Method Article

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

DOI:

10.3791/56444

⸱

November 16th, 2017

 ,  , 
1Department of Food, Bioprocessing, and Nutrition Sciences, North Carolina State University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viral genom amplifikasyon kullanan rutin algılama yöntemleri bulaşıcı olmayan parçacıklar bulaşıcı ayırımcılık için kendi yetersizlik tarafından sınırlıdır. Bu makalenin amacı, aptamer bağlama, dinamik ışık saçılma ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak bulaşıcı norovirus parçacıkların ayrımcılık yardım etmek alternatif yöntemler detaylı protokollerde sağlamaktır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan norovirus önemli halk sağlığı ve ekonomik kayıplar dünya çapında önyargısı. Vitro ortaya çıkan ekimi gelişmeler henüz rutin virüs tespiti için geçerli değildir. Geçerli algılama ve öncelikle nükleik asit amplifikasyon güveniyor, miktar teknikleri bulaşıcı olmayan bulaşıcı viral saçılan ayırımcılık değil. Bu makalenin amacı birlikte daha da viral parçacıkların infektivite durumu hakkında bilgi almak için kullanılan teknikleri son gelişmeler üzerine belirli ayrıntıları sunmaktır. Bir tekniği norovirus ssDNA aptamer capsids için bağlama değerlendirme içerir. Aptamers kolayca sentezlenmiş ve avantajına sahip ve are ucuz ve istikrarlı. Başka bir tekniği, ışık saçılma (DL), dinamik kapsid davranış çözümde gözlemleyerek avantajına sahiptir. Elektron mikroskobu viral capsids yapısal bütünlüğünü görselleştirme için sağlar. Umut verici olsa da, bazı dezavantajları vardır her tekniği, non-spesifik aptamer bağlama olumlu tahsil moleküllere örnek matrisler, gelen arıtılmış kapsid DLS için gerekliliğini ve zavallı duyarlılık için elektron mikroskobu gibi için. Bu tekniklerin birlikte kullanıldığında, yine de, üretilen veri gövdesi daha kapsamlı bilgi infektivite, doğru değerlendirilmesi için gerekli olan bilgileri çıkarmak için kullanılan norovirus kapsid bütünlük sağlar inactivation yöntemleri veya virüs algılama yorumlanması. Bu makalede, bulaşıcı insan norovirus parçacıklar ayırımcılık için bu yöntemleri kullanarak iletişim kurallarını sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan norovirus sorumludur için önemli halk sağlığı yük genel olarak, 685 milyon hastalıklar ve 212,000 ölüm neden her yıl1, dolar2,3milyarlarca bir maliyetle. Bugün, norovirus algılama ve miktar genom amplifikasyon ve/veya ligand tabanlı platformlar içerir. Daha duyarlıdır, nicel bilgi sağlar ve yanlış pozitif sonuçlar4genellikle düşük riski vardır eski genellikle tercih edilir. En yaygın norovirus algılama ve miktar genom amplifikasyon tekniği transkriptaz nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) olduğunu. Çünkü bu hedefler ve insan norovirus genom küçük bir parçasını güçlendirir, RT-qPCR yalnız arasında ayrımcılık bulaşıcı yeteneğine sahip değildir ve bulaşıcı olmayan parçacıklar, ücretsiz genomik RNA genleri içeren capsids ve capsids ile ölümcül zarar genleri mutasyona uğramış/kesildi hala RT-qPCR tarafından çoğaltılabilir. İki yeni vitro yetiştirme teknikleri insan norovirus5,6 için son zamanlarda bildirilmiştir, her ikisi de hala RT-qPCR üzerinde virüs miktar için itimat ve henüz rutin klinik/çevre için uygun yöntemleri değildir insan noroviruses için test. Böylece, RT-qPCR klinik/çevre testleri için altın standart kalır.

