Yöntem makalesi

Plasenta Autophagy düzenlenmesi üzerinde anne obezite ile ilişkili iltihap etkisini incelemek için bir birincil insan Trofoblast modeli

DOI:

10.3791/56484

⸱

27 Eylül 2017

 ,  , 
1Knight Cardiovascular Institute, Oregon Health and Science University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Oregon Health and Science University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan örnekleme cytotrophoblasts birincil hücre kültürü için yalıtım ardından insan plasental villous dokusunun bir protokoldür. Trophoblasts ile TNFα tedavisinde iltihabı obez intrauterin ortamda beyannamedir ve moleküler hedeflerin plasenta iltihabı ile anne obezite sahiplenilip keşfi kolaylaştırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anne obezite, kısmen, autophagy bozukluk bağlanabilir güvenliği aşılan plasental işlevi tarafından büyük olasılıkla aracılı olumsuz perinatal sonuçlar riski ile ilişkilidir. Plasenta obez gebelik üzerinden autophagy düzenleyiciler ifadesi anormal değişiklikleri obezite ve gebelik ile ilgili inflamatuar işlemler tarafından düzenlenmiş olabilir. Burada açıklanan örnekleme villous doku ve dönem insan plasenta birincil hücre kültürü için gelen villous cytotrophoblasts yalıtım için bir protokoldür. Bu tümör nekrozis faktör alfa (TNFα), obezite ve içinde yüksek bir proinflamatuar sitokin ile yalın gebelik gelen birincil trophoblasts tedavisi ile obez intrauterin ortam inflamatuar ortamda simülasyonu için bir yöntem izliyor gebelik. Burada açıklanan protokol uygulanması, bu maruz kalma eksojen bulunursa TNFα düzenleyen Rubicon, autophagy, trophoblasts kadın rehinenin çeşitli hastalıkları ile yalın gebelik gelen olumsuz bir regülatör ifadesidir. Biyolojik faktörleri obez intrauterin ortamında çeşitli korumak trophoblasts kritik yollar modüle potansiyeline, bu ex vivo sistem vivo içinde gözlenen ifade desenleri belirlemek için özellikle yararlı iken insan plasenta anne obezite ile TNFα sinyal doğrudan bir sonucu vardır. Sonuçta, bu yaklaşım dışarı autophagy ve etki potansiyeline sahip trophoblasts diğer kritik hücresel yollar anne obezite ile ilişkili iltihap düzenleyici ve moleküler etkileri ayrıştırmak için fırsat tanıyor plasental fonksiyon.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obezite, aşırı yağ dokusu ve besin kullanılabilirlik kaynaklanan kronik düşük dereceli inflamasyonu ile karakterize enflamatuar bir durumdur. Obezite, proinflamatuar sitokinler metabolik doku yanı sıra sistemik dolaşıma yüksek. Kanıt sağlam bir gövdesi TNFα önemli ölçüde obezite ayarında kaygıları ile insülin direnci ve metabolik fonksiyon bozukluğu1yükselmiş olduğunu göstermiştir. TNFα aktivasyonu da kanser ve otoimmünite, yapım o bir çekici terapötik hedef2gibi koşulları hastalık patogenezinde katkıda bulunur.

Obezite iltihap gebelik, bir proinflamatuar devlet43,aynı zamanda tarafından bileşik olduğunu. Daha önce plasental TNFα içeriği gebelik kadın rehinenin çeşitli hastalıkları ile anne obezite ile artar gösterilmiştir. Ayrıca, TNFα tedavi kadın ama değil erkek Trofoblast hücrelerde mitokondrial solunum TNFα cinsel dimorfik şekilde5plasental metabolizmasında düzenlenmesinde ilgilenmektedir düşündüren engeller. Anne obezite distres, erkek fetusa en duyarlı3,6,7,8 olmak dahil gebelikte komplikasyon çeşitli artan insidansı ile ilişkilidir . Maternal-fetal arayüzü anahtar rolü nedeniyle, plasenta inflamatuar sinyal karşılık obez intrauterin ortamda fonksiyonel kapasite değişimler obez gebelik sonuçlarını arabuluculuk önemli bir rol oynayabilir.

