Hipotalamik insülin sinyal fare beyin içine sürekli uyuşturucu infüzyon sistemi ile periferik glikoz intoleransı için eğitim

İnsülin doku beyin de dahil olmak üzere çok çeşitli etkiler. İnsülin kan - beyin bariyerini geçer, merkezi sinir sistemi (MSS) girer ve insülin reseptör (IR) ile hipotalamus gıda alımı, sempatik aktivite ve periferik insülin yanıt düzenleyen bağlar. Periferik yağ dokularında kronik inflamasyon 2 diabetes mellitus (T2DM) yazmak için katkıda bulunmak için teklif edildi ama bu inflamatuar reaksiyonları insülin etkilemesi hipotalamus sistemik insülin yanıt ve glukoz intoleransı arabuluculuk sinyalleri belirsizdir. Bazı kemokinler iştah düzenlemesi ve vücut sıcaklık regülasyonu gibi tümör nekrozis faktör-alfa (TNFα), İnterlökin (Il) -6, IL-1β, hipotalamus¹ katılmak monosit chemoattractant protein-1 (MCP-1) ve CCL5 (C-C motifi ligand 5 ). Buna ek olarak, hipotalamus iltihabı insülin direnci T2DM^2,3yol açar.

Bu kemokinler, Kemokin CCL5 düzeyde ifade değişiklik ve onun reseptör arasında CCR5, içinde yağ doku T2DM damar sertliği ve glikoz intoleransı insanlar hem de hayvanlar ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. CCL5 aynı zamanda gıda alımı ve vücut sıcaklığı, düzenlenmesi hipotalamus dahil nöroendokrin işlevleri vardır. Böylece CCL5 hipotalamus veya periferik dokularda insülin sinyal harekete geçirmek katılan olup olmadığını araştırmak önemlidir.

İnsülin sinyal hücrelerde sıkı bir şekilde düzenlenir. İnsülin-insülin reseptörleri (IR) bağlama insülin reseptör substrat (IRS) proteinler, ardından phosphatidylinositol 3-kinaz (PI3K) ve protein kinaz B (PKB/AKT) etkinleştirme ve glukoz taşıyıcı-4 (GLUT4) membran translocation^{4 etkinleştirir} . IRS proteinlerdir bu sinyal yolu anahtar düzenleyiciler: onlar-si olmak yanıt pozitif olarak fosforile birden çok tirozin ve serin artıkları veya negatif insülin sinyalleri⁵. Örneğin, serin 302 fosforilasyon IRS-1 IRS-1 fiziksel ayrışma için IR yol ve insülin sinyal iletimi, insülin direnci⁶için önde gelen blok. IRS proteinler üzerindeki aktivite bozukluğu insülin direnci ve glikoz intoleransı fareler⁷neden olduğu gösterilmiştir.

Belirli bir gen işlevini incelemek için bir ortak organizmanın tüm vücutta dağıtılan hedef genlerin ifade manipülasyon yoludur. Ancak, bu çeşitli sakıncaları olabilir: 1) o zaman içinde farklı geribildirim Düzenleyici veya telafi edici etkileri üretebilir ve 2) bu yöntem bize belirli beyin bölgeleri hedef protein rolünü göstermek yardımcı olmuyor. Ayrıca, doku ve hücre özel gen nakavt hayvan üremek için uzun zaman alabilir ve yüksek maliyetlidir. Böylece, bir kısa vadeli beyin infüzyon ozmotik pompa sistemi - bahsedilen sorunların üstesinden gelmek için antagonist ilaç kullanarak beyin hedef protein sinyal ile müdahale için nispeten hızlı ve uygun bir yol kullanın. Stereotaksik enjeksiyonları karmaşık cerrahi beceri ve geniş yatırım araçları ve zaman gerektirir için kullanılır. Bu protokol için biz stereotaksik enjeksiyon ve kan glukoz konsantrasyonu algılamak ve hipotalamik insülin yönetmelik sinyal CCL5 rolünde araştırmak için hızlı, daha az zararlı ve anlık yöntemi gerçekleştirmek için basit ve güvenli bir yöntem sağlar.

