Bir modeli hayvan, Caenorhabditis elegans, kimyasal toksisitesi değerlendirmek için temel bir protokol açıklanmıştır. Uygun ve risk değerlendirmesi çeşitli çevresel kirleticilerin gelince de eczacılık gelişimi için yararlı yöntemdir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Büyüme ve üreme Caenorhabditis elegans kimyasallar etkisi ölçme
Bu makalede
Özet
Özet
Toksikolojik değerlendirme canlıların temel ve uygulamalı biyolojik bilim alanlarındaki kimyasallar etkilerini anlamak için önemlidir. Bir sigara memeli toprak yuvarlak solucan Caenorhabditis elegans, kolaylık ve memeli hayvan sistemleri ile karşılaştırıldığında hayvan etik sorunları eksikliği nedeniyle toksikoloji Etütler değerli model organizma olduğunu. Bu protokol için toksikolojik değerlendirme C. elegans kimyasalların detaylı bir yordam açıklanır. Bir klinik antikanser ilaç, hangi insan topoizomeraz II hedefler ve insan kanser hücrelerinin DNA ikileşmesi engeller, etoposide kimyasal test bir model olarak seçildi. Yaş-senkronize C. elegans yumurta maruz Dimetil sülfoksit (DMSO) veya etoposide ve sonra C. elegans büyüme stereo mikroskop gözlem tarafından 4 gün boyunca her gün takip. C. elegans DMSO ile tedavi dan yumurta toplam sayısı koydu veya etoposide de stereo mikroskop kullanarak sayılır. Etoposide tedavi önemli ölçüde büyüme ve üreme C. elegansetkilenen. Buna karşılık solucanlar kimyasallar farklı tedavi dönemlerle koydu yumurta toplam sayısı, bu üreme toksisitesi kimyasal C. elegans üreme üzerinde ters çevrilebilir veya geri dönüşü olmayan karar verilebilir. Bu iletişim kuralları her iki, çeşitli ilaçlar ve diğer çevresel toxicants risk değerlendirmesi için yararlı olabilir.
Giriş
Toksikolojik değerlendirme için ilaç, nutraceuticals ve kozmetik geliştirilmesi, aynı zamanda çeşitli çevresel toksinler risk değerlendirilmesi esastır. Kemirgen modelidir bu toksikoloji çalışma için en popüler in vivo deneysel sistemlerinden biri; Alternatif olarak, C. elegans gibi memeli organizmalar da yaygın olarak kullanılmaktadır. Sigara-memeli toksikolojik değerlendirme modelleri sadece hayvan etik sorunlar, aynı zamanda onların kolaylık ve maliyet-etkililik, teknikleri, hız ve tekrarlanabilirlik1,2 göz önünde bulundurarak kullanışlılığı nedeniyle yararlıdır ,3,4.
C. elegans, bir toprak solucan, çeşitli temel ve uygulamalı Biyoloji ve kimya araştırma modeli hayvan olarak istismar. Bu bir 1 mm Uzunluk, sadece içinde katı veya sıvı Yuvarlak solucanlar büyüme medya (bakteriyel gerilme Escherichia coli OP50 ile beslenen NGM) korunur şeffaf Yuvarlak solucanlar var. C. elegans kısa bir ömrü vardır ve vahşi-türü N2 C. elegans yaklaşık 300 yumurta bırakır. Bu nedenle, kolayca deneysel malzeme3,4,5olarak kullanılmak üzere yayılır. C. elegans da birçok uyuşturucu ve çevresel kirleticiler6,7,8,9toksikolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmıştır.
Çünkü birçok antikanser ilaç hızla bölünme kanserli hücrelerin hedef, ayrıca hızla kemik iliği, bağırsak epitel ve saç kökü hücreleri gibi normal hücre bölünmesi zarar verebilir. Örneğin, topoizomeraz inhibitör antikanser ilaçlar kanser hücrelerinin DNA çoğaltma işleminin hedef; Bu nedenle, onlar da hızla normal hücre bölünmesi inhibe. Her canlı organizma topoizomeraz ve bu topoizomeraz inhibitörleri en olası etkisi çevre ekosistemler6,10,11vardır. Böylece, bir ilaç toksikolojik değerlendirme platformu modeli hayvan kullanarak her iki ilaç ve çevresel risk değerlendirmesi için geliştirme değerlidir.