Cytotrophoblasts ve syncytiotrophoblasts plasenta villous doku endokrin sinyal ve anne ve gelişmekte olan fetus9arasındaki besin ve oksijen alışverişi için önemlidir. Fonksiyonel kapasite aksamalar villous cytotrophoblasts (bundan sonra trophoblasts anılacaktır), fetal sağlık ve gelişme tehlikeye. Bu iletişim kuralı uzak chorionic ve Bazal plakayı trophoblasts birincil hücre kültürü için yalıtım için en iyi duruma getirilmiş bir prosedür ile birlikte anatomi tarafından villous insan terim plasenta dokudan örnekleme için bir yöntem açıklar. Bu iletişim kuralı kurulan yöntemleri Enzimatik sindirim trophoblasts10, izole etmek için farklı yoğunluk Santrifüjü tarafından takip hücre dışı matriks hücrelerinden serbest bırakmak için villous doku içeren türetilir 11,12. Yalın gebeliklerde plasenta gelen birincil trophoblasts kültür TNFα ile inflamatuar ortamın bir bileşeni benzetimini yapmak için desteklenen medya ile kabul edilir bir yaklaşım anne obezite ile ilişkili olan bu protokolü ayrıntıları. Son olarak, toplam hücresini lysates TNFα tedavi trophoblasts gen ifadesinde değişiklikleri algılamak için kurutma Western ardından gelen hasat için basit bir yordam açıklanır.

Bu model obesogenic rahim içinde çevre bütünüyle özetlemek değil iken, bir bireysel katkı TNFα aracılı inflamasyon trophoblasts yanıt olarak dışarı ayrıştırmak veren kontrollü bir sistem sağlar Anne obezite. Bu model keşfetmek veya moleküler hedefler doğrudan TNFα trophoblasts içinde sinyal tarafından düzenlenir onaylamak için hem fırsat tanıyor hem de bir gen ifade şekillerindeki değişiklikleri vivo içinde plasenta anne ile içinde gözlenen Eğer test etmek izin verir Obezite TNFα aracılı inflamasyon sonucu olabilir.

Burada açıklanan yaklaşım TNFα aracılı inflamasyon etkisi autophagy düzenlenmesinde insan trophoblasts test etmek için kullanılmıştır. Erkek fetusa sergi ile obez gebelik trophoblasts alt üst autophagic ciro veya autophagosome olgunlaşma13. Organellerin ve geç endosomes için yerelleştirilmiş, çünkü o bir negatif görev son zamanlarda bir "fren" autophagic ciro işlemi tarif edilmiştir (Çalıştır etki alanını, protein Beclin1 etkileşim ve sistein-zengin içeren), Rubicon adlı bir protein Regülatör autophagosome olgunlaşma14,15. Aslında, Rubicon bu değerli terapötik hedef yapıyor autophagy kısıtlayan bir protein nadir bir örnektir. Rubicon, patofizyolojik önemi mikroplara16,17 ve cardiomyocyte koruma18doğuştan gelen bağışıklık yanıtındaki rolleri dışında hakkında çok az bilgi mevcuttur. Burada açıklanan protokolü kullanarak, Rubicon TNFα konsantrasyonları 250 pg/mL kadar artan ile tedaviye yanıt kadın birincil trophoblasts upregulated's bulunur. Gebelik erkeklerde daha iyi Rubicon düzenlenmesi bir rol nasıl kadın fetusa fare anne obezite ile oynayabilir. Eksojen TNFα için insan trophoblasts açarak anne obezite ex vivo ile ilişkili iltihap recapitulating obez intrauterin ortam üzerinde kritik yollar düzenlemenin etkisi çalışma için bir platform sağlar trophoblasts ve dolayısıyla, plasental fonksiyon.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

placentae toplanan emek ve teslim birimi Üniversitesi Hastanesi ile aydınlatılmış onam kurumsal inceleme Oregon sağlık ve bilim Üniversitesi Portland, Oregon'da tarafından onaylanmış bir protokol altında hasta.

