Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

6.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56411

⸱

9 Kasım 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Burada akut mekanik stimülasyon hücresel yanıt değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Mikroskopi tabanlı tahlil fluorescently etiketli biyosensörler kesme akışı ile kısa stimülasyon takip yerelleştirilmesini inceleyin. Ayrıca akut mekanik stimülasyon karşılık olarak ilgi çeşitli proteinlerin aktivasyonu biyokimyasal olarak test ediyoruz.

Özet

Kemotaksis, ya da bir chemoattractant kadar Degrade geçiş en iyi anlaşılmış, yönlendirilmiş geçiş modudur. Sosyal amip kullanarak çalışmalar ortaya Dictyostelium discoideum paralel yollar karmaşık sinyal iletim ağı chemoattractants cevaben güçlendirir ve önyargılı aktin polimerizasyon ve çıkıntı bir pseudopod yol açar degradenin yönünü. Buna ek olarak, diğer türleri, örneğin, yönlendirilmiş göç akışı veya elektrik alanları, yamultmak için maruz kalma nedeniyle sürüş moleküler mekanizmaları bilinmemektedir. Kemotaksis birçok düzenleyiciler, yerelleştirme ya da harekete geçirmek bir chemoattractant ile küresel stimülasyon sonrasında geçici değişiklikler gösterir yanı sıra, yerelleştirme önde gelen veya geçirme bir hücrenin ahşap kaplama kenarı sergilemek. Moleküler mekanizmalar yönlendirilmiş göç diğer türleri anlamak için hücresel yanıt-e doğru akış yamultmak için kısa (2-5 s) pozlama dayalı akut mekanik stimülasyon incelenmesi sağlayan bir yöntem geliştirdi. Bu uyarımı hücreleri tek hücre davranışı incelemek için biyosensörler fluorescently etiketli ifade görüntüleme sırasında bir kanal olarak teslim edilebilir. Ayrıca, hücre nüfus bir tabak, lysed ve immunoblotted ilgi proteinlerin etkin versiyonlar tanımak antikorları kullanarak teşvik. Her iki deneyleri birleştirerek, bir moleküller hücre altı Yerelleştirme ve/veya fosforilasyon değişikliklerden aktif geniş bir dizi inceleyebilirsiniz. Bu yöntemle akut mekanik stimülasyon kemotaktik sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağları aktivasyonu tetikler belirledi. Başlatan olaylar kesme akış kaynaklı hareketliliği için gerekli anlamak için önemli hücresel yanıt akut mekanik uyarılması için incelemek için yeteneğidir. Bu yaklaşım da kemotaktik sinyal iletim ağ chemoattractant reseptör karıştırıcı etkisi olmadan çalışmak için bir aracı sağlar.

Giriş

Geçiş ökaryotik hücre ortamında gradyanlar çözünür veya yüzey bağlı chemoattractants, değişken sertliği yüzeylerde, elektrik alanları veya yamultma akışı dahil olmak üzere çeşitli kimyasal ve fiziksel ipuçları tarafından önyargılı. Moleküler mekanizmalar kemotaksisi sürüş bizim anlamada birçok gelişmeler rağmen daha az yönlendirilmiş göç ve nasıl bu farklı sinyaller Birleşik bir üretmek için hücresel düzeyde entegre edilmiştir diğer türleri hakkında bilinen göçmen yanıt.

Geçiş doğru bir chemoattractant artan bir konsantrasyon içerir üç davranış bileşenleri Yönetmen: hareketliliği, yönlü algılama ve polarite1. Motilite pseudopod çıkıntı tarafından elde hücrelerin rastgele hareket anlamına gelir. Yönlü bir hücre bir chemoattractant kaynağını tespit yeteneği algılama, hangi hatta oluşabilir hücrelerin immobilize. Polarite hücre içi bileşenler arasında önde gelen ve artan sebat hareketine yol açan bir hücrenin, ahşap kaplama kenarı daha istikrarlı asimetrik dağılımı gösterir.

Bir chemoattractant hücresel yanıt dört kavramsal olarak tanımlanmış düzenleyici ağları faaliyete bağlıdır: reseptör / G protein, sinyal iletimi, aktin sitoiskeleti ve polarite1. G protein birleştiğinde reseptör Chemoattractant bağlama heterotrimeric G protein α ve βγ yönlü sinyali güçlendirir aşağı akım sinyal iletim ağ üzerinden sinyal iletir. Birden çok sinyal iletim ağı içinde paralel olarak hareket ve önyargı aktin polimerizasyon ve bunun sonucunda pseudopod çıkıntı, degradenin yönünü aktin sitoiskeleti ağa beslenir. Ras GTPazlar, TorC2, fosfoinositid 3-kinaz (PI3K), fosfataz ve tensin homolog (PTEN) ve guanylyl cyclase kemotaksisi önemli düzenleyiciler arasında vardır. Geri bildirim mekanizmaları sinyal iletim ağı içinde ve arasında sinyal iletimi ve aktin sitoiskeleti ağları daha fazla yanıt yükseltmek. Son olarak, kötü tanımlanmış polarite ağ giriş aktin sitoiskeleti alır ve daha fazla kalıcı degradenin yönünü geçişinde yaymak için sinyal iletim şebeke önyargıları.

