Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

18.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56448

⸱

22 Kasım 2017

 ,  ,  ,  , 
1Influenza Division, Centers for Disease Control and Prevention, 2Battelle

Bu makalede

Özet

Grip nötralize antikorlar grip enfeksiyonlar korunması ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Microneutralization deneyleri insan sera nötralize antikor ölçmek ve sık sık grip insan seroloji için kullanılır. Biz bir microneutralization tahlil nötralize antikor titreleri çağdaş 3C.2a ve 3C.3a A(H3N2) virüs grip aşısı ya da enfeksiyon takip için ölçmek için MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak açıklar.

Özet

Karşı hemagglutinin (HA) grip virüsleri nötralize antikor koruma için grip enfeksiyonları ile ilişkili olan ana Bağışıklık mekanizması olarak kabul edilir. Microneutralization (MN) deneyleri kez grip aşısı ya da enfeksiyon sonra insan sera içindeki nötralize antikor yanıtları ölçmek için kullanılır. MN deneyleri için yaygın olarak kullanılan hücre yüzey Madine Darby köpek böbrek (MDCK) hücrelerdir. Ancak, şu anda 3C.2a ve 3C.3a A(H3N2) grip virüsleri elde etmiş dolaşan reseptör bağlama özgüllük değişmiş. MDCK-SIAT1 hücre kültürünü artan α-2,6 sialik galaktoz moieties yüzeyi ile geliştirilmiş infektivite ve daha geleneksel MDCK hücreleri daha sadık çoğaltmalar için çağdaş A(H3N2) virüsler sağlamak için kanıtlamıştır. Burada, bu çağdaş A(H3N2) virüsleri nötralize antikor titreleri ölçmek için en iyi duruma getirilmiş MN tahlil MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak açıklar. Bu protokol için ısı inaktive sera nötralize antikorlar içeren ilk seri olarak, sonra antikor için virüs bağlamak için sera izin vermek için de grip A(H3N2) virüs/100 TCID50ile inkübe seyreltilmiş. MDCK-SIAT1 hücreleri sonra virüs-antikor karışıma eklenir ve 18-20 h 37 ° c, % 5 CO2 A(H3N2) virüs MDCK SIAT1 hücre bulaştırmak için izin vermek için inkübe. Gecede kuluçka sonra plaka sabittir ve virüs her miktar de anti-grip kullanarak bir enzim bağlı immunosorbent assay tarafından (ELISA) sayısal nükleoprotein (NP) monoklonal antikorlar. Antikor titresi nötralize ≥50% virüs infektivite inhibisyonu sağlar yüksek serum seyreltme karşılıklı tanımlanır.

Giriş

Grip virüsleri morbidite ve mortalite insan nüfusunun her yıl neden devam. HA büyük yüzey glikoprotein grip virüsleri olduğunu. Nötralize antikorlar HA hedefleme grip enfeksiyonu1,2korunması ile ilişkili olan ana Bağışıklık mekanizması vardır. Hemaglütinasyon inhibisyon (hı) deneyleri ve MN deneyleri grip enfeksiyonu veya aşı3sonra insan sera içindeki antikor yanıtları ölçmek için yaygın olarak kullanılan iki yöntem vardır. HI tahlil virüs hemaglütinasyon kırmızı kan hücrelerinin antikor inhibisyonu ölçer ve bir vekil tahlil olarak kabul edilir. HI, MN tahlil grip enfeksiyonu hücre kültürlerinde nötralize insan sera antikor düzeyleri doğrudan ölçebilirsiniz. MDCK hücreler kez grip virüsü yalıtım modunda kullanılır ve4MN deneyleri.