1. koleksiyonun plasental doku

  1. hazırlık
    Not: doku karşılaştığı tüm ekipman steril olmalıdır.
    1. 60 dk 121, ısıyla tarafından parçalanmış ekipman sterilize ° C.
    2. Kişisel koruyucu ekipman (PPE) Kullanım: laboratuvar mont/önlük/önlük, eldiven ve maske yüz kalkan ya da gözlük ile.
    3. Su banyosu ve 37 kümesine açmak ° C.
    4. İki 50 mL konik tüp, komple bir medya içeren her 25 mL sıcak (Iscove ' modifiye Dulbecco s ' s %10 FBS ve % 1 ile desteklenmiş orta penisilin/streptomisin, Tablo 3) 37 ° C su banyosunda.
    5. Bilinçli hasta rızası ile bir şey yok hemen teslim sezaryenle ardından elde.
    6. Plasenta ile hakkında bilgi sahibi olun. Göbek kordonu fetal yan (koryonik plaka) eklenir ve kan damarları göbek kordonu ekleme sitesinden yayılan görülebilir. Maternal yan veya Bazal plaka ters tarafındadır. Decidua ve cotyledons adı verilen gemi ağaçları içeren yapılarını içerir.
  2. Villous doku örnekleme
    Not: Villous doku üzerinden en kısa zamanda teslim, tercihen 30 dakika veya daha kısa sürede takip plasenta örneklenmiş.
    1. Koryonik plaka ile 2-3 tam-kalınlık bölümler (yaklaşık 2.5 cm x 2,5 cm boyutunda) tüketim yukarı, bakacak plasenta rastgele, kullanma forseps ve makas ( şekil 1A) çevre içinde 2-3 cm.
      Not: anormal (yani beyaz kireçlenmeler) görünür plasenta parçaları kaçının.
    2. Uzakta chorionic ve Bazal plakaları ve herhangi bir büyük kan damarları trim.
    3. Elde edilen villous doku ( şekil 1B, yaklaşık 80-120 g toplam) sıcak tam medyada yer ve Trofoblast yalıtım örnekleme 30 dk içinde başlar.
      Not: Bazı aşağı akım deneyleri ve uygulamaları teslim, örnekleme ve Trofoblast yalıtım arasındaki gecikme süresinin uzunluğu etkilenir. Bu süreler kısa olarak mümkün ve izolasyonların arasında tutarlı olarak tutmak en iyisidir.
    4. Adımları 1.2.1 - 1.2.2, açıklanan teknikleri kullanarak örnek 5 rastgele 1 cm x 1 cm çapında villous dokudan bölümlerini (merkezi dahil olmak üzere) plasenta.
    5. 4-5 daha küçük parçalara (yaklaşık 30 mg her), her 1 cm x 1 cm villous doku örneği 2 mL microcentrifuge tüplerde yerleştirin ve flash kesme sıvı N 2 ' dondur. -80 ° c kullanmak daha sonraki analizler için mağaza.

