Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

40.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56482

⸱

4 Ocak 2018

 , 
1Department of Convergence Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center, 2Synaptic Circuit Plasticity Laboratory, Department of Structure and Function of Neural Network, Korea Brain Research Institute

Bu makalede

Özet

Bu iletişim kuralı gerekli transmisyon elektron mikroskobu negatif boyama, ayrıntılı yapısı ve IMMUNO-altın spesifik proteinlerin konumlarda exosomes belirlemek için etiketleme için ultrathin kesit dahil olmak üzere için çeşitli teknikler açıklanır.

Özet

Exosomes hücre dışı veziküller nano boyutlu vücut sıvıları tarafından salgılanan vardır ve onları salgılar hücre özellikleri temsil etmek için bilinir. İçeriği ve salgılanan veziküller morfolojisi hücre davranış ya da fizyolojik durum, örneğin hücre büyümesi, geçiş, bölünme ve ölüm yansıtır. Exosomes rolü son derece boyutuna bağlı olabilir ve exosomes boyutu 30 ila 300'e değişir nm. En çok kullanılan eksozom görüntüleme için diğer sonuçlar Cryo-transmisyon elektron mikroskobu, elektron mikroskobu tarama ve Atomik kuvvet mikroskobu dayalı iken negatif boyama yöntemidir. Tipik eksozom'ın Morfoloji negatif boyama ile değerlendirildi, bir fincan şekli olmakla birlikte, daha fazla ayrıntılı bilgi henüz net değildir. Bir eksozom yapısal çalışma ile iyi karakterize gerekli özellikle de sağlık ve ilaç alanlar var. Bu nedenle, işlev bağımlı Morfoloji eksozom detaylı yapısında belirli bir protein etiketleme gibi elektron mikroskobu teknikleri tarafından doğrulanması gerekir. Ayrıntılı yapısı gözlemlemek için ultrathin kesitli görüntülerini ve exosomes negatif lekeli görüntüleri karşılaştırıldı. Bu protokol için iletim elektron mikroskopi exosomes negatif boyama, Bütün Dağı IMMUNO-boyama, blok hazırlık, ince bölüm ve IMMUNO-altın etiketleme gibi görüntüleme için öneririz.

Giriş

Ekstrasellüler veziküller (EVs) hücreleri tarafından salgılanan lipid bilayer veziküller vardır ve büyüklükleri 30 ve 300 nm arasında değişmektedir. EVs veziküller Hodgkin Hastaligi1hastalarda kanıt ile 1978 yılında ilk bildirildi. Bu veziküller 40-120 nanometre boyutunda bulunduğu rapor edilmiştir. 1980 yılında, bu EVs pıhtılaşma sistemi ve tromboz, bir damar kanseri hastalar2içinde bir kan pıhtısı oluşumu katılmaktadırlar bildirildi. 30 yıl sonra EVs tümör işgali, bağışıklık kaçış ve anjiogenezi3tanıtmak için önemli bir faktör olarak bildirilmiştir. Buna ek olarak, EVs fonksiyonları alanlarda hücresel etkileşimlerin iltihabı, bağışıklık bozukluğu, nörolojik hastalık ve kanser4düzenleyiciler olarak incelenmiştir. EVs protein, mRNA ve mikroRNA5gibi belirli biomolecules içerdiğinden, teşhis ve tedavi uygulama onların potansiyel analiz6,7oldu. EVs exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticles, promininosomes, argosomes ve hücresel kökeni ve biyolojik fonksiyon3bağlı eksozom benzeri veziküller dahil olmak üzere alt gruplar oluşan bir kategori vardır. Buna ek olarak, onların Biyogenez üzerinde bağlı olarak, bu EVs microvesicles (döken microvesicles, 100-1000 nm) ve exosomes (30-300 nm)8,9bölünmüş olabilir. Bunlar arasında ya bir hücre iletişim bağışıklık yanıtı10, kanser11,12ve bulaşıcı hastalık13olarak bildirilmiştir.

Exosomes olarak bir biyomarker erken tanı için ilgi hızla artıyor ve arıtma ve exosomes karakterizasyonu moleküler görüntüleme teknikleri ile eşlik etmelidir. Farklı boyutlarda ve türleri exosomes, kendi kökeni ve işlev14, bağlı olarak, Morfoloji mikroskobu teknikleri gibi elektron mikroskobu yüksek çözünürlüklü tarafından ayrılır. Çoğu exosomes negatif lekeli transmisyon elektron mikroskobu (TEM)15,16,17tarafından görüntülenmiştir ve bu sonuçlar immunolabeling bütün Dağı vezikül içinde belirli bir protein tarafından teyit edildi 18. birkaç araştırma grubu aracılığıyla tarama elektron mikroskobu, Atomik kuvvet mikroskobu19,20ve Cryo-TEM21,22yapısı bildirdin. Ancak, bu teknikler eksozom yapısı eğitim için yararlı olsa da, ya içinde bulunan spesifik proteinlerin konumunu gözlemlemek için yetersiz bunlar. Bu nedenle, belirli protein etiketleme ile exosomes görüntüleme için bir protokol tanıttı. Biz blok hazırlanması, ultrathin kesit ve immunostaining protein'ın detaylı eksozom konumda ascertaining için uygulanır. Bu negatif boyama ve geleneksel eksozom karakterizasyonu için kullanılan bütün Dağı immunostaining ile karşılaştırıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. blok hazırlık, kesit, boyama ve ya görüntüleme

