Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kordon kan kaynaklı CD34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan+ hücreleri

19.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56420

⸱

27 Aralık 2017

 ,  ,  , 
1Haematology Research Unit, St George and Sutherland Clinical School, University of New South Wales, 2Haematology Department, St George and Sutherland Hospitals

Bu makalede

Özet

Megakaryocytes son derece saf bir nüfusa kablosunu elde edilebilir kan kaynaklı CD34+ hücreleri. CD34 için bir yöntem+ hücre izolasyon ve megakaryocyte farklılaşması burada açıklanmıştır.

Özet

Trombosit üretim başta olmak üzere thrombopoiesis bilinen bir işlem kemik iliğinde görülür. Thrombopoiesis sırasında hematopoetik progenitör hücre ölümcül trombosit proplatelets olarak adlandırılan uzun sitoplazmik işlemlerden serbest bırakmak için ayırt megakaryocytes denilen formu trombosit öncüleri ayırt etmek. Megakaryocytes nadir hücreler kemik iliği sınırlı ve bu nedenle labaratuar kullanımı için yeterli sayıda hasat etmek zordur. Verimli üretim insan megakaryocytes, CD34 kültür tarafından elde vitro olabilir+ hücreleri uygun koşullar altında. Burada ayrıntılı protokolünü CD34 yalıtım açıklar+ hücreleri göbek kordonu kan örnekleri sıralama manyetik hücre. Serum-Alerjik koşullar altında son derece saf, olgun megakaryocytes üretmek için gerekli adımları açıklanır. Fenotipik analiz megakaryocyte farklılaşma ve proplatelet oluşumu ve trombosit üretim belirlenmesi ayrıntılarını da temin edilmektedir. Megakaryocyte farklılaşma ve/veya anti-trombosit antikorlar veya thrombopoietin mimetics gibi proplatelet oluşumu etkilemek effectors kültürlü hücrelere biyolojik işlevi incelemek için eklenebilir.

Giriş

Yalıtım birincil insan megakaryocytes (MK) düzenli labaratuar kullanımı için yeterli sayıda burada çekirdekli hücreler1~0.01% için hesap onların düşük frekanslı kemik iliğinde nedeniyle mümkün değildir. Ex vivo genişleme ve hematopoetik kök ve belirli büyüme faktörleri varlığında progenitör hücre farklılaşması bir uygun alternatiftir. Sitokinler kök hücre faktörü (SCF; c-kit ligand) ve İnterlökin (Il) -3 ve IL-11 de dahil olmak üzere bir dizi olmuştur MKs. Thrombopoietin (TPO) üretmek için kültür sistemlerinde istihdam megakaryocytic kültürler için en etkili büyüme ve farklılaşma faktörü olduğunu ve tek başına veya diğer sitokinler, SCF ve IL-32gibi ile etkilidir. TPO kök hücre popülasyonlarının yayılması ve MKs2olgunlaşma neden üzerinde hareket edebilir.

MK üretmek trombosit proplatelets adı verilen sitoplazmik çıkıntılar üzerinden ve, içinde vivo, yaklaşık 1 x 1011 trombosit günlük trombosit sayısı 150-400 x 109/l trombosit üretim vitro sürdürmek için kurulan 1000 kadar olmasıdır -kat vivo içinde 3tahmin ediyor ve bu artış CD34 kullanarak çok sayıda kültür koşulları vermiştir daha düşük+ MK ve trombosit üretim vitrogeliştirmek için hematopoetik progenitör hücre. CD34 ilk kaynak+ MK farklılaşma için kullanılan hücre insan periferik kan4oldu. Diğer hücre kaynakları kemik iliği5,6, embriyonik kök hücre/indüklenen pluripotent kök hücreler (ESC/IPSC)7ve göbek kordon kanı (UCB)8,9,10 yer alıyor . İnsan kemik iliği CD34+ 11 ve fare lineage negatif kemik iliği hücreleri5 üretmek MK ve trombosit içinde vitro; Yine de, insan kemik iliği kullanılabilirlik eksikliği CD34 kaynağı olarak kullanılmasını sınırlar+ hücreleri. Buna ek olarak, ESC ve IPSC hücre vitro trombosit üretim için sınırsız bir kaynağı temsil eder. Trombosit üretim bu hücrelerden besleyici hücreler fare OP9 hücreleri ve daha uzun kültür süre gibi gerektirir. Trombosit koşullarda besleyici-Alerjik türetilmiş daha az işlevsel12görünmektedir. trombosit IPSC kaynaklı ondan beri onlar-ebilmek var olmak genişlemek için büyük ölçüde klinik ortamlarında kullanımı olması muhtemel. Bu işlem lentiviral-aracılı iletim transkripsiyon faktörleri ve uzun vadeli hücre kültür13gerektirir.