Diğer vitro yöntemleri bir çaba daha iyi norovirus parçacıklar infektivite durumunu tahmin etmek için geliştirilmiştir. Bu yöntemler genellikle norovirus kapsid bütünlüğünü gidermek ve genom bütünlük değerlendirilmesi kategorize edilebilir. Eski yaklaşım daha popülerdir. Ancak bu ölümcül mutasyona viral parçacıkların yanı sıra sağlam kalır, ancak ana bilgisayar reseptörleri/co-faktörler bağlamak için yetenek eksikliği viral parçacıkların için hesaba katmaz RNase Önarıtma viral genomik RNA, çıkarma önce yaygın olarak kullanılan bir yöntem olduğunu veya kesilmiş ya da marjinal bozuk genleri7. Kapsid bütünlük de değerlendirildi virüs insan norovirus co-receptor/co-karbonhidrat olan faktörler, bağlama yeteneği dayalı histo-kan grubu antijenleri (HBGAs) da bilinir. HBGAs glikoproteinlerin veya glikolipitler (arasında birden çok diğer dokulara) parçası olarak ana bağırsak epitel hücrelerinde bulunan ve vücut sıvıları gibi salya salgıladığı. Enterik bakteri onların yüzeylerde HBGA benzeri maddeler içeren aynı zamanda insan norovirus8,9,10bağlamak için gösterilmiştir ve bu tür etkileşimler norovirus enfeksiyon5teşvik edebilir. HBGA bağlama kullanan temel kavramı sadece viral parçacıkların sözde reseptör/co-factor bağlama yetenekli hücreleri bulaşmasını yeteneğine sahip olacak olan. Birden fazla çalışmalar boncuk tabanlı HBGA bağlama nükleik asit amplifikasyon önceki infektivite ayrımcılık11,12,13,14için umut verici bir yöntem olduğunu göstermektedir, 15,16. HBGAs ile ilgili büyük bir sorun olduğunu hiçbir HBGA türü tüm insan norovirus genotip bağlayabilirsiniz. Bu sorunu çözmek için HBGAs içerir, domuz Gastrik müsin arıtılmış HBGA karbonhidrat sentezi, tutarlılık ve düşük maliyet kolaylığı çıkarına yerine kullanılmıştır.

Son yayın tarafından Moore vd. 17 insan norovirus kapsid bütünlük tahmin etmek için yeni teknikleri bir dizi tanıttı. HBGAs yerine, Moore vd. 17 geniş reaktif nükleik asit aptamer (M6-2)18 ve geniş reaktif Monoklonal antikor (NS14)19 ısıl GII.4 Sydney norovirus capsids (virüs gibi parçacıkların veya VIP) için bağlama incelenmiş ve bu karşılaştırıldığında sentetik HBGAs için bağlanma. Nükleik asit aptamers kısa (~ 20-80 nt) tek telli nükleik sırasına bir sonucu olarak benzersiz üç boyutlu yapılar içine kat ve bir hedef bağlamak asitler (ssDNA veya RNA) vardır. Nükleik asitler olduklarından daha az masraflı olduklarını; kolayca kimyasal sentez, saflaştırılmış ve değiştirilmiş; ve ısı için kararlı. Aptamers noroviruses karşı oluşturulan çeşitli raporlar var, bazıları ile suşları18,20,21,22çeşitli geniş reaktivite gösterilen. Örnek yoluyla, Moore vd. 17 o aptamer M6-2 arıtılmış, birleştirilmiş insan norovirus capsids (VIP) bağlanmış ve benzer şekilde yüksek sipariş (Örneğin, ikincil ve üçüncül) protein yapısı için korumak için viral kapsid üzerine güven içinde HBGA için davrandım gösterdi gerçekleşmesi için bağlayıcı. Öte yandan, capsids tamamen denatüre sonra norovirus VIP bağlama antikor için önemli bir bölümünü NS14 kaldı. Moore ve ark. çalışmayla bağlamasında norovirus değerlendirilmesi 17 yapıldı aptamers antikorlar yerine kullanılır istisna ile ELISA için benzer bir basit, plaka tabanlı yöntemi kullanarak (dolayısıyla yöntem ELASA çağrıldı). Bu yüksek işlem hacmi deneysel yöntem farklı tedaviler norovirus kapsid, fiziksel veya kimyasal stres maruz üzerine viral inactivation mekanizmasının anlamak için değerli iş üzerinde etkilerini değerlendirmek için kullanıldı. Ancak, bu yöntemin bir dezavantajı düşük duyarlılık ve matris ilişkili kirletici non-spesifik bağlama tarafından aptamers neden yüksek düzeyde için hoşgörü eksikliği var.