Not: Tüm iletişim kuralları ve yöntemleri hayvan bireylerde kullanılan kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komiteleri (IACUC), Taipei Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (protokol numaraları: LAC-2014-0387)

1. mikro-ozmotik pompa infüzyon sistemleri hazırlanması

Not: pompa, yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) arabellek ve uyuşturucu (Met-CCL5/RANTES protein çözüm (10 ng/mL aCSF)) steril koşullarda 0.2 µm filtreleriyle filtre arabellekleri kullanarak hazırlamak ve tüm prosedürleri ile Kültür örtünün altında kuralları eldiven. Cerrahi prosedürler aşağıdaki gibi yapılır:

1. Ameliyattan önce bir gün mikro ozmotik pompalar hazırlamak: beyin mikro ozmotik pompa yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile 1 mL şırınga ve kit ile birlikte sağlanan künt kafa iğne ile doldurun. ACSF içinde mikro ozmotik pompa bırakın ve bir shaker yerleştirin ve nazikçe gecede sallamak.
   Dikkat: Pompa aCSF ile doldurulmalıdır ve pompa (şekil 1A) içinde hava kabarcıkları kaçınılmalıdır.
2. Ameliyat başlamadan önce rekombinant Met-CCL5/RANTES protein çözüm (10 ng/mL, içinde seyreltilmiş aCSF) denemede kullanılmak üzere hazırlayın. ACSF pompası kaldırmak ve aşırı sızıntıları pompa ile uyuşturucu çözüm yavaş yavaş dolduramazsınız.
   Not: 15 mL aCSF veya Met-CCL5/RANTES çözüm 5-8 pompalar için yeterli olur.
   Dikkat: pompa tamamen baloncuklar içinde olmadan uyuşturucu dolu emin olmak için yordamı yineleyin.
3. Kateter tüpler istenilen boy kesme ve künt uçlu beyin infüzyon iğne beyin infüzyon seti ile ekleyebilirsiniz. İnfüzyon seti ve borular ile uyuşturucu doldurun.
4. Son olarak, montaj ve beyin infüzyon seti için mikro-ozmotik pompa iliştirin.
   Dikkat: Hava kabarcığı yok tüp veya pompa (şekil 1A) oluşmuş olmalıdır.
5. ACSF steril 50 mL tüp içinde pompa kurumasını önlemek için belirlenen tüm ozmotik pompa-beyinli füzyon bırakın. Ozmotik pompa-beyinli füzyon kümesi Şimdi ameliyat için kullanılmak üzere hazırdır.
   Not: Mikro-ozmotik pompa sistemleri uzun süreli ilaç infüzyonu için kullanılabilir. Bu ilaç dağıtım fare beyin içine güvenli ve kolay modu sağlar.

2. intraserebral ventrikül cerrahi-mikro ozmotik pompa implantasyonu

Dikkat: % 75 etanol ile cerrahi çevre Sterilize ve çalışmaya dahil insanlar steril eldiven ve temiz önlük giyiyorsun emin olun. Cerrahi alet / aletler autoclaved ve kurutulmuş kullanmadan önce ve daha sonra % 75 etanol arasında fareler ameliyatları ile sterilize edilmiş olması gerekir.