Bu makalede, bir klinik antikanser Ajan etoposide toksisite bu hedefleri topoizomeraz II, C. elegansbir modeli toksik kimyasal olarak test etmek için ayrıntılı iletişim kurallarını açıklar. Bu amaçla, vücut büyüklüğü ve etoposide ile tedavi C. elegans atılmıştır yumurta toplam sayısı ölçüm yöntemi anlatacağız.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: tüm deney 20 ° c düşük toz ve solucan ve bakteriyel işleme sırasında kontaminasyon indirilmesi ile tutulan bir temiz izole laboratuvar gerçekleştirilmelidir. Bu amaçla, deneyler bir alkol lamba ya da temiz bir Bank kullanarak alevi altında gerçekleştirilmelidir.
1. C. elegans ve yumurta hazırlık kimyasal testi için bakım
- koru C. elegans N2 (var. Bristol) ile beslenen bir NGM agar plaka üzerinde yaşamak E. coli OP50 20 ° C'de 12 , 13. Kullanarak
- hazırla yaş senkronize yumurtalar çamaşır suyu çözüm tedavi 5 veya zaman yumurta döşeme yöntemi 6 , 14 , 15.
Not: yumurta öncesi hazırlık, etoposide içeren NGM plakalı ısı inaktive olur-E. coli OP50 aşağıda açıklandığı gibi kat. Isı-inaktive Koli basili OP50 E. coli 6 , 16 metabolik aktivite en aza indirmek için kullanılır.
2. Isı inaktive E. coli hazırlanması OP50 beslemek için C. elegans sırasında belgili tanımlık toksisite sınav
- 500 mL Çift Kişilik Maya tryptone (DYT) orta tablo 1'de açıklandığı şekilde hazırlayın ve E. coli OP50 olarak kültürlü bir koloni aşılamak Luria-Bertani (LB) agar plaka 5.
- E. coli OP50 titreyen bir kuluçka 14 h 37 ° C'de ve 150 rpm için kuluçkaya.
- Aralıklarla 3,220 x g ve 20 ° C de 30 dk sonra tüm süpernatant DYT orta kaldırın ve S-tampon, 250 µL 1 M MgSO 4 ve 5 mg/mL kolesterol (etanol içinde çözünmüş) 25 µL 25 mL öncesi karışımı ekleyin. Bu çözümler steril.
- Bakteri resuspend ve bir 50 mL tek kullanımlık plastik tüp için transfer.
- Isı-inactivation için resuspended kuluçkaya E. coli OP50 65 30 min için bir su banyosunda ° C.
- Serin aşağı oda sıcaklığına ve mağaza kullanımı kadar 4 ° C'de. Bu bir ay boyunca saklanabilir.
3. NGM plakaları ya içeren % 1 DMSO veya 750 µM hazırlanması Etoposide
- hazırla iki temiz 200 mL cam şişe. NaCl, 0.6 g pepton, agar ve 195 mL distile su ve bir manyetik karıştırıcı 3.4 g 0.5 g için bir şişe ekleyin. Manyetik karıştırıcı diğer boş şişe ekleyin.
- İçin 121 ° C ve bir su banyosu şişelerde soğumasını 55 30 dk, 15 dk otoklav bu iki şişe ° C.
- 0.2 mL 1 M CaCl 2, 5 mg/mL kolesterol 0.2 mL, 0.2 mL 1 M MgSO 4 ve 5 mL (Bu çözümler, steril) 1 M KPO 4 de ekleyin ve sonra onları tarafından 55 sıcak tabakta manyetik karıştırma karıştırın ° C.
- İle aynı birim (100 mL her) iki şişe karışık NGM orta bölün. Ardından, DMSO 1 mL için bir şişe ekleyin, manyetik karıştırma kullanarak yeniden karıştırın. Diğer şişe su banyosu 55 ° C, sonraki adım kadar saklayın. Her 35 x 10 mm 2 Petri kabına DMSO içeren orta aliquot 3 mL. Yaklaşık 33 DMSO içeren NGM plakaları bu adıma yapılmış olabilir.