Moore vd. 17 başka bir yöntem, dinamik ışık (DL), saçılma toplama ısıl işlem yanıt olarak viral parçacıkların izlemek için kullanılır. DLS nanopartikül süspansiyonlar boyutunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır ve proteinler23,24 ve virüsleri25,26,27için genişletilmiş. Çözüm parçacıklar tarafından dağınık ışığın şiddetini partikül büyüklüğü, difüzyon katsayısı ve köklü formülleri kullanarak parçacık çapı hesaplanması için izin veren bir fonksiyonu olarak değişiklik gösterir. DLS tekniği dağınık virüsler, bireysel kapsid protein veya dimer ve virüs toplam boyutu27tarihinde dayalı olarak algılanmasını sağlar Nano aşağı dağınık parçacıkların hidrodinamik çapı ayırt edebilirsiniz. Virüs toplama, parçacık boyutu, bir artış gösterdiği kapsid bütünlüğü kaybı göstergesidir. Kapsid denatüre ve yapısını bozdu, hidrofobik kalıntıları maruz olur ve parçacıklar birlikte hareket ve toplamları oluşturmak neden. DLS den sonra belirtilen bir tedavi ya da gerçek zamanlı17,28toplamada Kinetik partikül büyüklüğü ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntem gözlem kapsid davranışının çözümde izin avantajı vardır ama hangi-ebilmek değil var olmak tamamen doğal haliyle virüs temsilcisi arıtılmış kapsid, yüksek konsantrasyonda gerektirir.

Moore ve ark. tarafından kullanılan son yöntem 17 transmisyon elektron mikroskobu (TEM) yapıldı. Her ne kadar bu yöntemi duyarlılık yoksun ve nicel veri üretmek değildir viral kapsid yapısı üzerinde farklı tedavilerin etkileri görselleştirme için sağlar. Henüz ideal değil her ne kadar klinik/çevre ayarları için bu yöntemleri birlikte insan norovirus inactivation anlamakta değerlidir. Bu makalenin amacı, plaka tabanlı bağlama tahlil için (ELASA), DL, derinlemesine protokolleri sağlamaktır ve TEM hazırlama yöntemleri için kullanılan tedaviler etkileri kapsid bağlamında norovirus kapsid ısı tedavi etkilerini araştırmak Moore ve ark. içinde sunulan bütünlüğü 17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. plaka tabanlı bağlama tahlil değerlendirilmesi kaybı daha yüksek sipariş Norovirus kapsid yapısı için

Not: Burada sunulan bir çok benzer bir ELASA iletişim kuralına Yayınlanan 29, oldu ve benzer ELASA deneyleri daha önce araştırmanın bir parçası başka bir yerde 17 , 18 , 22 makaleler gibi bildirilmiştir.