UCB CD34 erişilebilir bir kaynak olduğunu+ kolayca kullanılabilir hücre araştırma ayarları. TPO yalnız kordon farklılaşma teşvik kan kaynaklı CD34+ hücreleri ve bu son derece saf, olgun MKs ezelî belgili tanımlık lüzum için serum takviyesi ya da besleyici hücreler ile ortak kültür için artış verir. Diğer sitokinler SCF farklılaşma UCB CD34 dan düşebilir gibi Flt-3 ligand ve IL-11 olgunlaşmamış megakaryocytes14üretimini teşvik ederken+ , hücreleri. Bu protokolünü açıklar yüksek saf MK kültürler kordon kanı CD34+ üretim koşullarında serum içermeyen hücreler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu iletişim kuralı Güney Doğu Sydney insan araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve University of New South Wales insan araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Göbek Kordon kanı sağlıklı bağış elde Sydney Kordon Kanı Bankası tarafından (Sydney, NSW, Avustralya) sağlandı. Yaklaşık 100 mL hacimli bu yordam için kullanılmıştır.

Not: Sınıf II Biyogüvenlik aseptik teknik kullanılarak kabine çalışmaz. Kordon kan torbası % 70 etanol ile dış dezenfekte etmek. Steril aletlerin (makas, cımbız) için bu yordamı kullanın.