Mekanik anlayışımızı kemotaksisi çoğunu fluorescently öğesini biyosensörler düzenleyici ağların çeşitli bileşenleri için gelişimi nedeniyle mümkün yapıldı. Birçok kemotaksisi düzenleyiciler asimetrik bir dağıtım düzenleyici molekül veya faaliyet var. Örneğin, tanımak biyosensörler harekete geçirmek yorum-in küçük GTPases Ras ve Rap1-Raf1 (RBD burada anılacaktır) Ras bağlayıcı etki ve RalGDS, sırasıyla-öncü bir chemotaxing hücre2,3yerelleştirilmesine. Benzer şekilde, PI3K ve onun ürün phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), pleckstrin homoloji (PH) etki alanı tarafından tanınan da göstermek yerelleştirme ön cep4,5. Buna ek olarak, bir 3-fosfataz PTEN hangi dönüştürür PIP3 geri phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate, hücre6ahşap kaplama kenarı yerelleştirir. Önemlisi, bu biyosensörler onların yerelleştirme yanıt küresel stimülasyon ile bir chemoattractant olarak değiştirin. Sitozolik ya da çıkıntılar resting hücredeki ipucu, kortikal Yerelleştirme ve bulunmadığına kenar işaretleri geri kalmış ise korteks için relocalize öncü işaretleri çıkıntılar resting hücrede ipuçları, sonra sitozolik haline uyarım. Biyoalgılayıcı dağıtım yanıt olarak bir chemoattractant ile küresel stimülasyon analizi katkı kez gözlemleri yıkmak hareketliliği ve polarite, en aza indirir. Bir chemoattractant ile bir hücre süspansiyon genel veya üniforma uyarılması da bir araç olarak protein harekete geçirmek, genellikle protein fosforilasyon7,8,9 tarafından algılanan nüfusu genelindeki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan . Mikroskopi düzenleyici ağların çeşitli bileşenlerinin davranışı hakkında zamansal ve mekansal bilgi toplamak için kullanılan, ancak bu biyokimyasal tahlil öncelikle geçici bilgi, elde etmek için kullanılır.

Sinyal iletim ağ bir telaşlı sistem10,11özellikleri içerir. Supra-eşik kemotaktik uyaranlara yanıt "yaparak" ve ateşe dayanıklı dönemleri görüntülemek. Yanıt-e doğru da stochastically tetiklenir ve salınım davranış gösterebilir. Sinyal iletim olaylar dalgalar12,13,14,15yaymak bölgelere korteksin lokalizedir. Ön ya da geri, işaretçileri için işe veya aktif bölgelerinden yayılıyor dalgaların, ayırmak. Onlar karşılamak üzere active bölge izleyen ateşe dayanıklı bölge nedeniyle karşılıklı yönlendirilmiş dalgalar yok edin. Yayılıyor sinyal iletim dalgalar altında yatan hücre göç10arabuluculuk hücresel çıkıntılar.

Benzer düzenleyici mekanizmaları da nötrofil ve diğer memeli hücre türleri16 uygulanabilir olmasına karşın kemotaksisi olarak yukarıda belirtilen bilgilerin çoğunu sosyal amip Dictyostelium discoideum, iyice düşünülmüş--dan geldi . Dictyostelium tek hücreleri binlerce sonunda sporları içeren çok hücreli bir meyve vücut şekillendirme bir toplama merkezine doğru geçirirken, sırasında şiddetli açlık, güçlü kemotaktik tepki süresine sahip bir iyi kurulmuş model organizmadır. Bakteriyel gıda kaynakları bulmak için bu organizmanın tek hücre büyüme aşamasında kemotaksisi esastır. Önemlisi, geçiş tek Dictyostelium hücre memeli nötrofiller veya metastatik kanser hücrelerinin, Bütün bunlar çok hızlı protozlar türü göç geçmesi geçiş oldukça benzer. Aslında, düzenleyici ağların genel topoloji, hem çok bireysel sinyal iletim yollarının kemotaksisi dahil korunmuş Dictyostelium ve memeli lökosit17arasında. Ayrıca, fibroblastlar gibi diğer hücre reseptör tirozin kinaz (RTK) yerine GPCRs kullanın; Ancak, RTKs-ebilmek beslemek benzer ağlar.

Kemotaksis aksine, yönlendirilmiş göç çeşitli modları sürücü sinyal mekanizmaları konusunda eksiksiz bilgi bulunmuyor. Benzer şekilde chemoattractant Gradyanda geçiş hücreleri için çeşitli çalışmalarda harekete geçirmek ve/veya yerelleştirme tipik öncü işaretleri, aktin polimerizasyonu, PIP3 ve/veya hücre dışı sinyal düzenlenir kinaz (ERK) 1/2, dahil olmak üzere, bildirdin Açık geçiren hücre göç akışı veya elektrik alanları18,19,20,21değişimler yamultmak için yanıt olarak yönetti. Ancak, bu çalışmalarda uyarıcı sürekli maruz Ayrıca hücre göç, örneğin, bir uyarana tepki olarak özellikle öncü işaretleri yerelleştirilmesine, veya sadece öncü yerelleştirmek soru açık bırakarak sonuçlandı pseudopods ön geçirme hücre sayısının artmasına yüzünden.

Hücreleri cevaben kesme akışı hem düzeyinde nüfus ve tek tek hücreler22olarak teslim akut mekanik pertürbasyon gözlemlemek için bize izin deneyleri geliştirdik. Benzer bir chemoattractant, akut yaptığı ile küresel stimülasyonTion kesme akışı ile hareketliliği veya polarite mekanik bir uyarana karıştırıcı katkısı olmadan bir hücresel yanıt çalışma sağlar. Bu biyokimyasal ve mikroskobik deneyleri genetik veya farmakolojik tedirginlikler ile birleştirerek hakkında nasıl mekanik uyaranlara algılandığını öğrenmek için bize izin verir ve iletilen. Ayrıca, bu yaklaşım da yokluğunda böylece sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağları reseptör/g izole eden bir chemoattractant, chemoattractant reseptör sistemi aşağı faydalanarak için yeni bir yöntem sağlar protein ağ.