  1. İnsan norovirus GII.4 Sydney capsids ısıl
    1. almak arıtılmış insan norovirus büyük kapsid protein (VP1) GII.4 Sidney (Katılım: JX459908) capsids içinde toplandı.
      Not: Çalışmada Capsids R. Atmar nezaket (Baylor College of Medicine, Houston, TX) elde edildi.
    2. Dilute capsids 1 fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7.2) maksimum hacmi 15 µL birey için x 50 µg/ml PCR tüpleri şapkalı. Tüp en az 600 içerdiğinden emin olun kapsid ng. 600 olması tedavi-ligand birleşimi başına kapsid ng.
    3. Onceden istenen ısıl işlem için termal cycler.
      Not: Bu protokol, 68 ° C'de tedavisinde farklı zamanlarda amaçlar için (0 - 25 dk) seçildi.
    4. Ek bir termal cycler hemen soğutma için 4 ° c Onceden. Tüpler kapsid çözüm ile termal cycler istenen süre ekleyin. Hemen önceden soğutulmuş 4 ° C cycler 5 min için Isıtma sonra aktarın.
      1. Ekle 95 ° C 5 min için tedavi denatüre kapsid kontrol olarak. Tedavi edilmemiş (23 ° C) kapsid çözüm olumlu bir denetim içerir. Ek bir negatif denetim olarak hiçbir kapsid ile PBS içerir.
    5. Kısa bir süre içinde bütün damlacıklar tüp altına almak ve PBS tedavi kapsid çözümlerinde 3 µg/ml seyreltik bir santrifüj aşağı spin. En az 200 µL seyreltilmiş, tedavi kapsid (100 µL/de) olduğundan emin olun.
  2. Geçerli 100 µL kapsid çözüm tedavi başına en az iki kuyu sağlayarak her şey için. Ayrıca, 100 µL PBS her ligand için 2 kontrol Wells'le şunlardır; Bu testin arka plan Absorbans sağlar. Bir kapak ile plaka kapak, parafin ile kenarları buharlaşma azaltmak için film ve bırakın mühür gecede 4 ° C'de veya oda sıcaklığında 2 h için titreyen bir kuluçka makinesi üzerinde.
  3. İle % 0.05 PBS içinde %5 yağsız süt Katıların (w/v) yaparak engelleme arabellek hazırlamak ara 20 (PBST).
  4. Tedavi kapsid çözümleri plaka kaldırın. 200 µL/iyi engelleme arabelleği ekleyin. Oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya veya gecede, saat 4'te mühürlü ° C.
  5. Biotinylated aptamer M6-2 18 , 29 için çözümler ve biotinylated sentetik HBGA kan tip A veya biotinylated tipi H. hazırla ligand bağlayıcı
    1. Dilute nükleaz ücretsiz su 1 µM için biotinylated aptamer. Her tedavi için toplam 200 µL için yeterli bir çözüm olduğundan emin olun. 30 µg/ml engelleme arabellekte seçilen biotinylated HBGA oranında seyreltin. Her tedavi için 200 µL toplam birim için yeterli bir çözüm olduğundan emin olun.
      Not: daha az HBGA kullanmak için 10 µg/mL HBGA % 0.25 yağsız süt-PBST içinde yedek olabilir. Konsantrasyonları biotinylated M6-2 ve HBGA edilmiş daha önce en iyi duruma getirilmiş ve bildirdi.
  6. Engelleme arabellek kaldırmak ve plakaları 3 kez 200 µL/iyi PBST ile yıkayın. Plaka üzerinde baş aşağı steril kağıt havlu kalan nemi kuru pat.
  7. Ekle 100 µL/kuyu ligand ciltleme çözümleri, ısıl işlem-ligand birleşimi başına 2 kuyu sağlama. Oda sıcaklığında 1 h için bir orbital Çalkalayıcı-60 rpm'de üzerinde bir kapak ile örtülü plaka kuluçkaya.
    Not: 2 kuyu her işlenmemiş capsids ve tamamen denatüre capsids her ligand için sırasıyla pozitif ve negatif denetimleri eklediğinizden emin olun. Ayrıca, 2 içerir " yok kapsid " wells her ligand olarak plaka için arka plan denetimi.
  8. Ligand çözümleri kaldırmak ve wells 3 kez 200 µL/iyi PBST ile yıkayın. Plaka baş aşağı steril kağıt havlu üzerinde kalan nemi kuru pat.
  9. Ekle 100 µL/iyi 0.2 lik µg/mL streptavidin horseradish peroksidaz PBS içinde. Nazik bir orbital Çalkalayıcı sallayarak ile oda sıcaklığında 15 dk için kuluçkaya.
    Not: Farklı streptavidin-horseradish peroksidaz conjugates farklı konsantrasyonlarda olacaktır. Kullanıcı danışın ' konsantrasyonları enzim ELISA uygulamalar için ideal aralığı için s el ve en uygun olduğundan emin olun.
  10. Eşlenik çözüm kaldırın. 3 kez 200 µL ile/iyi PBST yıkayın. Plaka baş aşağı steril kağıt havlu üzerinde kalan nemi kuru pat.
  11. Ekle 100 µL/iyi 3,3 ', 5,5 '-tetramethylbenzidine (TMB) substrat ve 5-15 dk. gözlemlemek negatif kontrol wells herhangi için renk ve sürekli Çoğalt plakalar arasında aynı kez geliştirmek emin olun için geliştirmek renk izin. De kullanılan plaka okuyucu Absorbans dizi unutmayın.
    Not: Gelişmekte olan kez kullanılan ligandlar/reaktifler kalitesine göre farklı olabilir.
  12. Reaksiyon 100 µL/iyi 1 M fosforik asit ile gelişimini durdurmak. Hemen okumak plaka 450 nm. Verileri kaydetmek.
    Not: Asit getirilmesi genellikle tepki büyük ölçüde yavaşlatır ama tamamen bitmiyor. Durdurulan plaka Absorbans okumadan önce uzun bir süre için terk etmeyin.