1. kordon kan hücresi hazırlık ve CD34 yalıtım+ hücreleri

  1. Steril ayrılık arabellek (SB) fosfat tamponlu tuz (PBS) ile pH 7.2 ve içeren % 0.5 sığır serum albümin ve 2 mM EDTA, hazır olun.
  2. SB 10 mL (bir tüp 10 mL kan başına gereklidir) 50 mL konik tüp içine dağıtmak. Bir 10 mL şırınga monte G18 künt iğne kullanarak, 10 mL kan çantasından çizmek ve SB 10 mL içeren 50 mL tüpler içine dağıtmak.
  3. Lenfosit ayrılık medya ( Tablo malzemelerigörmek) 15 mL tüp iki katman oluşturma seyreltilmiş kan içeren altýna ekleyin.
    Not: medya yavaş yavaş farklı katmanları karıştırma önlemek için tüp altındaki dağıtmak.
  4. Tüpler, 1200 × g (RT) oda sıcaklığında 30 dakika santrifüj kapasitesi yok break ve hiç ivme ile.
  5. Aktarım katmanı içeren mononükleer hücreler (yaklaşık 5-10 mL her tüp) Pasteur pipet kullanarak yeni 50 mL tüp tüp merkezine yakın. SB her tüpün toplam hacmiyle 50 mL ekleyin.
  6. 400 × g RT. atma, 10 min için de süpernatant santrifüj kapasitesi.
  7. Askıya alınan hücrelerin hücre topakları SB. birleştirin 5-10 ml Pasteur pipet ile dikkatli bir şekilde resuspend ve 50 mL ile SB ses getirmek.
  8. Trypan mavi boyama ve bir hemasitometre kullanarak veya otomatik hücreleri hesaplama counter ( Tablo malzemelerigörmek) hücre. CD34 yüzdesini belirlemek için+ örnek, resuspend 2.5 × 105 100 µL SB ve leke hücrelerde 4 ° C'de anti-CD34-PE antikor için 15-30 dakika 10 µL ekleyerek hücreleri Akış Sitometresi (şekil 1A) tarafından analiz.
  9. Santrifüj tüpleri 4 ° C'de 10 dakika için 400 × g de Süpernatant atmak.
    Not: Eğer değilse hemen gerekli, mononükleer hücreler bu aşamada donmuş olabilir.
  10. SB 300 µL 108 hücre başına hücrelerde resuspend. FcR insan IgG 100 µL ekleyin (Reaktif, engelleme bkz: Malzemeler tablo) ve CD34 manyetik boncuklar 108 hücre başına 100 µL. Karışımı yavaşça ve 30-40 dk 4 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Bir tek hücre süspansiyon gereklidir (gerekirse, hücreleri yine de 30 µm filtre reaktifler eklemeden önce geçmek). Burada açıklanan 108 hücreler için veya daha az reaktif birimler kullanın. 10'dan fazla8 hücreler için buna göre reaktifleri (SB, çözüm ve CD34 manyetik boncuklar engelleme) ölçeklendirin.
  11. LS ayrılık sütun kuluçka döneminde LS sütun bir manyetik tutucu içinde yerleştirerek ve atık SB. atma 3 mL ile yıkama hazırlayın.
    Not: LS ayrılık sütunları ilâ 2 × 108 toplam hücreleri ile yüklenebilir. Küçük ve büyük sütunlar kullanılabilir.
  12. 5-10 mL SB hücre karışıma ekleyin ve 10 dakika süreyle 400 × g, santrifüj süpernatant atın.
  13. Hücreleri SB 1.5 ml resuspend ve LS sütun üzerine hücre süspansiyon (1,5 mL) yükleyin. 15 mL toplama tüp (negatif kesir #1) etiketlenmemiş hücreleri içeren aracılığıyla akış toplamak. Sıvı drenaj ve sütun SB 1,5 mL ile yıkamak izin.
  14. (3 mL) ile toplanan akışı sütuna geri yüklemek ve aynı 15 mL toplama tüp (negatif kesir #1) aracılığıyla akış toplamak. LS sütun 3 kez SB 3 mL ile yıkayın.
    Not: gerekirse, negatif kesir (12 mL) hücrelerde CD34 yakalanması tespit etmek için anti-CD34 antikoru ile Boyanabilen+ hücreleri tarafından LS sütun.
  15. Sütun manyetik ayırıcı kaldırın ve hücrelerin yavaş yavaş şırınga lavabo pompası ile SB 2 mL ile yeni bir 15 mL tüp içine boşalt.
  16. Sütun geri manyetik ayırıcı ve yük hücreleri 2 mL sütuna yerleştirin. Aracılığıyla akış toplamak ve 2 mL SB ile yıkayın. Bu negatif kesir #2 (4 mL) olduğunu.
  17. Manyetik ayırıcı LS sütun kaldırın ve 2 mL SB. Flush hücre sürekli ve sıkıca ekleyin CD34 toplamak için enjektör pompası ile+ hücre kesir. Trypan mavi boyama ve bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak.
  18. Santrifüj tüpü ile 400 × g 4 ° C'de 15 dakika de olumlu kesir Süpernatant atmak. CD34 için serum-Ücretsiz medya hücrelerde resuspend+ hücreleri (SFM, Tablo malzemelerigörmek).
    Not: Eğer değilse hemen gerekli, hücreler sıvı azot içinde bu aşamada donmuş olabilir.