Son zamanlarda biz açıklanan teknikleri kullanarak akut kesme stres kemotaktik sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağlar22birden çok bileşeni etkinleştirme için yol gösterdi. Akut mekanik uyarıcı değişen aralıklarla uygulayarak, biz aynı şekilde chemoattractants için mekanik bizi canlı tutan da altında yanıt yaparak davranışını da dahil olmak üzere bir telaşlı sisteminin özelliklerini sergileyen, gösterdi koşullar ve ateşe dayanıklı bir süre varlığı doyurarak. Son olarak, mekanik ve kimyasal uyarımı birleştirerek iki uyaranlara büyük olasılıkla birden çok uyaranlara karşı önyargı hücre göç entegrasyon için izin sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağlar, paylaşmak gösterdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hazırlık çözümler

  1. birini kullanarak hazırlamak HL-5 medya: 10 g/L dekstroz, 10 g/L proteose pepton, 5 g/L Maya ekstresi, 0.965 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0.485 g/L KH 2 PO 4 ve aksi belirtilmediği sürece, 0,03 g/L streptomisin deiyonize su. Otoklav orta ve mağaza oda sıcaklığında.
    Not: farklı tedarikçiler elde proteose pepton ve Maya özü arasında yanı sıra bireysel toplu işlemleri arasındaki farklar nedeniyle ortam pH 6.4-6,7 tipik aralığına ayarlanması gereken.
  2. Birini kullanarak hazırlamak SM plakaları: 10 g/L dekstroz, 10 g/L pepton, 1 g/L Maya ekstresi, 2.31 g/L KH 2 PO 4, 1 g/L K 2 HPO 4 ve 20 g/M agar deiyonize su. Otoklav, serin ve 30 mL agar çözeltisi başına 10 cm Petri kabına dökün. Bir kez agar katılaşır, plakayı 4 ° c ilâ 1 ay için depolamak.
  3. Hazırlama 10 fosfat tampon (PB) kullanarak x 13,4 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O ve deiyonize su 6.8 g/L KH 2 PO 4. Saat 4'te 10 x hisse senedi depolamak ° C. Dilute kullanılmak deiyonize su ile 1 x.
  4. Hazırlamak DB 1 X 2 mm MgSO 4 PB ve 0.2 mM CaCl 2 ilave tarafından arabellek.
  5. Hazırlama 100 mM kafein deiyonize su. Mağaza − 20 ° c
  6. Kamp sodyum tuzu monohidrat deiyonize su içinde eriterek tarafından hazırlamak 100 mM kamp hisse senedi çözüm. 1 mM deiyonize su stokta çalışma hazırlamak. Her iki hisse senedi Solutions'da saklamak − 20 ° C. hazırla son kamp çözüm, denemenin gün istenen konsantre DB.
    Not: Bir kaç kez dondurma çözdürülen hisse senedi çözümleri olabilir.
  7. Hazırlama 25 mM folik asit 1 x PB. Toz tamamen eriyene kadar 1 N NaOH birkaç damla ekleyin. Mağaza − 20 ° c
  8. 3 x örnek arabelleği aşağıdakileri kullanarak hazırlamak: 187,5 mM Tris-HCl pH 6.8, % 6 (w/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), % 30 gliserol, 126 mM dithiothreitol ve %0.03 (w/v) bromophenol mavi. Aliquot ve dükkanda − 20 ° C. Kullanın, bir 37 ° C su banyosunda çözülme ve 3 x 1 x örnek arabelleğe sulandrarak ve 50 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 25 mM sodyum pirofosfat ve 1 x ekleyerek fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile örnek arabellek hazırlamak için devam etmek için
    1. önceden tam EDTA ücretsiz proteaz inhibitörü deiyonize suyla kokteyl. İnhibitörleri hemen adımları 3.1.2-3.1.3 içinde açıklanan yordamı başlatmadan önce ekleyin.
  9. 5 mM DMSO çözümde Latrunculin A hazır olun. Aliquot ve dükkanda − 20 ° C.

2. Hazırlık D. discoideum hücre

Not: D. discoideum hücreleri HL-5 medya doku kültürü tabak ya da korumak veya bir süspansiyon kültürü daha önce 23 açıklandığı gibi. Gerektiğinde, dönüşüm fluorescently etiketli biyosensörler göre standart elektroporasyon protokoller 24 ile hücreleri. Çeşitli D. discoideum suşları yanı sıra plazmidleri biyosensörler veya ilgi diğer genlerin kodlama Dicty hisse senedi Merkezi'nden (dictybase.org) temin edilebilir.

