücreleri (örneğin, kimyasal ve genetik modifikasyonu ile) tedavi (n = 2000) veya Lgr5⁺ kök hücre (n = 2000).
   1. Hücreleri tedavi için toplam hacmi 100 µL kültür orta ve küçük müdahale RNA (siRNA) 100 bir konsantrasyon, lipozom aracılı transfection reaktif 5 µL kullanın nM. 37 ° C'de siRNA için veya seçilen değiştirilmesi için gerekli süre 30 dk için kuluçkaya.
5. 500 µL kültür orta iki kez hücrelerde yıkayın.
6. 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve 10 µL kültür orta hücrelerde resuspend.
7. İki hücresel bileşenleri havuz (Paneth veya Lgr5⁺ hücreleri) 20 µl Toplam hacim ve RT., 5 min için 300 x g, santrifüj
8. Paneth co kuluçkaya ve RT., 10 dk Lgr5⁺ hücreleri
9. 10 µL süpernatant, kaldırmak ve bir Menisküs sıvı emin olmak için hücre Pelet Aspire edin değil bırakın.
10. Toplam hacmi 40 µL için hücreleri Sulandırılan membran 30 µL eklemek, hücreleri resuspend ve Önceden ısıtılmış bir 96 iyi tabak içinde plakası. 10 dakika sonra tam orta 200 µL ekleyin ( Tablo reçetesigörmek). Değişim orta her 48 h.
11. Organoid çeşitlilik gün 5 say.

Sonuçlar

Organoid sulandırma tahlil küçük müdahale RNA Apc gen tarafından (siRNA) aşağıda gösterildiği bağırsak epitel temel niş ve kök hücre bileşenlerinin ayrı fonksiyonel analiz sağlar.

Bu amaca ulaşmak için ilk floresan aktif hücre (FACS) 8000 Lgr5⁺ hücreleri ve 6000 Paneth hücreleri doğuştan C57BL6/J fareler ayırmak için sıralama kullanılmıştır. Şekil 1a', bir akış ORA testi...

Tartışma

ORA iki temel bileşenleri bağırsak kök hücre niş, yani Lgr5⁺ ve Paneth hücreleri rafine fonksiyonel analiz sağlar. Bu yaklaşım daha önce bize ve diğerleri tarafından hafif değişiklikler^6,10,11ile istihdam edilmiştir. Burada, ORA yordamı bir tekrarlanabilir ve standart laboratuvar iletişim kuralı olarak mevcut. Ayrıca, biz Lgr5⁺ kök hücre, Apc downregülasyon etkileri genetik uygula...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gelişmiş DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Son konsantrasyon: 10 mM
Penisilin / streptomisin *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Son konsantrasyon:% 1
Hepes *	Thermo Fisher Scientific	15630080	Son konsantrasyon: 10 mM
Rekombinant murin EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Nihai konsantrasyon: 50 ng / ml
Rekombinant murin Noggin *	Peprotech	250-38	Nihai konsantrasyon: 100 ng / ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Nihai konsantrasyon: 10 & mikro; M
Pürüzlü-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Nihai konsantrasyon: 1 & mikro; M
Rekombinant murin R-spondin *	R& D sistemleri	3474-RS-050	Nihai konsantrasyon: 1 mg / ml
Flexitube Gen çözeltisi siRNA APC	Qiagen	GS11789	Nihai konsantrasyon: 100 nM
Lipofektamin 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1 (cre / ERT2) CLE / J	Jackson Laboratuvarları	008875
Düşük bağlayıcı tüpler	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* Bu reaktiflerin kombinasyonu tam kültür ortamını

102424 oluşturur