- Manyetik karıştırma kullanarak diğer şişe karıştırmak, 75 mM etoposide (hisse senedi DMSO içinde çözünmüş) 1 mL ekleyin, tekrar karıştırın ve aliquot (Adım 3.4) yordamı yineleyin. Yaklaşık 33 etoposide (750 µM)-NGM plakaları içeren bu adıma yapılabilir.
Not: ilişkili önceki kağıt 6 ' da, 0, 250, 500 ve 1000 µM etoposide test ettik. Bu verilere dayalı, biz bu yazıda etoposide doz 750 µM seçti. - Serin aşağı oda sıcaklığına kimyasal içeren NGM plakaları, oda sıcaklığında yaklaşık 3 h için bırakarak ve onları kullanmak kadar 4 ° C'de saklamak.
Not: ışığa duyarlı kimyasal maddeler söz konusu olduğunda, ışık ışık kaynaklı ayrışma en aza indirmek için blok.
Not: İsteğe bağlı olarak, aşağıda açıklandığı gibi iki farklı kimyasal tedavi koşulları kullanarak gerkçekleştirilen tahlil döşeme yumurta için kimyasallar olmadan normal bir NGM plaka olun. - Ekle 100 µL, ısı inaktive-E. coli OP50 (anlatıldığı Bölüm 2 olarak) ve her NGM plaka üzerine yayıldı. C. elegans kuluçka 20 ° C'de kuru gece kimyasal test için izin
4. Ölçüm C. elegans büyüme
- yaş senkronize C. elegans yumurta transferi %1 DMSO veya 750 µM etoposide ile desteklenmiş NGM plaka.
- Incubate C. elegans 20 ° C'de bir kuluçka 4 gün için. Stereo mikroskop kullanarak solucanlar gözlemlemek ve her gün mikroskobik fotoğraf çekmek. Genellikle 20 X büyütme (1 X objektif lens, 2 X yakınlaştırma büyütme ve 10 X mercek mercek) C. elegans büyüme gözlem için uygundur. Ayrıca mikroskop sahne mikrometre solucan boyutu kalibrasyonunun mikroskobik bir görüntüsünü alır.
Not: Açlık toksisite test etkiler. Bu nedenle, yeterli bakteri ile besleme veya transfer edilen C. elegans ayarla yumurta sayıları başında. Açlık olasılığını dışlamak için 3 gün öncesine kadar dikkat. - C. elegans DMSO veya etoposide ImageJ yazılımını kullanarak her zaman noktasında tedavi vücut uzunluğu ölçmek.
Not: her örnek ölçümlerinde istatistiksel analiz için yeterli 50 kurt vardır.- İçinde ImageJ, açık mikroskop sahne mikrometre görüntü (' dosya ' → ' aç ').
Not: Mikrometre görüntü ve solucan görüntüleri (Adım 4.2) aynı büyütme olmalıdır. - 1000 µm bir çizgi sürükleyin Mikrometre Kalibrasyonu görüntü kullanarak ' düz çizgi ' aracı.
- Tıklama ' analiz ' → ' ölçeği ayarla ' ve giriş 1000 ve µm içine ' mesafe bilinen ' kutusu ve ' uzunluk birimi ' kutu, anılan sıraya göre. Kontrol ' Global ' ve'ı tıklatın ' tamam '.
- Solucan görüntüleri açın (' dosya ' → ' açık '). Bir hat boyunca her solucan'ın özelliğini kullanarak çizdiğiniz ' serbest çizim ' aracı. Vücut uzunluğu veri tıklayarak elde ' analiz ' → ' ölçü '.
- 50 solucanlar için bu adımları yineleyin.
- İçinde ImageJ, açık mikroskop sahne mikrometre görüntü (' dosya ' → ' aç ').
5. C. elegans yumurta atarken tahlil
- Incubate yaş senkronize yumurtalar NGM üzerinde plaka içeren DMSO veya etoposide 64 h için (ilk doğumdan önce) 20 genç yetişkin aşamada kadar ° C.