  1. Büyüme ve bitkisel D. discoideum hücreler topluluğu
    1. bitkisel hücre, analiz için büyümek hücreleri genellikle içinde gözlenen macropinosomes, sayısını azaltmak için bakteri varlığında axenically yetiştirilen hücrelerin 25.
      1. Hazırla HL-5 orta Antibiyotikler olmadan istenen hacmi içine az sayıda hücre bir gliserol hisse senedi veya bir önceki kültür aşı tarafından Klebsiella aerogenes bir kültür. 16-18 h. için bir orbital Çalkalayıcı-200 devirde (0,42 x g) oda sıcaklığında (20-22 ° C) bakteri kültürü kuluçkaya
        Not: K. Burada kullanılan aerogenes yük olduğunu patojenik olmayan (bakınız Tablo reçetesi).
    2. D. discoideum üstel büyüme aşamasında doku kültürü plakaları veya süspansiyon kültür toplayıp üretici göre bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ' s yönergeleri. 1 x 10 5 D. discoideum hücreleri ile 260 µL K. aerogenes süspansiyon bir SM plaka üzerinde yayılmış. Ertesi gün aşağı ters plaka açın. D. discoideum hücreleri başlayana kadar bakteriyel çim takas ama onlar toplayarak başlamadan önce oda sıcaklığında hücrelerin büyümesine (~ 36-48 h).
    3. Toplamak D. discoideum onları bir cam dağıtıcı ile kazıma tarafından 5 mL DB arabellek hücrelerde. Hücreleri 50 mL polipropilen boru aktarın. Başka bir 5 mL DB arabellek ile plaka ve havuzu orijinal süspansiyon ile yıkayın. 50 mL tüp ile DB tampon doldurun.
    4. 3-4 dakika süreyle santrifüj 360 x g, D. discoideum süspansiyon süpernatant Aspire edin ve Pelet 50 mL resuspend DB arabellek. Tekrar süpernatant olana çamaşır adımları (~ 3-4 yıkar) temizleyin. Son hücre Pelet DB arabelleği 5 ~ 10 6 hücre/mL x son yoğunluğunun resuspend.
  2. Toplama hazırlanması-yetkili D. discoideum hücre
    1. geliştirme D. discoideum standartlarına göre her 6 dk 1 h açlık açlık ve 50 nM kampıyla darbe 4 h ve ardından tarafından hücreleri protokolleri 23.
    2. Geliştirme hücre süspansiyon son hacim ölçmek.
    3. Dayalı geliştirme için kullanılan hücre başlangıç sayısını hesaplamak son süspansiyon hücre yoğunluğu.
      Not: kamp 100 µL cilt olarak her 6 dakikada teslim edilirse, kamp darbe her saat için 1 mL tarafından hücre hacmi artar. Böylece, 8 x 10 7 hücreleri 4 ml DB kullanarak standart koşullar için geliştirme 4 h sonra son hacim 7 mL ve son hücre yoğunluğu ~1.1 x 10 7 hücre/mL.

3. Biyokimyasal analiz, hücre veya yanıt olarak mekanik kimyasal uyarımı

    1. plaka 2 x 10 6 toplama yetkili Akut mekanik stimülasyon, hücreleri tarafından takip hücre lizis hücrelerden (Adım 2.2) 4 h sonra 35-mm yemekleri 2 mL DB ile geliştirme. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika eklemek izin verir. Hücreleri iki kez 1 mL DB ile yıkayın. DB hücrelerle 2.5 mM kafein plakaların herhangi bir rahatsızlık olmadan 30 dk için kuluçkaya.
      Not: hücreleri ile farmakolojik bir önleyici tedavi edilmesi gerekiyorsa, istenen inhibitör konsantrasyon veya uygun araç aynı hacmi kafein ile basalation sırasında ekleyebilirsiniz.
    2. Mekanik stimülasyon, uygulamak için bir orbital Çalkalayıcı plaka (teker teker) yerleştirin ve hemen 150 RPM (0,24 x g) 5 açın s.
      Not: Plaka da el ile hareket tarafından yaklaşık 5 için çapraz bir şekilde uyarılmış s.
    3. Aspire edin, belirtilen arabellek kez stimülasyon başladıktan sonra. Hemen 100 µL örnek arabellek fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile ekleyerek hücreleri parçalayıcı.
    4. Plaka Buza koyun ve lysate 1.5 mL tüp içine toplamak. İçin ' zaman 0 ', sallayarak olmadan hücreleri parçalayıcı. Tüpler 95 ° C ısı blok için 10 dk sonra hemen lizis aktarın. İmmunoblotting ile devam etmek ya da lysates -20, saklamak ° C.
  2. Stimülasyon hücreleri bir Chemoattractant ile
    1. toplama yetkili hücreleri geliştirme sonra 4 h hızla onları 5 mM kafein 200 devirde (0,42 x g) huzurunda bir orbital Çalkalayıcı 30 dk için üzerinde sallayarak Basalate.
      1. Santrifüj hücre süspansiyon 360 x g 3-4 dakika süreyle süpernatant Aspire edin ve Pelet 10 mL resuspend buz gibi DB arabellek. Çamaşır adımı yineleyin.
    2. 4 x 10 7 hücre/mL (bkz. Adım 2.2) hücreleri geliştirmek için kullanılan bu ilk hücre sayının son yoğunluğunun buz gibi DB arabellekte son hücre Pelet resuspend. Hücre süspansiyon stimul önce buz üstünde tutmakation.
      1. Pipet 50 µL 10 µM kamp veya araç polistren bir fincan içine yerleştirilen bir orbital Çalkalayıcı.
    3. Hücreleri uyarmak için buz gibi hücre süspansiyon 450 µL aynı fincan içine ekleyin ve hemen shaker 200 rpm'de (0,42 x g) açın. Çeşitli zamanlarda stimülasyon başladıktan sonra at (örneğin 10, 30, 45, 60, 120 s), kısaca shaker durdurmak, hücre süspansiyon 50 µL aliquots almak ve 25 µL 3 X örnek arabellek içeren 1,5 mL tüpler ekleyerek hücreleri parçalayıcı.
      1. İçin ' zaman 0 ', unstimulated buz gibi hücre süspansiyon hücrelerden kullanın.
        Not: Hücre süspansiyon stimülasyon sırasında son sıcaklık ~ 9 ° C 26 yaşında. Bu koşullar altında en yüksek yanıt oda sıcaklığında (örneğin, yapışık hücreleri mikroskop üzerinde chemoattractant uyarılması veya mekanik yapışık hücreleri uyarılması) gerçekleştirilen uyarılması için gözlenen en yüksek biraz geç ortaya çıkar.
    4. Lizis hemen sonra 10 dakika için 95 ° C ısı bloğu tüpler aktarmak. İmmunoblotting ile devam etmek ya da lysates -20, saklamak ° C.
  3. Immunoblotting tarafından yanıt hücre analizi
    1. üzerinde 4-%15 Tris-HCl polyacrylamide jel lysates (Kimden adım 3.1.3 veya 3.2.4) çalıştırmak, polivinilidin florid membran, blok ve immunoblot fosfo-PKC ile transfer Ζ (fosfo-PKBR1 ve fosfo-PKBA algılamak için) Thr410. Sinyal ile gelişmiş Kemiluminesan substrat kullanarak Kemiluminesan tarafından takip horseradish peroksidaz Birleşik Anti-tavşan ikincil antikor, kuluçka saptamak.
    2. Leke sıyırma arabelleği ile birden fazla protein tespiti için şerit ve yeniden sonda ile birincil antikor karşı fosfo-p42/44 MAPK Thr302 / (fosfo-ERK2 algılamak için) 304. Eşit protein polivinilidin florid membran Coomassie parlak mavi ile boyama tarafından yükleme onaylamak.