2. Trophoblasts Villous dokusundan izolasyon

  1. hazırlık
    Not: steril ekipman kullanımı ve laminar akış başlıklı hücreleri içeren yordamları gerçekleştirin.
    1. Tezcan dört dondurulmuş yoğunluk gradyanlar (Tablo 1, tablo temel malzemeleri, reaktifler ve donanımları, takıma giren malzeme bkz:) 4 ° C'de plasenta gelmeden önce gece.
      Not: Alternatif olarak, yoğunluk gradyanlar yalıtım gününde yapılabilir.
    2. Dönüş santrifüj ve set 20 ° C.
      Not: Tüm Santrifüjü maksimum hızlanma ve yavaşlama aksi belirtilmedikçe adımlardır.
    3. Hazırla 1 Ca + 2 ve Mg + 2 (Tablo 3) ile desteklenmiş HEPES tamponlu tuz solüsyonu (HBSS) x.
    4. Sıcak tripsin 37 ° c
    5. Seyreltik Dnaz yaklaşık 2720 kilounits/ml steril olarak takıma HBSS.
    6. Yeni doğan buzağı Serum (NCS) ile 37 ° c sıcak 50 mL
    7. Sıcak komple medya 37 ° c
    8. Sıcak dondurma medya (% 90 FBS, % 10 DMSO, Tablo 3) 37 ° c
      Uyarı: DMSO toksik ve eldiven ile ele alınması gerekir.
      9. 308 mL karıştırma tarafından
    9. hazırla sindirim arabellek (Tablo 2 ve 3) takıma HBSS, tripsin 50 mL (3751.7 BAEE adet/mL) ve Dnaz 0.5 mL (379.4 kilounits/mL) bir steril şişe.
      Not: villous doku hücreleri izole etmek için gereken yaklaşık 7 h. zamanı
  2. Villous doku işleme
    1. villous doku 50 mL konik tüp içinde her parça dolu oda sıcaklığında fosfat ile durulama tamponlu tuz (PBS). Tekrarlayın ve aşırı kan kaldırılana kadar PBS gerektiği gibi yerine (PBS durulama ışık kırmızı ya da pembe doku iyice durulanır zaman olacaktır).
    2. Villous doku içinde steril Petri kabına yerleştirin ve nazikçe kazıma tarafından mümkün olduğunca çok sayıda kan damarları mikroskop slayt kullanarak damarları villous yumuşak dokudan kapalı şekilde kaldırın.
    3. İnce makas kullanarak elde edilen villous doku kıyma.
  3. Villous doku sindirim ve ham Trophoblasts yalıtım
    1. kıyılmış villous doku sindirim çözüm tripsin belirli faaliyete göre hesaplanan birimleri göre steril bir şişeyle Transfer ve Dnaz (165 mL, Tablo 2).
    2. Sonra 35 dk, kuluçka (rpm), dakikada 70 devrimler, sallayarak ile 37 ° C su banyosu içinde kendi tarafında sindirim şişe eğilme ve şişenin dibinde yerleşmek için doku sindirilmemiş parçaları izin. Dikkatlice yukarı süpernatant kapatılan doku kaçınarak bir serolojik pipet ile çizin.
    3. Dağıtmak süpernatant 50 mL konik borular arasında eşit olarak 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla.
      Not: zaman kazanmak için bu ikinci başlamak için tavsiye edilir kalan için sindirim çözüm (110 mL, tablo 2) ekleyerek sindirim yerleşmiş doku ve kuluçka 2.3.2 adımda anlatıldığı gibi devam ettirme.
    4. Yavaşça yavaşça serolojik pipet tüp alt üzerinden dağıtımı tarafından NCS 3-5 mL gergin süpernatant altında katman. Bir Menisküs (trophoblasts içeren) gergin süpernatant ve NCS arasında-meli var olmak görülebilir ( şekil 2A).
    5. Supernatants üzerinde NCS 1,250 x g 20 ° C'de 15 dakika, santrifüj kapasitesi Elde edilen Pelet kırmızı kan hücreleri Trofoblast hücreleri ( şekil 2B) içeren beyaz bir katman tarafından takip en alt tabakasında yer alacak.
    6. Adımları 2.3.2 - 2.3.5 her biri (110 mL ve 83,5 m, sırasıyla, doku, Tablo 2 şişe sindirim çözüm ekleme) ikinci ve üçüncü kesimi için de yineleyin.
    7. Bütün supernatants centrifuged sonra her Pelet 5 mL sıcak komple medya resuspend ve süspansiyonlar birlikte havuz.
    8. Hücre süspansiyon iki 50 mL konik boru ve 1,250 x g, santrifüj 20 15 dakika arasında eşit olarak bölünmüş ° C.
    9. Yavaşça süpernatant kaldırmak ve her hücre pellet 6 mL sıcak compl resuspendete medya.
  4. Yoğunluğu Santrifüjü
    1. hücre süspansiyon yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde hücre süspansiyon yoğunluk gradyanlar ile transfer damlalıklı üst katman tarafından eşit dört yoğunluk gradyanlar (3 mL her) arasında bölmek.