2. saflık denetimi izole CD34+ hücreleri

  1. Pozitif kesir 10 µL anti-CD34-PE antikor ve 20 µL anti-CD45-PerCP antikor 4 ° c (ayrı bir tüp kullanımı izotip denetimleri) 15 dakika ile 2 x 104 hücrelerden leke (şekil 1B).
  2. SB yıkamak için 1 mL ekleyin. 400 × g 10 dakika süreyle de SB 200 µL Resuspend Pelet santrifüj kapasitesi.
  3. Akış sitometrik çözümlemesi gerçekleştir ve enkaz (şekil 1B) dışlamak için canlı hücre nüfus kapısı. Kapıyı PE ve PerCP izotip denetimleri (şekil 1B) kullanarak PE ve PerCP olumlu nüfus için ayarla ve CD34 yüzdesini belirlemek+/CD45+ hücreleri.

3. megakaryocyte farklılaşma

  1. Tohum 5 × 105 hücre/mL CD34+ hücreleri iyi bir 12-şey plaka başına 50 ng/mL rekombinant insan thrombopoietin ile (rhTPO) takıma SFM 2 ml. Hücreleri 37 ° c, % 5 CO2 oksijen bir atmosferde kuluçkaya. Önce analiz için gerekli Konfluent hücrelerdir, hücreleri hasat ve birden çok wells taze medya ve rhTPO ile ayrılmıştır.
    Not: İki ya da üç kuyular farklılaşma farklı zaman noktalarda (örneğin, gün 7, 9 ve 10) izlemek için özel olarak hazırlanmalıdır.
  2. Hücre farklılaşması hücre diğer Wells bozmadan izlemek için bir kenara kuyulardan hasat.
  3. 20 µL anti-GPIIb/CD41-FITC antikor hücrelerle leke ve 10 µL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 antikor son hacmi 100 µL. bir denetim kurmak tüp ilgili izotip kontrol antikorları kullanarak. 15-30 dk 4 ° C'de için kuluçkaya
  4. SB yıkamak için 1 mL ekleyin.
400 × g 10 dk. atma süpernatant için de santrifüj kapasitesi ve Pelet SB. analiz 200-300 µL içinde Akış Sitometresi tarafından resuspend.
  • Her fluorophore için analiz etmek için FITC ve Alexa un 647 olumlu nüfus çoğunluğuna ayarlamak için izotip kontrol eder. CD41 yüzde belirlemek için lekeli hücre örnekleri analiz+/CD42a+ çift olgun MK (şekil 1 c) temsil pozitif hücrelerinin.
  • Hücre mikroskobik görselleştirme için 3,3 içinde açıklandığı gibi hücre yüzey işaretleyicileri leke.
    1. SB yıkamak için 1 mL ekleyin. Vasıl 400 × g 10 dakika süreyle santrifüj Resuspend Pelet 100 µL SB ve spin 1000 x g 5 dk. düzeltme hücrelerin metanol için 30 s. hava kuru, daldırma tarafından slayt üzerinde de bir cam slayt üzerine eklemek DAPI içeren medya montaj 20 µL ( Tablo malzemelerigörmek) , kapak ile coverslip ve floresan mikroskop (şekil 2A) kullanarak görselleştirmek.
  • Görselleştirme hücre içi antijenleri için PBS hücrelerde resuspend ve paraformaldehyde (% 1 son konsantrasyonu) oda sıcaklığında 15 dakika ile düzeltin. Hücreleri permeabilize için triton-X 100 (% 0,1) ekleyin ve 2 mL içeren 15 dk. yıkama hücreler için kuluçkaya PBS/0.1% triton-X 100. PBS/0.1% triton-X 100 100 µL içinde resuspend, vWf ve anti CD62p antikorları (1: 200 seyreltme) eklemek ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
    1. 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 ile yıkayın ve vasıl 400 × g 10 dk santrifüj kapasitesi, aynı arabellek 100 µL içinde resuspend ve anti-fare IgG-Alexa 594 ve anti-tavşan IgG-Alexa 488 (1: 100) ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya, 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 ile yıkayın, aynı arabellek 100 µL içinde resuspend ve CD42b-APC anti, 20 µL ekleyin. Sonra hücreleri cam slayta 3.6.1. adımda açıklandığı gibi spin ve örnekleri mikroskobik görselleştirme için 3.6.1. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın.
  • Ploitlik belirlenmesi için günde 12-13 farklılaşma hücre hasat. SB yıkamak için 1 mL ekleyin. 10 dk ve son hacmi 100 µL. 20 µL anti-GPIIb/CD41-FITC antikor ile leke için 400 × g, santrifüj Incubate 4 ° c 30 dk için.
    1. Bir keresinde SB 1 mL ile yıkama ve Pelet Hipotonik sitrat arabellek (1,25 mM sodyum sitrat, 2.5 mM Sodyum Klorür, 3.5 mM dekstroz) içeren 20 µg/ml propidium iyodür ve %0,05 300 µL resuspend Triton-X 100. Işıktan korunan 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
    2. 20 µg/mL nihai bir konsantrasyon RNase ekleyin ve ışıktan korunan 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. Propidium iyodür yoğunluğunu Akış Sitometresi tarafından 30.000-50.000 olaylar (şekil 2C) CD41-FITC+ nüfusunun toplayarak belirlemek.