4. Akut mekanik stimülasyon ve canlı görüntüleme, tek hücreler mikroskop

  1. bir akış aygıtı kullanarak akut mekanik stimülasyon yanıtı değerlendirilmesi
    1. toplamak ve bitkisel veya toplama yetkili seyreltik ~ 1 x 10 6 hücre/mL sırasıyla 2,1 ve 2,2, adımlarda açıklandığı gibi DB hücrelere. Bir kanal ile slayt ~ 600 µL yüklemek (Malzeme tablo Ayrıntılar için bakınız). Hücreleri 10 dk. yapmak için tüm alıcılar slaytta yer tamamen dolu emin eklemek izin verir. Gerekirse ilave arabelleği ile kontör.
      Not: çözümlemesi için kullanılan belirli slayt dar, 1 mm kanallarına yem, ama sonra geniş ve 3 mm bir kanal için birleştirin Üç giriş vardır. Kanal 0.4 mm yüksekliğidir. Hücreler kanal kaplama rağmen sadece geniş kısmını görüntüsü.
    2. 50 mL rezervuar sıvı biriminin açık değil vana aracılığıyla bağlı olduğu satırlardan birini geçmek (Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız). İstimal bilgisayar yazılımı için pompa, vana kapalı olduğundan emin olun (Yani soldaki). Havzanın DB ile doldurun.
      1. 50 mbar basınç ayarlı ve açın. Doldurun ve açmak için kapak üzerinde tıklatarak satırı DB ile durulayın. 0 geri basınç açmak ve Vana ~ 30'dan sonra kapatın s.
    3. Herhangi bir hava kabarcıkları yakalama olmadan bir slaydın bir tarafta üç giriş hattı bağlayın. Diğer iki giriş takın. Slayt ikinci tarafında tek emişli için drenaj hattı bağlayın.
      Not: Bu kurulum giriş ve drenaj hatları için kullanılan boru bir iç 1.6 mm çapındadır.
    4. Mikroskop altında bir 20 X hava hedefi slayt yerleştirin. Kanal durulama için satırı açın ve'ı tıklatın için vana geçin " basınç ON ", yüksek basınçta (~ 50 mbar veya ~ 40 dyn/cm 2) sıvı drenaj itmek için başlangıç.
      1. Sıvı drenaj dışında olduğunda, dış basınç sıfıra azaltmak (i.e. yerçekimi akışı yalnızca, ~ 15 dyn/cm 2) ve ~ 30 s. şalter için kapak akışını durdurmak için ters pozisyon için durulama devam.
    5. Elde bir ters floresan mikroskop altında bir 40 X Petrol amaç üzerinde RFP ya da GFP aydınlatma 3 s aralıklarla görüntülerle. İstenilen basınçta, genellikle 15 ile 40 dyn/cm 2 arasındaki basınç ile kapak kapalı konumda açmak (0 - 50 mbar).
    6. 5 kare aldıktan sonra uyarıcı Vana geçiş yaparak teslim " açık " pozisyon. Vana için ters yönde geçiş yaparak sonra 2-5 s akışını devre dışı.
      Not: bazı zayıf biyosensörler (örneğin PTEN, CynA ve RalGDS) 40 X Petrol amacı ile donatılmış confocal mikroskop kullanarak görüntü hücrelere gerekebilir.
  2. Farmakolojik inhibitörlerinin yanıt-e doğru bir akış aygıtı kullanarak akut mekanik stimülasyon üzerinde etkileri test
    1. plaka slayt hücrelerde bir kanal ile 4.1.1. adımda açıklandığı gibi. İki satır ayarla: adım 4.1.2, olduğu gibi açık değil vana ile bir satır geçmek ve arka tarafında ikinci kapak yaptı. Sol çizgi Klamp ve kapak koy " kapalı " (sol) konum. Uygun araç ve ikinci bir farmakolojik inhibitörü olan faiz (örneğin 5 µM Latrunculin A) içeren solüsyon ile içeren DB ile bir satır doldurun.
      Not: Fiziksel olarak sol çizgi çünkü kelepçe gereklidir " kapalı " sola göre konum açılır kapak bu hat için.
    2. Dolgu ve durulama sağ satır 50 mbar basınç tahrik ve kapak için anahtarlama tarafından " aç " (sağda) konum. ~ 30 dolgu s. ve sol satır klempi ~ 30 s. bağlamak için kaldırarak durulayın sonra kapak sola her iki hat iki slayt kanalı içeren bir tarafındaki giriş için geçiş, kalan giriş fişi ve tek emişli üzerinde ikinci yan. drenaj bağlanmak < / l Ben >
    3. arabellek içeren slaydı sağ çizgi yıkamak ve stimülasyon 4.1.3 ve 4.1.4 yukarıdaki adımlarda açıklandığı gibi aynı arabellekte gerçekleştirmek.
      Not: her ne kadar doğru çizgi bu kurulum birinci olarak seçildi, sırasını tersine.
    4. Stimülasyon, sağ çizgi sıfır basınçta (Yani yerçekimi akışı yalnızca, ~ 15 dyn/cm 2) açmak için kapak geçin. Kelepçe sol satırından kaldırmak ve Vana bu çizginin açmak için sola geçin. İlk satırı kelepçe.
    5. 3-5 mL arabelleği inhibitörü ile birlikte çalışan sonra Vana akışını durdurmak için sağa geçin ve hücreleri için gerekli süreyi inhibitörü ile kuluçkaya (örneğin 15 dk). Vana her ~ 10 dk ~ 15 için geçiş yaparak akışını açmak oksijen yetmezliği önlemek için s. Stimülasyon ikinci satır ile yineleyin.
  3. Bir micropipette kullanarak akut mekanik stimülasyon yanıtı değerlendirmek için alternatif bir yöntem
    1. DB ile standart protokol 23 göre dolu micropipette ayarlayın. 1500 PSI tazminat bastır.
    2. Toplamak ve 2.1 adımda anlatıldığı gibi bitkisel hücreleri oranında seyreltin. ~7.5 x 10 5 hücre/mL 1-şey odasında yer 25 µL damla izin en az 10 dk için uygun ve 3 mL DB ile kapak için.
    3. Odası 40 X Petrol amacı ile donatılmış bir ters Floresans mikroskobu yerleştirin. Hücreleri bulun. İlk alt odasının dokunana kadar micropipette görüş alanı ortasında içine yavaşça indirin.
      Not: tazminat basınç 1500 PSI kuruldu beri hücreler sürekli olarak DB çok yavaş bir akışı için micropipette maruz kalacağı.
    4. 3 s aralıklarla RFP ya da GFP aydınlatmalı görüntüleri alma başlar. Geçerli ' temiz ' micropipette sıvı bolus serbest bırakmak için işlev. Imaging ben devamn akışı nedeniyle tazminat basınç yalnız varlığı.
  4. Toplu arabellek eklenmesini kullanarak akut mekanik stimülasyon yanıtı değerlendirmek için alternatif bir yöntem
    1. toplamak ve 2.1 adımda anlatıldığı gibi bitkisel hücreleri oranında seyreltin. 20 µL damla hücre ~ 1 x 10 6 hücre/mL DB bir 8-şey odası bir kuyudan ortasında yerleştirin. Hücreleri en az 10 dk. için bağlı kalmak izin
    2. RFP veya GFP özel aydınlatma üzerinde 3 s aralıklarla 40 X amacı ile donatılmış bir ters Floresans mikroskobu ile görüntüleri alma başlar. Damla kenarına yakın bir alan üzerinde odaklanmak.
    3. Hızla iyi bir yana DB 430 µL ekleyin. Görüntüleme devam.
    4. Mekanik ve kimyasal uyaranlara arasındaki etkileşimi analiz için mekanik stimülasyon, izleyen 12 veya 45 s yavaşça ekleyin folik asit (son konsantrasyonu 20 nM) veya araç (DB) 50 µL mekanik bir yanıt inducing olmadan. Görüntüleme devam.
  5. Yanıt miktar
    1. 32-bit TIFF görüntü içinde görüntü analiz yazılımı açın (detaylar için bakınız Tablo reçetesi) 27.
    2. Altında ' analiz ' sekmesinde, gidin " ölçümleri ayarlamak ". Kutusunu işaretleyin ' demek gri değeri '. Diğer kutularını işaretlenmemiş emin olun. ' I tıklatın " Tamam ".
    3. Altında ' işlem ' sekmesinde,'ı tıklatın " arka plan çıkarmak ". Çalışırken topu RADIUS 50 piksel çözünürlükte tutmak ve yapmak değil kontrol seçenekleri menüde listelenen. Bir hücre kullanarak üzerinde yakınlaştırma ' Büyüteç ' aracı.
    4. Kullanma ' dikdörtgen ' araç, bir kutu (~2.5 x 2.5 µm 2) çekirdek veya plazma zarı üzerinde çizmek değil emin sitozol çizmek. Basın " Ctrl " + " M " tuşları veya gitmek ' analiz ' etiket ve tıkırtı üstünde " ölçü " kutusu gri ortalama değerini belirlemek için. Kutuyu emin ilerlemek için izleyen çerçeveler ve ölçü birimi tekrar, sitozol içinde kalır.
      Not: D. discoideum hücreleri çok hızlı bir şekilde taşımak beri kutuyu bir çerçeveden diğerine sitozol içinde tutmak için taşınabilirler.
    5. Sonuçta bu çerçevede analiz var, bir elektronik tabloya değerleri kopyalamak. Çeşitli biyosensörler ifade düzeyde hücre hücre varyasyon için hesap için ortalama gri değeri 0 zamanında gözlenen değerleri normalize. Devrik değerlerin sinyal birikimi korteks üzerinde yansıtmak üzere değerleri hesaplamak.