    2. Yoğunluk gradyanlar 1,250 x g için en az hızlanma ve yavaşlama ile 20 ° C'de 20 dk, santrifüj kapasitesi. Bu posalı hücre (Tablo 4) ayırt bantları üretmek gerekir.
    3. Trofoblast hücreleri (arasında 35-%50 DGM) içeren opak band(s) (Tablo 4) ulaşılana kadar yavaş ve dikkatli yoğunluk gradient medya (DGM) üst katmanları kaldırma.
    4. Trofoblast bantları 2 50 mL konik tüp aktarmak ve doldurmak tam sıcak ortamıyla.
    5. Yavaşça tüpler 3 - tersine çevirin 6 kez karıştırmak ve 1,250 x g 20 15 dakika, santrifüj kapasitesi ° C.
    6. Süpernatant kaldırmak ve her hücre Pelet 5 mL sıcak komple medya resuspend. Hücre süspansiyonlar birleştirmek ve bir hemasitometre ve Trypan mavi kullanarak hücrelerin saymak (veya tercih edilen hücre yöntemi sayma).
  5. Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak
    1. yukarı ve aşağı serolojik damlalıklı ile pipetting veya tüp birkaç kez yavaşça ters çevirme hücre süspansiyon Mix.
    2. Hücre süspansiyon ve Trypan mavi (yani 20 µL her) eşit parçaya ayrı tüp içinde birleştirmek ve karışımı yavaşça.
    3. 1-2 dakika oda sıcaklığında Incubate.
    4. Yavaşça hücre Trypan 15-20 µL dağıtmak mavi karışımı coverslip ve hemasitometre arasında ve hücreleri kılcal eylem tarafından ızgara üzerinde yaygın izin.
    5. (Ölü hücreleri derin mavi lekeli) hücrelerin her birinde dört 4 x 4 çeyrek dairelerin bir sayım sayacı ile saymak. Hücre birden çok kez sayılmaz emin olmak için sayma sistemi istihdam (yani alt ve sol engelsiz dokunma hücre sayılmaz).
      Not: Her 4 x 4 çeyreği 50-150 hücreler arasında yer almalıdır. Çok az veya çok fazla sayıda hücre üzerinde veya hücre sayının küçümseme yol açabilir.
    6. Toplam hücresini sayar 4 x 4 çeyrek dairelerin herbiri ortalama 10 tarafından çarpın 4 ve mL başına hücre sayısını hesaplamak için seyreltme faktörü (Trypan mavi hücre süspansiyon) çarpın.
    7. Çarpma mL başına hücre sayısı toplam hücre verim hesaplamak için hücre süspansiyon toplam hacimce.
      Not: 80-120 g villous doku ile başlayan izolasyonların üzerinden yaklaşık 100 milyon hücre bekleniyor.
  6. Kaplama hücre
    1. 6-şey plaka (2 mL süspansiyon iyi başına) 3 milyon hücre/iyi (3.3 cm 2 başına 10 5 hücre x) plaka ve yavaşça ileri geri sallamak ve yan tarafa hücreleri olarak dağıtabilmenizi.
      Not: Trophoblasts doku kültürü tedavi tabakları düzgün bağlı kalmak için gereklidir. Bir monolayer hücre syncytialization teşvik için gereklidir.
    2. Hücreler eşit olarak dağıtmak, yerleşmek ve kuluçka makinesine koymadan önce kuyu dibine uymaları başlamak izin vermek yaklaşık 30 dk laminar akış başlıklı kaplama hücre bıraktığınızdan.
    3. Kültür hücreleri en fazla 72 saat (günlük ortam değişiklikleri) içeren % 5 CO 2 ve % 95 nem ile 37 ° C kuluçka için.
      Not: trophoblasts 10-20 x 24 her y kültürünün bir mikroskop altında incelemek. Trophoblasts değil çoğalırlar ve passaged olamaz. Kültür 72 saat boyunca, bir syncytium ( şekil 3A ve B) oluşturmak için yuvarlak bireysel trophoblasts sigorta.
  7. Buz gibi hücreleri
    1. Santrifüjü 1,250 x g 20 10 dk de tarafından kullanılmayan hücreleri cips ° C.
    2. Kadar medya Pelet üzerinden mümkün olduğunca Aspire edin.
    3. Medya (Tablo 3) dondurma Pelet resuspend.
    4. Aliquots % 100 isopropanol ile dolu dondurucu bir kap içinde-80 ° C'de dondurmak. Donmuş aliquots uzun süreli depolama için ertesi gün sıvı N 2 ' ye naklet.
      Not: Hücreleri donma sonra kültürlü.
  8. Çözdürme hücreleri
    1. bir aliquot donmuş hücre kaldırmak ve çözülme bir 37 ° C su banyosunda dönen iken. Sadece o tam bir sıvı çözdürülen önce aliquot su banyosundan kaldırın.
    2. 15 ml konik tüp çözdürülen hücreleri hemen aktarın. İlk başta, yavaş başlayan 10 mL aralıklı karıştırma ile komple medya ekleyin.
    3. Ters tüp birkaç kez karıştırmak için.
    4. Santrifüj 200 x g 20 ° C'de 10 dk de
    5. Süpernatant Aspire edin ve Pelet 2-5 mL sıcak komple medya resuspend.
    6. Hücreleri ve daha önce açıklandığı gibi plaka sayısı.