    • 4. proplatelet sayımı, trombosit numaralandırma ve trombosit aktivasyon

    1. Günde 8 veya 9 farklılaşma ve tohum 1 × 104 hücreleri/kuyuda taze SFM 50 ng/mL rhTPO ile takıma 200 µL 48-şey levha, hücrelerden (Adım 3.1) hasat. 37 ° C, % 5, 5 gün boyunca kültür CO2.
      Not: nüsha wells Nefelometri amaçlar için tohum. Bu düşük yoğunluklu görselleştirme için gereklidir ve proplatelet-MK. Proplatelets genellikle yatak saymaya başla kültür 2 gün sonra görünen. 4 ve 5 gün tepedir.
    2. Yatak proplatelet MK tüm iyi bir ters ışık mikroskobu 10 X-20 X hedefleri kullanarak üzerinde saymak.
      Not: hücreleri oda sıcaklığında uzun süre tutarak büzülme proplatelet uzantıları neden olur bu yana bir ısıtmalı (37 ° C) mikroskop sahne, tercih edilir. Proplatelets MK vücuttan uzun uzantıları olarak gözlenir. Her MK birkaç proplatelet çıkıntılar olabilir. Proplatelets geliştirirken, MK gövdesi boyutu azalır.
    3. Hücre hasat ve vasıl 400 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi. 20 µL Anti-insan CD41-FITC antikor, hücrelerle 3.3 ve 3.4 adımlarda açıklandığı gibi leke. Yatak proplatelet MK (pbMK) yüzdesini hesaplamak: pbMK (%) = [(Proplatelet taşıyan MKs/de) / (Toplam CD41+ hücreleri / de)] x 100
    4. Trombosit kültür orta serbest saymak için yavaşça hücreleri Pasteur pipet ile karıştırın ve 100 µL gün 14 veya 15 kültür toplamak.
      1. 20-30 dk 4 ° C'de 20 µL Anti-insan CD41-FITC antikor ile leke İlgili izotip kontrol antikor kullanarak bir denetim tüp kadar ayarla.
      2. SB 150 µL ve boncuk sayma 50 µL ekleyin.
      3. Akış sitometrik çözümlemesi için FSC ve SSC ölçek oturum için ayarlayın. Kullanım normal insan kan trombosit trombosit açısından zengin plazma üzerinden CD41-FITC ile trombosit (şekil 3A) geçişi ayarlamak için 4.4.1 bölümünde açıklandığı gibi lekeli.
      4. Akış Sitometresi tarafından boncuk sayma ile lekeli trombosit analiz. FSC SSC dağılım çizim (şekil 3A) karşı kullanarak boncuk sayma 1000 olayları toplamak. Formülü kullanarak CD41-FITC olumlu olayları üzerinde (şekil 3B) alan trombosit sayısını hesaplar:
        Trombosit µL başına = [(CD41-FITC olumlu olayların numara)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/örnekleme birimi)]
    5. Trombosit aktivasyon analiz etmek için yavaşça hücreleri Pasteur pipet ile karıştırın ve 100 µL gün 14 veya 15 kültür toplamak. 1 mL Tyrode'nın arabellek (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 0.2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5.5 mM D-glikoz, pH 6,5) ve santrifüj 200 x g hücreleri cips için 5 dakika için ekleyin.
      1. Toplamak süpernatant ve santrifüj vasıl 800 x g platelet boyutlu parçacıklar cips için 10 dakika için.
      2. Süpernatant atın ve Tyrode'nın arabellek 100 µL içinde resuspend. PAC1-FITC antikor ve adenozin nükleotittir (ADP) 20 µL bir son konsantrasyon 20 µM. için eklemek FITC olumlu olaylar yüzdesini belirlemek için Incubate, oda sıcaklığında 20 dk. analiz Akış Sitometresi ile için. Pozitif kontrol (şekil 3 c) olarak aynı şekilde tedavi taze insan trombosit kullanın.