2. Plaka tabanlı tahlil sonuçlarının analizi

  1. bir elektronik tablo programında ham Absorbans verileri kaydetmek. Ortalama absorbances spesifik tedavi ve ligand ile iyi çifti üretmek. Bu ortalamalar için tüm sonraki analizleri kullanın.
    Not: hiçbir çiftleri Wells önemli ölçüde farklı değerlere sahip emin olmak için her iki iyi absorbances karşılaştırır.
    2. Mutlak kapsid bütünlüğü (tüm bağlama) analiz etmek, ham Absorbans, çıkarma
  2. " yok kapsid " diğer her örnek Absorbans değeri denetimden.
    Not: Alternatif olarak, bağlama nedeniyle daha yüksek sipariş (ikincil, üçüncül, Kuvaterner) yapısı kaybı kaybı doğrudan çözümlenebilir. Negatif (kapsid) denetim Absorbans çıkarılarak yerine, tamamen denatüre kapsid denetiminin değerini çıkarın. Tüm bağlama sinyal spesifik olmayan cihazlar için bağlayıcı yanı sıra nedeniyle kapsid sıralı bağlama nedeniyle bu kaldırır. Her iki yöntem benzer sonuçlar üretir böylece HBGA ve aptamer M6-2 küçük bağlama tamamen denatüre kapsid için görüntüler. Nonspesifik aptamer bağlamaya atfedilen yanlış olumlu sinyal kullanmak için hangi analiz seçerken dikkate gerekir.
  3. Negatif veya denatüre denetim-düzeltilir absorbances ile 100 ile tedavi absorbances onların anılan sıraya göre pozitif (tedavi) tarafından kontrol absorbances ve çarpma bölme. Bu sinyal tedavi edilmezse denetime göre tedavi kapsid yüzdesi sağlar.
    4. Bağlama sinyal her ligand kapsid dizisine atfedilebilecek için derecesi tahmin etmek için
  4. çıkarma " yok kapsid " olumsuz ilk absorbances denetiminden ve denatüre kapsid ayarlanan Absorbans al. Bu pozitif kontrol sinyalini ayarlanan Absorbans tarafından bölmek ve 100 ile çarpmak. Bu sinyal denatüre kapsid/kapsid diziye ligand taşıması nedeniyle belirgin yüzdesini verir.

3. DLS virüs toplama ısıl işlem sonra tespit için

Not: Belgili tanımlık merdiven aşağı-ebilmek var olmak belgili tanımlık bilgisayar yazılımı için belirli ve enstrüman kullanılan, ama olabilir uyarlanmış ve benzer cihazlara uygulanan.

  1. Oluştur yeni bir boyutu SOP DLS enstrüman yazılımı kullanarak: malzeme Protein, Dispersant = PBS, sıcaklık = = 25 ° C de denge zaman = 0 sn, hücre tipi tek kullanımlık küvet (küçük hacimli, ZEN0040), ölçüm açısı = 173 ° Backscatter, = Ölçüm süresi = otomatik, ölçümleri sayısı = 3, ölçümler arasındaki gecikme = 0 sn, veri işleme: analiz modeli genel amaçlı (normal çözünürlük) =. Tüm diğer parametreler için varsayılan ayarları kullanın.
  2. Yazılım içinde yeşil çalışma ok seçin ve örnek adı.
  3. Adımları 1.1.1 VIP ısı tedavisi için 1.1.4 aracılığıyla izleyin.
  4. Dilute ısı VIP 1:10 1 x PBS 5 µg/mL nihai bir konsantrasyon için tedavi. (İsteğe bağlı) Örnek 1 µm gözenek boyutu toz parçacıkları kaldırmak için filtre; Çok daha fazla ışık küçük parçacıklar daha büyük partiküller dağılım gibi DLS toza, çok hassas.
  5. İçine küçük hacimli tek kullanımlık seyreltilmiş VIP transfer 50 µL küvet. Araç örnek odasına küvet ekle.
  6. Çalıştır başlatma ve kullanma ' Correlogram ', ' Cumulants uygun ', ve ' uzman tavsiye ' veri kalitesini değerlendirmek için sekmeleri.
    1. Polydispersity dizin değeri 0.3 Kalite Ölçüm. içinde temsil eden, daha az olduğunu çalışma sırasında kontrol ‘ çok görünüm ’ sekmesinde, korelasyon katsayısı sabit ve kapatmak için ama değil daha--dan 1, kısa bir süre olduğundan emin olun ve damla kapalı bir süre sonra parçacık boyutu karakteristik 0 keskin. Kullanım ‘ uzman tavsiye ’ veri kalitesi ölçümleri sırasında geri bildirimler sekmesini.
      2. Ölçüm işlemi tamamlandıktan sonra
    2. tekrar polydispersity dizin değeri 0.3 daha az olduğunu kontrol. Cumulants satır aşağıdaki veri noktaları yakından buna uygun emin olun ‘ Cumulants uygun ’ sekmesini
  7. Z-ortalama parçacık çapı ortalama her örnek olarak partikül büyüklüğü her ölçüm için rapor almak. Nm ° c sıcaklığında vs ile çap arsa