1. Fare tartmak ve intra Periton enjeksiyon (IP) ketamin/Xylazine ile kullanarak anestezi (ketamin 50 mg/kg, Xylazine 10 mg/kg).
   Dikkat: Fareler vücut ağırlıkları 24 g alt ozmotik pompa implantasyonu ameliyatı için tavsiye edilmez.
2. Dağ ve stereotaktik cihaz (şekil 1B) üzerine fare kafa düzeltmek.
3. Bir çift Cerrahi makas ve kerpeten kafatası kapsayan dış deri açık kesmek için kullanın. İyot periferik kafatası temizlemek için kullanın.
4. Derinin en dış tabakası subkutan deri boyun bölgesi yakınındaki künt kafa kerpeten ozmotik pompa-beyinli füzyon set implantasyon (şekil 1 c) için bir çift yardımı ile ayırın.
5. İnfüzyon noktası ile referans için stereotaktik cihaz kullanarak beyin Haritası (şekil 1 d) işaretleyin. Bu deneyde, iğne 3^rd ventrikül bölgede implante olması gerekiyor (Bregma: 0.0 mm lateral, 1.3 mm arka, 5.7 mm ventral).
6. Kafatasında (şekil 1E) işaretli alanı çevresinde bir çivi matkap kullanarak bir delik.
   Dikkat: fare meninkslerde ve kan damarları, böylece bozulma beyindeki mikro-kan damarlarının kaçınarak kırmak dikkatli olun.
7. ACSF (kontrol) olarak ya da ilaç (Met-CCL5/RANTES protein çözüm) beyin infüzyon iğne ilaç fare beyin ( demleyin delinmiş deliğe boyun bölgesi ve INSERT arkasındaki deri altında bulunduğu mikro ozmotik pompa-beyinli füzyon kümesi yerleştirin Rakam 1E). İğne meninkslerde nüfuz ve ventrikül almak. İğneyi yerinde yüzey desensitizing jel (şekil 1F) kullanarak kafatasında düzeltmek ve tutkal kurur kadar 1-2 dakika bekleyin. Daha sonra iğne (şekil 1G- H) üstünde çıkıntılı bölüm kesti.
8. Bir doku yapıştırıcı tutkal işleminin başında yara iyileşmesi için kullanın. Yaranın üstüne tutkal 50 µL uygulamak, her iki cilt birlikte çekin ve 30'dur (şekil 1I) imzalamaya cilt izin için s.
   Dikkat: %100 alkol takımını cerrahi ve 100 ul penisilin enfeksiyonu önlemek için streptomisin ile sonra yara temizlemek için kullanın. Not: Fare cilt skar dokusu oluştururlar ve cerrahi tutkal yönetimini takiben birkaç gün içinde iyileşir. Ana tutkal cilt tahriş veya iltihap neden olabilecek cerrahi dikiş kaçınma avantajdır.
9. Fareyi temiz bir kafeste tuttu sıcak bir tabağa yer (37 ° C'ye kadar ısıtılır) ve anestezik etkisi fare normale dönene kadar bekle.
   Dikkat: Bu ameliyattan sonra hayatta kalma şansını artırmak için fare vücut ısısını korumak için önemlidir.
10. Bir haftalık iyileşme süresi sonra farelerin Oral glikoz tolerans testi (OGTT) ve insülin tolerans testi (ITT) gibi daha fazla deneyler için hazır olacak.

3. oral glukoz tolerans testi (OGTT)

Not: oral glukoz tolerans testi 7 gün sonra aCSF ve ^MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 µL) infüzyonu gerçekleştirin. 6 h OGTT önce fareler ile yeterli su temini için hızlı korumak. Hayvanlar işlem sırasında stresi azaltmak için çevreye parkenizin böylece nerede deneyler yapılır aynı tezgah üzerinde tutun.

1. Glikoz eriyik Hazırlığı: deneme gerçekleştirmeden önce glikoz çözüm 3.75 g çözülerek 15 mL distile H₂o glikoz hazırlamak
2. Okumalar deneysel işlem sırasında (Tablo 1) kaydetmek için bir takvim kadar ayarla.
   Not: Saatleri arasında her kan sınav deneme sırasında kayıt doğru izin vermek için uygun aralıklarla ayarlamak önemlidir.
3. Oruç sonra her fare tartmak ve glikoz enjekte edilir uygun miktarını hesaplamak.

4. insülin tolerans testi (ITT)

Not: İnsülin tolerans testi ve oral glukoz tolerans testi en az 7 gün arayla hayvanlar üzerinde açlık etkisini azaltmak için zamanlanması gerekir. İnsülin tolerans testi için (ITT) insan insülin (0,75 U/Kg) IP sızdırma yoluyla yönetilen.