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Sonuçlar

    Bu iletişim kuralı son derece saf MK kültürler kablosu hazırlanması sağlayan kan kaynaklı CD34+ hücreleri. CD34 yüzdesi+ hücreleri kablosunu prize kan mı yaklaşık %1,315 (şekil 1A) ve mononükleer hücreler (Adım 1.8) Aralık 90-300 x 10'dan toplam sayısı6 UCB birim başına. CD34 saflığı +/ hücreleri CD45 + 90 yalıtım aralığından % 99 (şekil 1B) sonra. MK (CD41 tanımlanan+...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Tartışma

    Burada açıklanan protokol MK ve trombosit kültür göbek kordon kanı üzerinden tutarlı üretimi için uygundur. Bu hücreler MK yayılması, farklılaşma, proplatelet oluşumu ve trombosit üretim uyuşturucu veya biyolojik etkinlikler etkisi gibi çeşitli işlemler çalışma için kullanılabilir.

    Çeşitli kültür medya ve sitokin kombinasyonları literatürde mevcuttur. Toplama+ kök hücre faktörü, Flt-3 ligand, IL-3 ve Il-6 destekler CD34 gibi sitokinler, hücre çoğalması. Ancak, bu genişleme azaltılmı...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Açıklamalar

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Teşekkürler

    Yazarlar Avustralya sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (grant 1012409 BHC için bağlı proje) desteğiyle kabul etmiş oluyorsunuz.