5. Sürekli mekanik stimülasyon ve canlı görüntüleme, tek hücreler mikroskop

  1. hücreleri içinde merdiven 4.1.1 - 4.1.3 akut mekanik stimülasyon analiz için yukarıda açıklandığı gibi tam olarak ayarla. Birimin her seferinde bir kaç dakika daha uzun süre yanıt analiz Eğer tepesinde olmak bu yüzden arabellek ile havzanın kapsayan tak açın.
    Not: havzanın deneme süresince açık kalır çünkü bu tahlil dış basınç yokluğunda yapılan ve üzerindeki yerçekimi akış tek başına dayanıyor. Yerçekimi tarafından akış oranını artırmak için drenaj bir tablo mikroskop altında yerleştirilebilir.
  2. Hücreleri üzerinde Biyoalgılayıcı yanıt çözümlenmesi için 3 s aralıklarla 40 X amacı ile donatılmış bir ters Floresans mikroskobu RFP veya GFP özel aydınlatmalı Imaging başlar. Alternatif olarak, görüntü analiz genel hücre göç için 10 s aralıklarla bir 20 X hedefi kullanarak faz kontrast.
  3. Sıfır-basınç ayarında birkaç kare sonra üzerindeki akış açın (Yani akış bir yerçekimi yalnız veya ~ 15 dyn/cm 2 nedeniyle) kapak açık konuma değiştirme'yi. Sıvı düzey 5-10 ml Reservoir düştüğünde, daha fazla arabellek ile kontör. Hava kabarcıkları hatlarında tuzağa değil bu yüzden dikkatle sıvı eklemek için emin olun.
    Not: Bu bir şok yanıt olarak hücreleri önlemek için aynı sıcaklık sıvı ekleyin önemlidir.
  4. Ölçmek hücre hızı ve çözümleme bilgisayar yazılımı kullanarak sebat (Ayrıntılar için Malzemeler tablo görmek) Üretici göre ' s yönergeleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Zamansal kemotaksisi düzenleyiciler cevaben akut mekanik stimülasyon