  1. Santrifüjü 100.000 x g 1,5 saat23de tarafından gelen Kültür süpernatant HCT116 hücre exosomes cips. Kültür süpernatant kaldırmak ve dikkatle 1 mL 0.1 M sodyum cacodylate çözüm (pH 7,0) 1 h 4 ° C'de % 2.5 oxazolidin ile arıtılmış eksozom Pelet düzeltmek 0.1 M sodyum cacodylate için 160 mL distile su (DW) 4,28 g Kakodilik asit geçiyoruz. PH 7.4 0,1 M HCl o zaman ilâ 200 mL distile su ile yapmak için ayarlayın.
  2. Sabitleştirici kaldırmak ve granül 1 mL 0.1 M sodyum cacodylate arabelleği ile oda sıcaklığında durulayın. 10 dk süren her değişiklikle üç kez tekrarlayın.
  3. Sonrası 4 ° C'de % 2 Osmiyum tetroxide 1 h için 1 mL örnekleriyle düzeltmek
  4. Sabitleştirici kaldırmak ve durulama üç kez 0.1 M sodyum cacodylate ile tampon her 10 min.

Tüplerde ve aletlerde ardışık kromatografi işlemi; protein saflaştırma deneyi.



  • Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Sonuçlar

    Şu anda, exosomes transmisyon elektron mikroskobu tarafından boyutu ve şekli kategoride sınıflandırılır. Şekil 2 negatif lekeli eksozom ve bağışıklık etiketli eksozom tüm bağlama durumu gösterir. Şekil 3 kesitli eksozom ve immün etiketli exosomes ince kesit sonra gösterir. IMMUNO-altın belirli proteinlerin antikorları kullanarak boyama olumlu bir eksozom tanımlamak ve proteinler arasında eksozom türleri sınıflandırmak için kullan...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Tartışma

    Bu makalede ayrıntılı eksozom'ın yapısı gözlemleyerek ve onun belirli proteinlerin etiketleme için bir protokol sunar. Negatif boyama eksozom17görüntüleme için en iyi yöntem olarak kabul edilmiştir. Bu geleneksel teknik exosomes Kupası şeklindeki yapı göstermiştir. Ancak, bu fincan şekli bir kurutma işlemi nedeniyle oluşan yapay doku biçimidir. Cryo-TEM sonuçları exosomes sulu çözüm25,26yılında tamamen küresel bir yapısı olduğunu ortaya ko...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Açıklamalar

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Teşekkürler

    Bu araştırma Bio tarafından desteklenen & tıbbi teknoloji geliştirme programı Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) & Kore hükümeti tarafından finanse (MSIP & MOHW) (No. 2016M3A9B6904244). Biz de eksozom arıtma Medicinal Bioconvergence Araştırma Merkezi üyeleri teşekkür ederiz.

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    GluteraldehitEMS16200
    Sodyum kakodilat EMS12300
    Osmiyum tetroksit 1 g kristalEMS19100Yalnızca çeker ocak
    asetonundaJUNSEI1B2031
    Spurr ortamıTED PELLA18108
    Ultra-mikrotomLeicaUCT
    Uranil asetatEMS22400Tehlikeli kimyasal
    Kurşun sitratEMS17900
    Transmisyon Elektron MikroskobuHitachiH7600
    nikel ızgaraEMSG200-Ni
    Bakır ızgaraEMSG200-Cu
    glisinSIGMA022K5404
    Fosfat tampon salinSIGMAP4417
    Sığır serum albüminiAurion25557
    1. Antikorsaflaştırması manuel 
    Saflaştırılmış anti-insan CD274 (B7-H1, PD-L1) AntikorBioLegend329710Bütün montaj Immumogold
    Saflaştırılmış Fare IgG2b, κ Isotype CtrlBioLegend401202Tüm montaj Immumogold (Kontrol)
    2. Anti-fare igG konjuge 9-11 nm altın parçacıksigmaG7652
    Transmisyon Elektron MikroskobuJEOLJEM2200FS
    Kızdırma boşaltıcıJEOLJFC1100E
    Karbon ızgaraEMS121119
    ParaformaldehitEMS19210
    Formvar karbon kaplı Bakır Izgara (200 meh)EMSFCF200-CU
    Formvar karbon kaplı  Nikel Izgara (200 ağ)EMSFCF200-NI
    kullanın

    Kaynaklar

    1. Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
    2. Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
    3. Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
    4. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
    5. Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
    6. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
    7. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
    8. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
    9. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
    10. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
    11. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
    12. Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
    13. Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases? Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
    14. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
    15. Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
    16. Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
    17. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).
    18. Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
    19. Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
    20. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
    21. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
    22. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162(2016).
    23. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
    24. Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
    25. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
    26. Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
    27. Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
    28. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
    29. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
    30. van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Yeniden basım ve izinler

    Etiketler

    Ekzozom G r nt lemeNegatif Boyamamm nogold EtiketlemeEkzozom PurifikasyonuUltrathin Kesit AlmaProtein LokalizasyonuEkzozom MorfolojisiB t n Ba lama BoyamaBlok Haz rlama
    Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme
    Bize ulaşın
    Kütüphaneye tavsiye et

    Gizlilik

    Kullanım Şartları

    İlkeler

    Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.