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    Hücre Kültürü Reaktifleri
    Rekombinant İnsan TPOMiltenyi Biotec130-094-013
    StemSpan SFEM IIKök Hücre Teknolojileri9605CD34+ hücreleri için serumsuz ortam
    NameCompanyKatalog Numarası Yorumlar< / strong>
    CD34 İzolasyon Reaktifleri< / strong>
    CD34 MicroBead kiti ultra safMiltenyi Biotec130-100-453Bu kit, FcR insan IgG bloke edici reaktifi ve CD34 mikro boncuklarını içerir. Bu boncuklar, anti-CD34 antikor klonu QBEND / 10'u içerir. Saflık kontrolü için farklı bir anti-CD34 klonu kullanın (örn. klon 8G12).
    LymphoprepAlere Technologies1114545Lenfosit ayırma ortamı (yoğunluk 1.077 g/mL)
    Steril ayırma tamponu (SB)Miltenyi Biotec130-091-221Bu tampon, fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.2 %0.5 sığır serum albümini ve 2 mM EDTA içerir. Steril, hücre kültürü dereceli bileşenler kullanılarak hazırlanabilir. Kullanmadan önce gazı boşaltın, çünkü hava kabarcıkları kolonu tıkayabilir.
    Name<strong>Companystrong>Katalog Numarası<<strong>Comments
    Flow Sitometri ve Hücre Boyama Reaktifleri
    PE Fare anti-İnsan CD34BD Biosciences340669Klon 8G12. Bu, CD34 saflık kontrolü için kullanılabilir. Son antikor konsantrasyonu 1:10 seyreltme.
    PerCP fare anti-insan CD45BD Biosciences3474641:10 seyreltme
    PerCP izotip kontrolüBD Biosciences3490441:10 seyreltme
    FITC Fare anti-İnsan CD41aBD Biosciences340929Son antikor konsantrasyonu 1:5 seyreltme.
    APC Fare Anti-İnsan CD42bBD Biosciences551061Bu antikor, olgun MK'yi tespit etmek için de kullanılabilir (pozitif hücrelerin yüzdesi genellikle anti CD42a'dan daha düşüktür). Son antikor konsantrasyonu 1:10 seyreltme.
    Alexa Fluor 647 Fare Anti-İnsan CD42aAbD SerotecMCA1227A647TŞu anda Bio-Rad tarafından dağıtılmaktadır. Son antikor konsantrasyonu 1:10 seyreltme.
    Alexa Fluor 647 Fare Negatif KontrolüAbD SerotecMCA928A647Şu anda Bio-Rad tarafından dağıtılmaktadır. İzotip kontrol antikoru
    Anti von Willebrand faktör tavşan poliklonalAbcamAB69941:200 seyreltme
    V450 fare anti-humna CD41aBD Biosciences584251: 20 seyreltme
    V450 izotip kontrolüBD Biosciences5803731:20 seyreltme
    PAC1-FITC antikoruBD Biosciences3405071:10 seyreltme
    Anti CD62p fare monoklonalAbcamAB66321:200 seyreltme
    Alexa Fluor 488 keçi anti tavşan IgGInvitrogenA110081:100 seyreltme
    Alexa Fluor 594 keçi anti fare IgGInvitrogenA110201:100 seyreltme
    Ig İzotip Kontrol kokteyli-CBD Biosciences558659İzotip kontrol antikoru
    Propidium iyodürSigma AldrichP4864
    CountBright Mutlak Sayma BoncuklarıMoleküler Problar, InvitrogenC36950Sayma boncukları
    Ad>ŞirketKatalog NumarasıgüçlüYorumlar
    >Malzemeler
    LS sütunlarıMiltenyi Biotec130-042-401Daha küçük ve daha büyük sütunlar da ticari olarak temin edilebilir
    MidiMACS Ayırıcı mıknatısMiltenyi Biotec130-042-302
    MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
    Falcon 5mL yuvarlak tabanlı polipropilen FACS tüpler, Çıtçıtlı Kapaklı, SterilIn Vitro teknolojiler352063
    Cam slaytlarMenzel-GlaserJ3800AMNZ
    DAPIVektör LaboratuvarlarıH-1200ile montaj ortamı DAPI ile Antifade montaj ortamı
    strong>Name< / strong><strong>Company< / strong>Katalog Numarası< / strong>Comments< / strong>
    Equipment< / strong>
    Ters mikroskopLeicaDMIRB ters mikroskop
    Floresan mikroskopZeissVert.A1
    Hücre analizörüBD BiosciencesFACS Canto II
    Cytospin santrifüjThermoScientificCytospin 4
    NameCompanyKatalog SayıComments
    Software
    Cell analizör yazılımıBD BiosciencesFACS Diva Yazılımı
    Tek hücre analiz yazılımıTree StarFlowJo
    Floresan mikroskop yazılımıZeissZen 2 mavi baskı
    <

    Kaynaklar

    1. Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
    2. Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
    3. Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
    4. Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
    5. Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
    6. Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
    7. Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
    8. Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
    9. Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
    10. Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
    11. Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
    12. Lu, S. -J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
    13. Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208(2016).
    14. De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
    15. Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).
    16. Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).
    17. Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).
    18. Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
    19. Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
    20. Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
    21. Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
    22. Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Yeniden basım ve izinler

    Etiketler

    CD34 pozitif H crelerKordon Kan zolasyonuManyetik H cre Ayr mAk SitometrisiProplatelet Olu umuSerums z K lt rTrombopoietin TakviyesiFloresan Mikroskopi
    Kordon kan kaynaklı CD34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan+ hücreleri
    Bize ulaşın
    Kütüphaneye tavsiye et

    Gizlilik

    Kullanım Şartları

    İlkeler

    Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.