Grip virüsleri sürekli antijenik drift ve kaydırma mutasyonlar reseptör bağlama özgüllük virüslerin değiştirebilirsiniz HA proteinler olarak alınıyor, tabi. 2014 beri A(H3N2) virüslerin yeni kümeler ortaya çıktı ve sezon kadar dolaşmaya devam etti. Çoğunluk bu virüslerin genetik grup 3C.2a ve HA proteinlerin Filogenetik analizi dayalı 3C.3a ait. Dolaşımdaki 3C.2a virüsler kırmızı kan hücreleri hemagglutinate yeteneği azaltılmış vardı ve bu nedenle HI deneyleri5tarafından karakterize olamaz. Nötralizasyon deneyleri6hemagglutinate değil bu virüslere antikor yanıtlarını ölçmek için kullanılması gerekir. Ayrıca, çalışmalar bu çağdaş A(H3N2) virüsler önceki A(H3N2) virüsler ile karşılaştırıldığında reseptör bağlama özellikleri değiştirmiş ve adapte Kültür mutasyonlar ve in vitro hücre pasajlı zaman çok biçimlilik birikir eğilimindedir göstermiştir kültürler7,8,9. Geleneksel MDCK hücreleri ile karşılaştırıldığında, MDCK-SIAT1 Matrosovich vd tarafından geliştirilen bir hücre çizgidir MDCK hücreleri cDNA insan α2, 6-sialtransferase (SIAT1) ile istikrarlı transfection. Bu hücre kültürünü artan miktarda α2, 6 sialik galaktoz moieties ve azalmış miktarda α2, ailenin MDCK hücreleri10daha 3 sialik asit moieties ifade eder. MDCK-SIAT1 hücreleri A(H3N2) virüs MDCK hücreleri11' e göre yalıtım oranlarını artırmak için gösterilmiştir. Son zamanlarda, Lin vd. virüs MDCK SIAT1 hücre hatlarında MDCK hücreleri7ile karşılaştırıldığında kültürlü yaşındayken yeni ortaya 3C.2a ve 3C.3a insan A(H3N2) grip virüsleri için daha sadık virüs çoğaltmalar ve daha iyi virüs infektivite elde edildi bildirdi. Böylece, MDCK-SIAT1 hücreleri daha iyi MN deneyleri antikor yanıt A(H3N2) virüs son kümeleri için karakterize etmek için uygundur.

Burada bir MN tahlil antikor yanıt çağdaş 3C.2a ve 3C.3a A(H3N2) virüs insan sera içinde ölçmek için MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak açıklar. Yumurta veya hücreler virüs bu tahlil kullanılabilir. İnaktive ısı sera nötralize antikorlar içeren ilk seri olarak, sonra antikor virüse bağlamak için sera izin vermek için de grip A(H3N2) virüs/100 TCID50ile inkübe seyreltilmiş. MDCK-SIAT1 hücreleri sonra virüs-antikor karışıma eklenir ve 18-20 h 37 ° c, % 5 CO2 -MDCK-SIAT1 hücreleri enfekte ve çoğaltmak A(H3N2) virüs izin vermek için inkübe. Gecede kuluçka sonra plakaları sabittir ve her iyi virüs miktarı bir ELISA anti-grip A NP monoklonal antikorları kullanarak tarafından sayılabilir. NP tespiti antikorları nötralize yokluğu ve virüs enfeksiyonu varlığı gösterir. Antikor titresi nötralize ≥ % 50 inhibisyonu virüs infektivite sağlar yüksek serum seyreltme karşılıklı tanımlanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm grip virüsleri uygun biyogüvenlik düzeyi gereksinimlerine göre ele alınmalıdır (BSL-2 veya daha yüksek) təhlillər ve Biyomedikal Laboratuvarı (BMBL)12Biyogüvenlik tanımlandığı gibi.