Not: Solucanlar büyüme ölçüm deneyler üzerinden kullanmak isteğe bağlıdır. Büyüme ölçüm yapmak ve döşeme tahlil birlikte yumurta uygundur. - Transfer 5 Yetişkin solucanlar için yeni NGM plakaları olmadan kimyasallar (koşul 1, genç yetişkin sahne için yumurtadan zaman belirli bir süre içinde kimyasal arıtma) ya da aynı kimyasal Önarıtma (koşul 2, sürekli maruz kalma içeren yeni NGM plaka kimyasallar genel olarak deneysel dönem boyunca) ve sonra onları 24 h için kuluçkaya
Not: Her tedavi için 3-5 NGM plakaları kullanarak çoğaltır yapmak önerilir; Bu çoğaltır istatistiksel analizi için kullanılabilir. - Yukarıda açıklandığı gibi yeni NGM plakasına aktarmak ve yumurta her gün sayma. Kapalı sürünerek, öldü ve dahili olarak kapağı vardı solucanları saymakEd.
- Solucanlar hiçbir daha fazla, genellikle 5 gün içinde yumurta kadar bu adımları yineleyin.
- Solucan her plaka başına koydu yumurta sayısını hesaplamak ve her gün yumurta koydu toplam sayısını belirlemek 5 gün boyunca bu değerlerin toplamını.
Not: Gezilen solucanlar sayısını kapalı ve dahili olarak hesaplamadan yumurtadan dışlamak.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Etoposide (24-96 h) tedavisinde önemli ölçüde C. elegansbüyüme geri zekalı. Araç tedavi solucanlar 1,04 mm (şekil 1) büyüdü iken, kuluçka 96 h sonra etoposide tedavi solucanlar 0,86 mm gövde uzunluğu, büyüdü. Büyüme geriliği de görünüşe göre (Şekil 2) stereo mikroskop gözlem altında gözlendi. Yumurta, kuluçka 72 h araç tedavi solucanlar görmeye başladık. Öte yandan, yumurta etoposide tedavi 96 h sonra tespit edildi. Bu v...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede, etoposide yaydıkları bir örnek olarak kullanarak C. elegans, toprak Yuvarlak solucanlar, kimyasal maddelerin toksisite değerlendirilmesi açıklar. Bu amaçla, biz iki deneysel koşullar kullanılır. İlk seti, C. elegans genç yetişkin sahneye yumurtadan plakaları içeren etoposide üzerinde yetiştirilen ve o zaman solucanlar kimyasallar olmadan normal NGM Tabaklarda yumurtalarını bırakmak için izin verildi. İkinci deneysel sette C. elegans sürekli ile tedavi etoposide bütün deneysel süres...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu çalışmada Kore Enstitüsü bilim ve teknoloji intramural araştırma bursu (2E27513) ve yüksek katma değer gıda teknolojisi geliştirme programı (Tarım Bakanlığı, gıda ve köy İşleri Bakanlığı (315067 / 03) tarafından finanse edilen IPET) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agar | Affymetrix, ABD | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans< / em> N2 | Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) | Vahşi tip | |
| Kolesterol | Sigma, ABD | C3045 | |
| Dimetil sülfoksit | Sigma, ABD | D2650 | |
| Escherichia coli < / em > OP50 | Kaenorhabdit Genetik Merkezi (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, ABD | E1383 | |
| Image J yazılımı (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, ABD | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Mikroskop kamerası | Jenopitk, Progress Gryphax, Almanya | ||
| Peptone | Merck, ABD | 107213 | |
| 35 > 10 mm Petri kabı | SPL Yaşam Bilimleri, Güney Kore | 10035 | |
| 90 > 15 mm Petri kabı | SPL Yaşam Bilimleri, Güney Kore | 10090 | |
| Stereo mikroskop | Nikon, Japonya | SMZ800N | |
| Maya özü | Becton Dickinson, ABD | 212750 |
Kaynaklar
- Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
- Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
- Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , In Press (2017).
- Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
- Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667(2016).
- Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152(2009).
- Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563(2014).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
- Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445(2015).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919(2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321(2015).
- Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