3. TNFα, hücre Lysates koleksiyon ve Western Blot birincil Trophoblasts tedavisinde

  1. hazırlık
    1. sıcak komple medya 37 ° c
    2. TNFα 10 µg/mL stokunun tam medya ve store-20 ° c kadar kullanım için hazır olun.
    3. 1 µg/mL TNFα çalışma stokunun tam medyada hazır olduğunuzda hücreleri tedavi etmek yapmak. Seri seyreltik TNFα çalışma stok 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL ve komple medya 125 pg/mL.
      Not: 10 4 pg/mL TNFα konsantrasyonu orta sitotoksik olduğunu. Test TNFα konsantrasyonları düzeltilmesi istenilen aşağı akım uygulamaları özelliklerini temel bağlı olacaktır.
  2. TNFα hücrelerle tedavi
    1. kültür 24 saat sonra hücreler kültür ortamından Aspire edin ve eski yerine koymak ile TNFα 2 mL takıma iyi 6-şey plakaları (en az iki kuyu başına tedavi ve araç başına kitle iletişim araçları Denetim).
    2. Sonra TNFα-pozlama (48 h kültür), s 24 yerine takıma TNFα kitle iletişim araçları ile komple medya.
  3. Hücre hasat ve toplam Protein
    1. 72 h kültür (24 TNFα kaldırılması s) sonra Aspire medya, yavaşça oda sıcaklığında PBS hücrelerle durulayın ve buz soğuk Radioimmunoprecipitation tahlil 80 µL Ekle Taze içeren arabellek (RIPA) eklendi fosfataz ve proteaz inhibitörleri (Tablo 3) doğrudan her şey.
    2. Hücre hücre sıyırıcı plaka kaldırma. Hücreleri tedavi grupları içinde wells havuzu bir 1.5 mL microcentrifuge tüp transfer.
    3. Hücreleri vortexing tarafından yüksek tüpler 15 en az üç aralıkları için koşullar s.
    4. 4 ° C'de 15 dakika için sallanan ile hücreleri kuluçkaya
      Not: Alternatif olarak, sonra adım 3.3.3., hücreleri aralıklı ajitasyon ile 15 dakika buzda tüp, vortexing, veya yukarı pipetting ve flicking inkübewn.
    5. Tekrarlama adım 3.3.3.
    6. 4 ° C'de hücresel enkaz cips için 5 min için 10.000 x g de tüpler santrifüj kapasitesi.
    7. Yeni 1.5 mL microcentrifuge tüp ve-80 mağazasında süpernatant (içeren hücresel protein) transfer ° C.
      Not: Protokol burada durdu ve daha sonra yeniden başladı. Hücresel protein örneklerinin birden çok donma-çözülme döngüsü önlemek için birkaç aliquots tavsiye yapmaktır.
    8. Bicinchoninic asit tahlil gibi tercih edilen bir yöntem tarafından toplam protein konsantrasyonu belirlemek (BCA, temel malzemeleri, reaktifler ve ekipman, takıma giren madde tablosuna bakın).
  4. SDS-sayfa ve Western Blot Rubicon veya faiz Protein için
    Not: üretici göre protokolleri kurutma Western izleyin ' tercih edilen laboratuvar sistemi kullanarak s yönergeleri.
    1. Yük örnek arabelleği iyi bir % 12 Akrilamid (Tablo 3) toplam protein 20-40 µg arasında jel. Ayrı proteinler SDS-sayfa tarafından tampon (Tablo 3) çalıştıran.
    2. Islak-Devret jel gelen proteinler için üretici göre polivinilidin difluoride (PVDF) membran ' s yönergeleri aktarma arabelleği (Tablo 3).
    3. % 0,1 ile % 5 süt tozu Tris-Buffered serum fizyolojik içinde membran kuluçkaya sallanan ile oda sıcaklığında en az 1 h için ara 20 (TBST, Tablo 3).
    4. Bir Rubicon birincil antikor membran kuluçkaya (temel malzemeleri, reaktifler ve ekipman, takıma giren madde tablosuna bakın), gecede 4 ° C'de sallanan ile TBST içinde % 1 süt tozu 1:500.
    5. Yavaşça membran 3 x 5 dk TBST ve 1 x 5 dk sallanan ile oda sıcaklığında TBS içinde yıkayın.
    6. 1:2000 - 1: 5000 ikincil antikor membran kuluçkaya (HRP bağlı veya tercih edilen görünür eşlenik, temel malzemeleri, reaktifler ve ekipman, takıma giren madde tablosuna bakın) %5 süttozu TBST içinde en az 1 h ile oda sıcaklığında içinde Rock.
    7. Adım 3.4.5 özetlenen çamaşır yordamı yineleyin ve leke uygun görselleştirme (yani chemiluminescent) substrat bir görüntüleme sistemi ile birlikte görselleştirmek.
    8. Adım 3.4.5 özetlenen çamaşır yordamı yineleyin ve membran β-aktin veya üretici göre bir tercih edilen yükleme denetimi için yoklama ' s yönergeleri.
    9. Tercih edilen görüntü analiz yazılımı üzerinde ifade analiz Absorbans (grup yoğunluklarda) el ile miktar tarafından Rubicon çıkarma arka plan Absorbans ve normalleştirme karşılık gelen yükleme kontrol grubu yoğunluklarda. Protein düzeyleri istatistiksel olarak önemli değişiklikleri sınamak uygun istatistiksel analizleri gerçekleştirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dönem üzerinden yalın insan plasenta (önceden hamilelik vücut kitle indeksi (VKİ) < 25) anneler komplikasyonsuz gebelik kadın çoluk çocuk taşıyan ile toplanmış ve 15 dakika içinde teslimat sezaryenle (emek) örneklenmiş. Plasenta kireçlenmeler ve tipik geliştirme olmaması için muayene: kaldırıldı membranlar arasında göbek kordonu ile 300-600 g ağırlığında, Şekil 15-25 cm çapında ve göbek kordonu ortasına takılı arasında yuvarlak Plasenta. Villous doku yaklaşık 100 g için birincil Trofob...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plasenta, fetus, büyüme düzenleyen sorumlu obez environment6güvenliği aşılan işlevinde sergiler. Trophoblasts yüksek metabolik talep rağmen plasenta anne obezite ile işlevsiz mitokondrial solunum6,19sergi. Plasental metabolizma değişiklikleri komplikasyonlar ve advers fetal sonuçları obez gebelik3,6,7' gözlenen olaylarının artması için katkıda bul...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu çalışma için onların plasenta hibe kadınlar teşekkür ederiz. Biz de emek ve teslim bölümü OHSU ve Maternal ve Fetal araştırma ekibi plasenta topluluğu koordinasyon için teşekkür ederim. Biz destek için Eric Wang, doktora ve Kelly Kuo, MD için minnettar ve deneysel yöntemleri ve optimizasyonu ile yardımcı olur.