1. 0,25 U insülin çözüm hazırlanması: seyreltik 100U insan insülin 1: 400 tuzlu çözüm oranı.
2. Oruç sonra her fare tartmak ve buna göre insülin enjekte miktarı hesaplamak: IP için 0,25 U insülin hacmi (µL) enjekte = 3 X BW (0,75 U insülin/Kg vücut ağırlığı). Örneğin: 28,8 g ağırlığında bir fare için enjekte: 28,8 X 3 = 86,4 µL (0,25 seyreltilmiş U insülin) (Tablo 2).
   Dikkat: 6 farklı günlerde oruç h sonra farklı vücut ağırlıkları aynı hayvanlar olabilir. Böylece, önce ve sonra oruç ve OGTT ve ITT test kuralları vücut ağırlığı ölçmek gereklidir. Fare vücut ağırlığı tür, cinsiyet ve açlık süresi bağlı olarak bırakın. Daha yüksek dozlarda insülin, insülin şok neden olabilir ve hayvanın ölümüne yol açacak.
3. Okuma sırasında deneysel bir işlem kaydetmek için bir tablo (Tablo 2) ayarlayın. 3.4 adımları yineleyin. 3.8 için. Ölçüm kan şekeri düzeyleri için.

Denetim veya (CCL5 etkileri beyin engellemek için) CCL5 antagonisti MetCCL5 olarak her iki aCSF içeren ozmotik infüzyon pompa cerrahi takılan fareler üzerinde yapılmıştır. Ameliyat sonrası 7 ila 14 gün periferik glukoz ve insülin yanıt farelerin OGTT (7 gün sonra) ve ITT (14 gün sonra) iletişim kuralında belirtildiği gibi kullanarak analiz edildi. Oral glukoz tolerans testi (OGTT) ve insülin tolerans testi (ITT) farelerin oruç 6 saat sonra yapıldı. Fareler glikoz ile sözlü, onların anılan sıraya göre vücut ağırlıkları üzerinde temel alan tutarı ile yönetilen. Şekil 3' te gösterildiği gibi kan şekeri düzeyleri değişiklikleri kaydedildi. İnsülin duyarlılık testi fareler içine mayi (IP) insülin enjeksiyon tarafından gerçekleştirilmiş ve kan şekeri düzeyini Değiştir hemen ölçüldü. Şekil 4' te gösterildiği gibi kan şekeri düzeyleri insülin stimülasyon farklı infüzyon ilaçlarla farelerde üzerine değişiklikler kaydedildi. Kan glikoz düzeyi sadece biraz glikoz Yönetim (şekil 3B) ve insülin enjeksiyon (şekil 4B) farelerde aCSF infüzyon ile fareler karşılaştırıldığında CCL5 antagonisti (MetCCL5) infüzyon ile sonra düşürüldü. Bu sonuçlar ile MetCCL5 beyinde yönetilen insülin işlevini farelerde periferik glikoz metabolizması bozuklukları öneririz.

Daha sonra analiz ettik insülin sinyal aktivasyonu IRS-1 fosforilasyon ve Akt harekete geçirmek düzeyleri hipotalamik dokularda değerlendirerek. 302 üzerinde serin fosforilasyonu IRS-1'in upregulated antagonisti (MetCCL5) ile tedavi farelerde yapıldı (şekil 5B-C) ne zaman fare beslenen normalde. Kontrol grubunda aCSF fareler hipotalamus idare ve insülin meydan aşağı akım sinyal molekülü Akt (fosforile Akt serin 473) aktif (şekil 5 d, F) artan IRS-1 serine302 harekete geçirmek () olmadan Şekil 5 d -E) ve Akt serine473 fosforilasyon. Buna ek olarak, Akt sinyal MetCCL5 ile infüzyon farelerde artmış değil, ama bunun yerine IRS-1 serin 302 fosforilasyon bir artış oldu. Bu arada, fare beynindeki CCL5 sinyali engelliyor insülin aktivitesi hipotalamus ve zayıflatmak periferik insülin fonksiyon kesildi. Bizim genel bulgular, ITT, OGTT ve ex vivo insülin meydan, sonuçlarından gibi gelen CCL5 üzerindeki insülin sinyal harekete geçirmek ve periferik glikoz metabolizması insülin stimülasyon üzerine yaptığı katkının sonucuna vardı.