D. discoideum hücre mekanik stimülasyon yanıtı değerlendirmek için yapisan toplama yetkili hücreleri için kesme akımı nabız kısa maruz bırakıldı. Toplama yetkili D. discoideum hücreler hücreleri komşu tarafından hissedilen kampı salgılar. Hücre-hücre sinyallemesi katkı üstesinden gelmek için hücreleri gozlemler cyclase D. discoideum için...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yöntem tanımlamak burada nüfus ve tek hücre davranış yanıt akışı yamultmak için değerlendirmek için kullanışlı bir yol sunar. Önceki çalışmalarda lider ve kenar işaretleri geçiş sırasında geri kalmış yerelleştirme analiz ederken, önemlisi, güncel yaklaşımlar ilk etkisi soruşturma akut kesme akışı uygulayarak sağlar. Bu yöntemi kullanarak aslında, ilk yanıt akışı yamultmak için hücre hücre geçiş gerektirmez, gösterdi. Bunun yerine, ilk kesme akışı uyarana hızlı ve geçici yanıt akışına benzer şekilde chemoattractant degrad...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Ulusal Sağlık hibe R35 GM118177 PND Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler< / güçlü >
DekstrozFisherD16-1HL-5 ortamı ve SM plakalarını hazırlamak için kullanın (adım 1.1, 1.2)
Proteoz peptonFisherDF0120-17-6HL-5 ortamını hazırlamak için kullanın (adım 1.1)
Maya özüFisher50-550-445HL-5 ortamını ve SM plakalarını hazırlamak için kullanın (adım 1.1, 1.2)
Na2HPO4&orta nokta; 7H2OFisherS373-500HL-5 ortamını hazırlamak için kullanın ve 10X Fosfat Tamponu (adım 1.1, 1.3)
KH2Psub4FisherP386-500HL-5 ortamı, SM plakaları ve 10X Fosfat Tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.1-1.3)
Streptomisin (dihidrostreptomisin sülfat)FisherICN10040525HL-5 ortamını hazırlamak için kullanın (adım 1.1)
Pepton (Bacto)FisherDF0118-17-0SM plakalarını hazırlamak için kullanın (adım 1.2)
K2HPO<>sub4FisherP288-100SM plakalarını hazırlamak için kullanın (adım 1.2)
AgarFisherBP1423-500SM plakalarını hazırlamak için kullanın (adım 1.2)
MgSO4FisherM65-500DB Arabelleği hazırlamak için kullanın (adım 1.4)
CaCl2FisherC79-500DB Tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.4)
KafeinFisherO1728-500Kafein hazırlamak için kullanın (adım 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenozin 3 ft.,5 ft.-siklik Monofosfat, Sodyum Tuzu)Fisher11-680-1100MGcAMP hazırlamak için kullanın (adım 1.6)
Folik asitSigmaF7876Folik hazırlamak için kullanın asit (adım 1.7)
Tris bazıFisherBP152-5003X numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)
Sodyum dodesil sülfat (SDS)FisherBP166-5003X numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)
GliserolFisherG33-5003X numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad16106103X numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)
Bromofenol mavisiBio-Rad16104043X numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)
NaFFisherS299-100Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)
Na3VO4Fisher50-994-911Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)
Sodyum pirofosfat dekahidratFisherS390-500Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)
Komple EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli (Roche)Sigma11873580001Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile numune tamponu hazırlamak için kullanın (adım 1.8)
Latrunculin AEnzo Yaşam BilimleriBML-T119-0100Latrunculin A'yı hazırlamak için kullanın (adım 1.9)
% 4-15 Tris-HCl poliakrilamid jelBio-Rad3450029İmmünoblotlama için kullanın (adım 3.3)
Poliviniliden florür membranBio-Rad1620177İmmünoblotlama için kullanın (adım 3.3)
Fosfo-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Tavşan antikoruHücre Sinyali2060İmmünoblottasyonda kullanım için birincil antikor (adım 3.3)
Fosfo-p44 / 42 MAPK (Erk1 / 2) (Thr202 / Tyr204) ( D13.14.4E) XP antikoruHücre Sinyalizasyonu4370İmmünoblotlamada kullanım için birincil antikor (adım 3.3)
Tavşan IgG HRP Bağlantılı Bütün Ab (Eşekten)GE HealthcareNA934-100ULİmmünoblottasyonda kullanım için ikincil antikor (adım 3.3)
Geliştirilmiş kemilüminesans substratı (Clarity Western ECL Substrate)Bio-Rad1705060İmmünoblotlama için kullanın (adım 3.3)
Sıyırma tamponu (Restore Plus Western leke sıyırma tamponu)İmmünoblotlama için Pierce PI46430 Kullanımı (adım 3.3)