4. DLS gerçek zamanlı virüs toplama işlemi tespit

Not: belgili tanımlık merdiven aşağı-ebilmek var olmak belgili tanımlık bilgisayar yazılımı için belirli ve enstrüman kullanılan, ama olabilir uyarlanmış ve benzer cihazlara uygulanan.

  1. Oluştur yeni bir boyutu SOP DLS enstrüman yazılımı kullanarak: malzeme Protein, Dispersant = PBS, sıcaklık = = istenen, denge zaman = 0 sn, hücre tipi kuvars küvet, ölçüm açısı = 173 ° Backscatter, = ölçüm süresi otomatik, = Ölçümler sayısı = 50, (artan veya azalan bağlı olarak toplama oranı olabilir) ölçümleri arasında gecikme = 0 sn, veri işleme: analiz modeli birden çok dar modları (yüksek çözünürlük) =. Tüm diğer parametreler için varsayılan ayarları kullanın.
  2. Açın ve yeni bir örnek adı için belgili tanımlık bilgisayar yazılımı içinde çalışma ok seçin ve sıcaklık denge ulaşmak araç izin.
  3. Bir microcentrifuge tüp 5 µg/mL ve bir birim arasında 200-500 µL. konsantrasyon, 1 X PBS VIP askıya girdap süspansiyon.
  4. VIP süspansiyon için 5-10 s de-gaz için masa üstü bir santrifüj içinde aşağı spin. Bu boyut ölçümleri ile müdahale ısıl işlem sırasında kabarcık oluşumu önlemeye yardımcı olur.
  5. Transfer VIP süspansiyon için küçük hacimli kuvars küvet-kabarcıklar kaçının ve yavaş yavaş küvet duvara pipet. Araç sıcaklık denge ulaştığında, örnek odasına küvet ekle.
  6. Bekle 10 s equilibrate örnek sıcaklık için Çalıştır başlatın. Çalışmanın başında bir süreölçer başlatın. İlk ölçüm sonunda sayacý durdurmak. Bu zaman ilk zaman noktası olarak alır. Yazılım tarafından kaydedilen ölçüm döneminden sonraki zaman puan almak.
  7. Çalıştır başlatın ve correlogram, uygun dağıtım ve veri kalitesini değerlendirmek için uzman tavsiyesi izlemek.
    Not: PDI mutlaka 0,3 numune olarak bu ölçümler için daha az polydisperse sırasında toplama olması bekleniyor olamaz.
    1. Korelasyon katsayısı sabit ve kapatmak için ama fazla 1 kısa sürede ve keskin bir veya daha fazla daha sonraki zamanlarda, parçacık boyutu karakteristik kapalı damla emin olun.
    2. Dağıtım hattı aşağıdaki veri noktaları yakından uygun olduğundan emin olun.
  8. Boyutu veri analiz. Her ölçü ve başlangıç zaman noktası arasındaki zaman farkı
    1. karar vermek her zaman noktasından. Ölçüm süreleri hepsi tam olarak aynı değildir.
    2. Bir yoğunluk dağıtım kullanarak kayıt boyutu her ölçüm/saat noktası için en büyük alanları ile doruklarına.
    3. Vs zaman dak nm pik çapları arsa