1. reaktifler ve başlangıç materyali hazırlanması

  1. MDCK-SIAT1 hücreleri ve steril hücre kültür ortamı hazırlamak
    1. MDCK-SIAT1 hücre kültür orta ile yüksek glikoz 500 mL, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) kullanarak hazırlamak, % 10 v/v ısı inaktive fetal sığır serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum pyruvate, 1 mg/mL G418 sülfat (örn., geneticin) ve 100 U/ml penisilin ile 100 µg/mL streptomisin (isteğe bağlı). Filtrasyon 0.2 µM gözenek boyutu membran aracılığıyla tarafından sterilize. G418 sülfat MDCK-SIAT1 hücrelerdeki plazmid istikrarı sağlamak için eklenir.
    2. MDCK-SIAT1 hücre kültürünü hazırlayın. Bir 162 cm2- 30 mL steril hücre kültür ortamının içeren doku kültürü flask(s) şişeler 2-2.5 x 106 MDCK-SIAT1 hücreleri ile tohum ve % 5 CO2 37 ° C'de 2 gün kuluçkaya; Bu doku kültürü bulaşıcı doz (TCID) belirlenmesi ve MN için kullanılacaktır deneyleri.
      Not: MDCK-SIAT1 hücreleri nazikçe Dr. M. Matrosovich, Marburg, Almanya10tarafından temin edilmiştir. Bu hücre kültürünü de ticari olarak elde edilebilir ( Tablo reçetesigörmek).
  2. 500 mL DMEM yüksek glikoz, % 0.3 sığır serum albumin (BSA) kesir V, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 20 mM HEPES kullanılarak steril virüs yayma ortam hazırlamak. Filtrasyon 0.2 µM gözenek boyutu membran aracılığıyla tarafından sterilize.
  3. 0,01 M PBS pH 7.2 içeren fosfat tamponlu tuz (PBS) %0,75 (v/v) eskiden şiling şimdi domuz kırmızı kan hücreleri (gpRBCs) hazırlayın.
  4. DMEM yüksek glikoz, %1 sığır albümin kesir V (BSA), 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 20 mM HEPES kullanarak steril virüs seyreltici hazırlayın. İle 0.2 µm gözenek boyutu membran filtrasyon tarafından sterilize ve taze her tahlil için hazırlanın.
  5. PBS (0.01 M PBS, pH 7.2) % 80 soğuk aseton olarak soğuk hücre sabitleştirici hazırlayın.
  6. PBS (0.01 M PBS pH 7.2) kullanarak arabellek yıkayın hazırlayın ve %0,3 (v/v) ara-20.
  7. PBS (0.01 M PBS, pH 7.2) kullanarak antikor seyreltici hazırlamak, %0,3 (v/v) ara-20 ve % 5 yağsız süt Makinası.
  8. Anti-grip A NP fare Monoklonal antikor klon A1 ve A3 havuzu birincil antikorkullanın. Titrasyon tarafından belirlendiği gibi en iyi konsantrasyon seyreltici antikor oranında seyreltin.
  9. Kullanım keçi Anti-fare IgG at turp peroksidaz (HRP) ikincil antikorBirleşik. Titrasyon tarafından belirlendiği gibi en iyi konsantrasyon seyreltici antikor oranında seyreltin.
  10. O- boya dihydrochloride (OPD) 0,05 M fosfat sitrat tampon pH 5 kullanılarak peroksidaz substrat hazırlayın. 1 kapsül/100 mL deiyonize H2O. erimesi 1 OPD tablet (10 mg) çözülerek 0,05 M fosfat sitrat arabellek hazırlamak / 20 mL fosfat sitrat arabelleği kullanımdan hemen önce.
  11. 0, 5 M sülfürik asit OPD durdurmak çözümolarak kullanın. 972 havaalanı mL deiyonize H2O kimyasal başlıklı 18 M sülfürik asit stokunun 28 mL ekleyin.
  12. İnsan ve hayvan sera tedavisinde
    1. Isı MN deneyleri 56 ° c su banyosunda 30 dk önce tahlil için kullanılan insan sera devre dışı bırakabilirsiniz. Hemen kullanma veya gerekirse, mağaza için en fazla 24 h 4 ° C'de sera çözdürülen; daha uzun depolama süresi gerekiyorsa, sera-20 ° C'de dondurulmuş veya soğuk depolar.
    2. MN deneyleri reseptör yok enzim (RDE) ile kullanılan hayvan sera tedavi ve ısı şöyle tahlil önce devre dışı bırakın.
      1. Sera 37 ˚C su banyosu içinde çözülme sonra buz üzerinde yerleştirin. Hayvan serum örneği 1 hacmi RDE 3 cilt ile karıştırın. 18-20 h 37 ˚C, kuluçkaya.
      2. Isı tedavi RDE sera 56 ˚C PBS, pH 7.2 her örnek için bir final öncesi seyreltme 1:10 30 dk. 6 eklemek miktarlar için devre dışı. Gerekirse, en fazla 24 h için 4 ° C'de çözdürülen sera depolar; daha uzun depolama süresi gerekiyorsa, sera-20 ° C'de dondurulmuş veya soğuk depolar.
        Not: Bind grip virüsleri HAs için ve grip özel anti bağlama inhibe çeşitli sialik asit glukanlardir hayvan sera içerebilir-HA antikorlar. Bu nedenle, RDE için gereklidir bu non-spesifik viral HA bağlayıcı serum örneklerinde kaldırmak için MN deneyleri önce tüm hayvan sera tedavi.

2. MDCK-SIAT1 hücre kültürü geçirilmesi

Not: Tüm hücre kültürleri biyolojik Emanet kontaminasyonu önlemek için kabine gerçekleştirilmesi gerekir.

  1. Hücre monolayer 162 cm2 şişeler içinde hücre kültür ortamından dikkatle boşaltmak. Hücreleri monolayer tripsin-EDTA ile durulama tarafından trypsinize. 5 mL tripsin-EDTA hücre monolayer kapsayacak şekilde ekleyin. 37 ° C'de, monolayer (5-10 dk) ayırır kadar % 5 CO2 kuluçkaya. MDCK-SIAT1 hücre kültür ortamının 15 mL trypsinized hücreleri, yukarı ve aşağı ayrı hücreler pipet içeren her şişe ekleyin.
  2. Bir hemasitometre ve trypan hücre sayar belirlemek için mavi ve canlılığı kullanın. Yeni 162 cm2 doku kültürü şişeler ile 2-2. 5 x 106 hücre /flask hücre kültür ortamının 30 mL içeren hücrelerde tohum ve % 5 CO2 37 ° C'de 2 gün kullanılmak üzere TCID ve MN deneyleri için kuluçkaya. Senaryo Özeti 4-5 x 106 hücreler/şişesi tohum ve virüs yayma kullanmak için 2 gün için % 5 CO2 37 ° C'de kuluçkaya.