Coomassie Brilliant BlueFisherPI20278İmmünoblotlama için kullanın (adım 3.3)
K. aerogenes suşu (patojenik olmayan)Dicty Stock Center (dictybase.org)
NameCompanyKatalog Numarası<strong>Comments
Materials and Equipment
Orbital çalkalayıcı (model G-33 veya karşılaştırılabilir bir alternatif)New Brunswick ScientificGrow K. aerogenes (adım 2.1.1) ve D. discoideum hücrelerini bazalat etmek ve uyarmak (adım 3). Bu çalkalayıcı için dönme yarıçapı 9,5 mm'dir.
10 cm Petri kabıFisherFB0875712SM plakalarını hazırlamak için kullanın (adım 1.2)
HemositometreFisher02-671-51BD. discoideum hücrelerini saymak için kullanın (adım 2.1.2)
35 mm çanak (Corning Falcon Kolay Kavramalı Doku Kültürü Kabı)Fisher08-772AMekanik stimülasyon için D. discoideumhücreleri plakalamak için kullanın ve ardından hücre lizisi yapın (adım 3.1.1)
Polistiren kap (5 mL)VWR13915-985Kemoatraktan ile D. discoideum hücre süspansiyonunu uyarmak için kullanın (adım 3.2.2)
Pompalı akışkan ünitesi (ibidi Pompa Sistemi)Ibidi10902Bir kanaldaki D. discoideum hücrelerine mekanik stimülasyon sağlamak için kullanın (adım 4.1, 4.2 ve 5)
Kanallı kaydırın (μ-Slayt III 3'ü 1 arada ibiTreat: #1.5 polimer lamel, doku kültürü ile tedavi edilmiş, sterilize edilmiş)Ibidi80316Akışkan bir cihaz tarafından sağlanan mekanik stimülasyon için D. discoideum hücrelerini plakalamak için kullanın (adım 4.1, 4.2 ve 5)
50 mL rezervuarlar (Akışkan Ünite için Ibidi Rezervuar Tutucu)Ibidi10978Bir kanaldaki D. discoideum hücrelerine mekanik stimülasyon sağlamak için akışkan cihazı kurmak için kullanın (adım 4.1, 4.2 ve 5)
Akışkan ünite için hatlar (Perfüzyon Seti SARI ve YEŞİL)Ibidi10964Bir kanaldaki D. discoideum hücrelerine mekanik stimülasyon sağlamak üzere akışkan cihazı ayarlamak için kullanın (adım 4.1, 4.2 ve 5). Not: İki çizgi 1,6 mm borudan da kesilebilir (katalog numarası 10842).
Drenaj hattı (1,6 mm iç çap boru)Ibidi10842Bir kanaldaki D. discoideum hücrelerine mekanik stimülasyon sağlamak üzere akışkan cihazı ayarlamak için kullanın (adım 4.1, 4.2 ve 5).
40X/1.3 yağ objektifi ve 20X/0.3 hava objektifi (veya benzer bir alternatif) ile donatılmış Zeiss Observer.Z1 tersFaz kontrastı veya floresan aydınlatmalı hücreleri D. discoideum görüntülemek için kullanılır (adım 4 ve 5
0.75 yağ objektifi (veya karşılaştırılabilir bir alternatif)Perkin-ElmerDM 16000D. discoideum hücrelerini görüntülemek için kullanılan bir alternatif (adım 4.1.4)
Eppendorf5252000021D ve 5192000027ile FemtoJet Mikroenjektör (Eppendorf; model 5247 veya karşılaştırılabilir bir alternatif)Bir mikropipet ile D. discoideum hücrelerine mekanik stimülasyon sağlamak için kullanın (adım 4.3). Not: katalog numarası, ekipmanın en yeni sürümü içindir (4i).
Mikropipet (Femtotip; 1 & mu; m dış çap, 0,5 & mu; m iç çap )Eppendorf930000035D. discoideum hücrelerine bir mikropipet ile mekanik stimülasyon sağlamak için kullanın (adım 4.3)
Mikro yükleyici uçları (Eppendorf Femtotips Femtojet Mikroenjektör için Mikro Yükleyici Uçları)Eppendorf5242956.003Mikropipeti (femtotip) tamponla doldurmak için kullanın (adım 4.3.1)
1 kuyulu hazne (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak Camı)Fisher12-565-472Bir mikropipet tarafından sağlanan mekanik stimülasyon için D. discoideum hücrelerini plakalamak için kullanın (adım 4.3.2)
8 oyuklu oda (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Odacıklı Kapak Camı)Fisher12-565-338Toplu tampon ilavesi ile sağlanan mekanik stimülasyon için D. discoideum< / em> hücrelerini plakalamak için kullanın (adım 4.4.1)
NameCompanyKatalog Numarası>Comments
Software
Image Analiz Yazılımı (Fiji)NIHhttps://fiji.sc/Mekanik stimülasyona yanıtı ölçmek için kullanın (adım 4.5)
Migrasyon analiz yazılımı (İzleme Aracı PRO)Gradientechhttp://gradientech.se/tracking-tool-pro/Hücre hızını ve kalıcılığını ölçmek için kullanın (adım 5.4)
: mikroskop )40&x;/1.25&ndash ile donatılmış UltraView eğirme diski konfokal mikroskop;Eppendorf InjectMan

Kaynaklar

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kayma AkışıSinyal İletimiAktin SitoskeletiFloresan BiyosensörlerOrbital ÇalkalayıcıMikroakışkan OdaWestern BlotHücre Göçü
Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.