5. TEM numune hazırlama

TEM için tasarlanmış
  1. elde karbon destek film (nikel) Izgaralar.
    Not: önerilen reaktifler ve kullandıklarında daha kullanmak için çekirdek tesis tesis mikroskop ile başvurun. Izgaralar kurutucu ya da neme maruz en aza indirmek için bir vakum odası içeren bir kutuda saklayın.
  2. Ailesini yaklaşık 5 cm x 5 cm parçalarına filtre kağıt. Cam Petri yemekler elde etmek ve kendi kendine uygun kapanış ters mikroskobu kullanılmak üzere tasarlanmış cımbız.
  3. Parafin film yaklaşık 2.5 cm x 5 cm parçası kesti. Yer benchtop.
  4. Isıl norovirus GII.4 Sydney capsids
    1. tam adımları 1.1.1 - 1.1.5 dışında yukarıda açıklandığı gibi ısıl işlem yordamı izleyin: 10 mM HEPES (pH 7,4) tedavi yerine PBS için kullanın ve daha da capsids sulandırmak değil sonra tedavi (tutun çözüm 50 µg/mL). Tedavi kapsid çözüm parafin film üzerine tüm ~ 15 µL damla pipette.
  5. Cımbız, onları kılavuz, tutmak için kenarında kapatmak izin ile kılavuz kenar kapmak ve kılavuz karbon-yan-aşağı tedavi çözüm damla üstüne yerleştirin. Kapsid kılavuza takmak izin vermek 10 min için kuluçkaya izin.
    1. Sonra tedavi kapsid damlacık sıraya yerleştirilmiş 10-15 µL damlacıklar şeklinde gerekirse yıkar 10 mM HEPES çözümün kapsid hazırlık saflık bağlı olarak ekleyin.
    2. Sonra 10 dk, damlacık kılavuzla al. Uzakta fitil damlacığı için bir yer neredeyse bir filtre kağıt parçası için dikey kılavuz. 10-15 µL HEPES tampon damlacık kılavuzla eline alıp, yıkama için başka bir parça filtre ile 30 s sonra fitil uzak dur
  6. % 2 uranyl asetat çözüm 15 µL damlacık boş bir alanı parafin filmde yerleştirin.
    1. Uranyl asetat kılavuzuna damlacık almak ve en-in belgili tanımlık eriyik kaldırdığınızdan emin olmak uranyl asetat 45 s. fitil uzakta tutun. Kılavuz karbon-yan bir kağıda filtre kılavuz değil dikkatli olmak, orayı " sopa " cımbız üzerinde nem için. Filtre kağıdı ile ızgara üzerinde açık bir cam Petri kabına yerleştirin.
      Not: kılavuzlar ve onların Elektrostatik ilgisini olacak kalmış olur plastik Petri yemekler, kullanmayın çanak.
  7. Tüm tedaviler için yineleyin. Izgaralar ile Petri kabına yarıya indirir TEM ile gözlemleyerek önce kuru bir desiccator gecede yerleştirin.
  8. Danışın ilgili kurum mikroskobu tesisinde hazırlanan Izgaralar gözlemleyerek ile ilgili olarak. Bazı İmkanlar tesislerini operasyonunda eğitilmek için kullanıcının izin vermek ' s alet. Kurulum ve gözlem belirli bir mikroskop ile ilgili belirli ayrıntıları olduğunu beyond bu makalenin kapsamı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan norovirus GII.4 Sydney capsids (VIP) yapısal bütünlüğünü birkaç roman Moore ve ark. tarafından sunulan gibi yöntemlerle değerlendirildi 17. ilk, bir deney yapıldı capsids bütünlüğünü yeteneklerini bir sözde reseptör/co-factor (HBGA) veya ssDNA aptamer (M6-2) bağlamak için bir fonksiyonu olarak edildi (Resim 1) karşılaştırıldığında. Görüntülenen sonuçları daha önce Moore ve ark. tarafından sunulmuştur