Şekil 1. Ozmotik pompa hazırlık ve implantasyon cerrahi prosedürde fare. Uyuşturucu Çözümle periosteum (A) beyin infüzyon seti ve pompa hazırlık. Kırmızı oklar, sıvı kristal ile kateter tüpler gösterir. (B) düzeltmesi ve mount stereotaktik cihaz üzerine fare kafa. (C) ayrı mikro ozmotik pompa-beyinli infüzyon seti implantasyonu için subkutan deri derinin en dış katmanı; Dash çizgiler ozmotik pompa implantlar konumunu gösterir. (D) oku infüzyon yan gösterir. (E) matkap kafatası üzerinde işaretli çevresinde bir delik. (F) yer ozmotik pompa-beyinli infüzyon fare arkasına ayarla ve beyin infüzyon iğne delinmiş deliğe (Daire içinde çizgi) ekleyin. (G) doku yapıştırıcı tutkal kullanarak kafatası üzerine iğne düzeltmek ve (H) gösterildiği gibi (sivri uçlu makas G) iğne üst ayır. (ben) mühür yara kullanarak doku yapıştırıcı tutkal. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. İlaç ozmotik pompa kullanarak ventrikül bölgede yönetilen zaman uyuşturucu Difüzyon alanında temsilcisi görüntüler. Evan'ın mavi ozmotik pompa uyuşturucu infüzyon illüstrasyon ventrikül bölgeye(a)ve (B) yan ve üçüncü ventrikül içine Difüzyon kullanılan temsilcisi ilaçtır. Ölçek çubuğu 0.5 cm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. Oral glukoz tolerans testi (OGTT) tarafından ölçülen ameliyattan sonra farelerin glikoz metabolizması. Kan şekeri düzeyleri dağılımı değiştirildi glikoz WT farelerde sözlü yönetim infüzyon aCSF(a)ve antagonisti, MCCL5 ile aşağıdaki (B). Ortalama ± SE. (şekil8değişiklik) olarak gösterilen veriler. * p < 0,05, iki yönlü ANOVA tarafından. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4. İnsülin fareler kan glikoz - insülin tolerans testi (ITT) işlevinde. Kan şekeri düzeyleri dağılımı değiştirildi insülin enjeksiyon aCSF(a)ile infüzyon WT farelerde takip ve antagonisti ile MCCL5 infüzyon (B). Ortalama ± SE (şekil8değişiklik) olarak sunulan veri. p < 0,001, iki yönlü ANOVA tarafından. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5. İnsülin sinyal etkinliğinde ameliyat sonrası fareler. (A)şeklinde inhibitör serin 302 fosforilasyon IRS-1 (insülin yanıt substrat-1, pIRS1S302) fareler hipotalamus dokularda Western Blot tedavi aCSF veya CCL5 antagonisti, MetCCL5 ile (MCCL5) infüzyon pompası. (B) fosfor-IRS-1S302 normal beslenme ile fareler hipotalamus infüzyon sonra ilgili düzeyde.(C) IRS-1 ve Akt etkinleştirme (fosfor-Akt S473, pAktS473) veya aCSF veya METCCL5 infüzyon sonra hipotalamik dokusunda insülin stimülasyon olmadan S302 fosforilasyon Western Blot. (D-E) PIRS-1S302, pS6KT421ve pAktS473göreli düzeyde. ("2" yapılan her çubuk grafik açılımı: n = 2 tüm quantifications için). (5D-E, boş barlarda yaptı: insülin; 5D-E, şeritler barlarda sağ: insülin ile). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1. Oral glikoz tolerans testi (OGTT) kayıt için takvim

Tablo 2. İnsülin tolerans testi (ITT) kayıt için takvim

Yazarlar ifşa gerek yok.