      3. figure-protocol-1








      1. figure-protocol-2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Virüs stoklarının infektivite belirlenmesi MN tahlil ilk adımıdır. Şekil 2 virüs stoklarının TCID50 belirlemek için plaka düzeni gösterilmektedir. Bilinmeyen infektivite ile virüs hisse senetleri için virüs birden çok ön dilutions, örneğin hem 10-2 ve 10-3, virüsün infektivite hesaplamak için en iyi titrasyon eğrisi yakalamak için titre. MN assay olarak kullanılan virüs tutarı 100 TCID50/well (50 µL) standart. En az...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

MN tahlil için grip seroloji grip enfeksiyonu veya aşı aşağıdaki antikor yanıt algılamak için kullanılan ana deneyleri biridir. MN deneyleri oluşturulan titreleri genellikle birçok grip seroepidemiology çalışma sonucunu birincil kullanılır. MN deneyleri sero-tanı ve aşı immünojenisite değerlendirilmesi için de yaygın olarak kullanılmaktadır. Uluslararası arası laboratuvar çalışmalar birden fazla laboratuvarları14' te gerçekleştirilen MN deneyleri karşılaştırmak için yapılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması rapor. Bulgular ve sonuçlar bu yayındaki yazarlar ve dün Gösterim merkezleri hastalık kontrol ve Önleme ve finansman ajansı için yapıldı.

Teşekkürler

Bu yazının hazırlanmasında Dr. Xiuhua Lu, Dr Feng Liu ve Bayan Ashley Burroughs grip bölümü CDC onların eleştiri ve yardım için teşekkür ederiz. Biz Dr Adrian Reber grip bölümü CDC şekil 3grafik hazırlama konusunda onun yardım için teşekkür ederim. Son olarak, Dr. M. Matrosovich, Marburg, Almanya MDCK-SIAT1 hücreleri sağlamak için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco' Yüksek Glikozlu Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)Yaşam Bilimleri11965Steril Hücre Kültürü, Virüs Yayılımı ve Virüs Seyreltici Ortamın kritik bir bileşeni
Fetal sığır serumu (FBS) HidroklonSH30070.03
Sığır Serum Albümini (BSA) Fraksiyon V, ProtassızSigma-Aldrich3117332001
L-GlutaminYaşam Bilimleri25030-081
Sodyum piruvatYaşam Bilimleri11360-070
Geneticin G-418 disülfat tuzu Sigma-AldrichA1720-5G   
HEPESYaşam Bilimleri15630-080
Penisilin / StreptomisinYaşam Bilimleri15140-122
AsetonVWR67-64-1% 80 konsantrasyonda
kullanılır Sodyum Perborat ile Fosfat-Sitrat Tamponu Sigma-AldrichSLBF2806V
O-Fenilendiamin Dihidroklorür tabletiSigma-AldrichSLBQ1086V100 ml hücre kültürü sınıfı su başına 1 tablet
Sülfürik AsitFisher ScientificA510-P500Kullanılan 0.5M nihai konsantrasyon
Etanol, Denatüre, 4LVWREM-AX0422-3%70 konsantrasyonda kullanılır
Tripsin-EDTAYaşam Bilimleri
RDE II "Seiken"Denka Seiken370013
Tween 20Sigma-AldrichP1379-500ml
Anti-NP fare monoklonal AbMillipore havuzuMAB 8257 MAB 8258
Anti-fare IgG HRP KPL074-1802
96 kuyulu düz tabanlı plakalarThermo Scientific3455
Plaka okuyucuMoleküler CihazSpectromax 384 plus
Hücre Kültürü Şişesi 162 cm2 / Havalandırma KapağıCorning / VWR3151
1748048

Kaynaklar

  1. Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
  2. Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans--on the path to a universal vaccine? Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
  3. WHO Global Influenza Surveillance Network. Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf (2011).
  4. Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, discussion 73-34 39-51 (1999).
  5. WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the northern hemisphere influenza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201703_recommendation.pdf?ua=1 2017-2018 (2017).
  6. Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
  7. Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
  8. Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment? J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
  9. Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112(2016).
  10. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
  11. Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
  12. US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
  13. Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
  14. Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
  15. Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
  16. van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
  17. WHO. Recommended composition of infleunza virus vaccines for use in the 2015-2016 northern heamisphere infleunza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2015_16_north/en 2015-2016 (2015).
  18. WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2016-2017 northern hemisphere influenza season. , http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/201602_recommendation.pdf?ua=1 2016-2017 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mikronötralizasyon DeneyiH3N2 VirüsüELISA TespitiTCID50 HesaplamasıVirüs PropagasyonuSerum DilüsyonuAntikor Titresi
MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.