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İletişim kuralı ve burada açıklanan teknikleri insan norovirus kapsid bütünlüğü/işlevleri değerlendirmek için bir yol sağlar. Bu yöntemler mekanik kavrama içine belgili tanımlık virüs karşı inactivation tedavi etkileri elde etmek için kullanılabilir ve potansiyel olarak daha geleneksel inactivation değerlendirme yöntemleri gibi RT-qPCR veya plak tahlil destekleyebilirsiniz. Örneğin, kimyasal veya fiziksel inactivation plak tahlil yalnız tarafından değerlendirilmesi virüs inactivation derecesini ölçüsü ama o inactivation ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser NoroCORE proje ile tarım ve gıda araştırma girişimi rekabetçi Grant No 2011-68003-30395 ABD Tarım Bakanlığı, Ulusal Enstitüsü gıda ve tarım tarafından desteklenmiştir. Açık erişim ücret karşılığında fon ABD Tarım Bakanlığı tarafından sağlandı. Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) lütfen bizi saf capsids ve Valerie Lapham TEM görüntülerle yardımını sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Frank N. Barry bize sunulan deneyler başlatmak yardımcı olduğunuz için teşekkür etmek istiyorum.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< Yüksek Dereceli Norovirüs Kapsid Yapısının Kaybını Değerlendirmek için Güçlü> Plaka Bazlı Bağlama Testi< / güçlü >
96 kuyulu, orta bağlayıcı polistiren ÇED plakasıFisher (Costar)07-200-36
96 oyuklu plaka için kapakThermo Fisher3098
Parafin filmi (Parafilm)Thermo FisherPM999
1x PBS (pH 7.2)Yaşam Teknolojileri20012-050
Polisorbat 20Sigma-AldrichP9416
1x PBS (pH 7.2) +% 0.05 Polisorbat 20N/AN/A
Saflaştırılmış, birleştirilmiş insan norovirüsü GII.4 kapsidlerN/AN/A
Bireysel 0.2 ml PCR tüpleriGenesee Scientific22-154G
2 termosiklerBio-Rad
Masaüstü mini santrifüjFisher Scientific12-006-901
Yağsız süt katılarıThermo FisherLP0031B
Sentetik histo-kan grubu tip A disakkarit, biyotinileGlycotech01-017
Biyotinillenmiş aptamer M6-2 (stok konsantrasyonu 100 ve mikro; Nükleaz içermeyen suda M): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3'Entegre DNA TeknolojileriN/A
Streptavidin-yaban turpu peroksidaz konjugatı (ELISA sınıfı), Yaşam Teknolojileri SNN2004Yaşam Teknolojilerikullanıyoruz SNN2004
3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) substratı, oda sıcaklığındaThermo Fisher50-76-00
1 M fosforik asitN/AN/A
Mikroplaka okuyucu 450 nm okuma yeteneğineTecanInfinite m200 Pro
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Plaka Bazlı Test Sonuçlarının Analizi
Microsoft Excel veya benzeri bir programN/AN/A
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Dinamik Işık Saçılma Deneyleri
Zetasizer ZSP veya benzeri parçacık boyutu analiz cihazıMalvern InstrumentsN/A
VorteksFisher Scientifc02-215-365
Kuvars küvetHellma104-002-10-40
Küçük hacimli tek kullanımlık küvet (VLP kullanımını azaltmak için)Malvern InstrumentsZEN0040
NameCompanyKatalog NumarasıYorumlar
Transmisyon Elektron Mikroskobu Numune Hazırlama
Karbon destek filmli nikel elektron mikroskobu ızgaralarıLadd Research10880-100
Kendiliğinden kapanan ters elektron mikroskobu cımbızıTed Pella5372-NM
Kalitatif filtre kağıdıSigma-Aldrich (Whatman)WHA1002055
Cam petri kaplarıSigma-AldrichBR455743
100 mM stok HEPES çözeltisi (pH 7.2)N/AN/A %
2 uranil asetatN/AN/A
1861096 sahip

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920(2015).
  2. Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
  3. Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
  4. Law, J. W. -F., Ab Mutalib, N. -S., Chan, K. -G., Lee, L. -H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770(2015).
  5. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  6. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
  7. Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
  8. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  9. Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124(2017).
  10. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586(2014).
  11. Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
  12. Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
  13. Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
  14. Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
  15. Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
  16. Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
  17. Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
  18. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
  19. Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
  20. Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087(2013).
  21. Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
  22. Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805(2014).
  23. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not? Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
  24. Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
  25. Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
  26. Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
  27. Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
  28. Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
  29. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
  30. Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
  31. Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
  32. Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
  33. Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
  34. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  35. Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
  36. Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
  37. Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human NorovirusViral CapsidLigand BindingDynamic Light ScatteringTransmission Electron MicroscopyAptamer BindingCapsid IntegrityHeat TreatmentVirus InactivationCapsid Aggregation

Related Articles