Bu eser NIH HD076259A (AM) tarafından finanse edildi ve AHA GRNT29960007 (AM).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10X HBSSGibco14185-052
CaCl2 (anhid.)Sigma-AldrichC1016-100G
MgSO4 (anhid.)Sigma-AldrichM7506-500G
HepesFisher ScientificBP310-500
TripsinGibco15090-046
DNAseWorthington Biyokimya A.Ş.
Proteaz / Fosfataz inhibitörleriThermofisher Scientific88668
Tris HClInvitrogen15506-017
EDTAInvitrogen15576-028
NaClSigma-AldrichS7653-1KG
SDSFisher ScientificBP166-600
Sodyum deoksikolat.Fisher ScientificAAJ6228822
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
Iscove' s Modifiye Dulbecco' s Orta (IMDM)Gibco12440-046
Fetal Sığır Serumu (FBS)Corning35-010-CV
Yenidoğan Buzağı Serumu (NCS)Gibco26010-074
Penisilin / Streptomisin (Kalem / Strep)Gibco15140-122
%10 FormalinFisher Scientific23-427-098
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
TNF ve alfa;Sigma-AldrichSRP3177-50UG
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Gibco70013-032
K2EDTA vakutainer kan alma tüpleriBD366450
Percoll (Yoğunluk Gradyan Ortamı, DGM)GE Healthcare17-0891-01
6 kuyulu plakalarCorning353046
Hücre süzgeçleriFisher Scientific22363549
Eppendorf Güvenli Kilitli Tüpler 2.0 mL, doğalFisher Scientific22363352
Tripan MaviCorning25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra SistemiBio-Rad1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot HücresiBio-Rad1658033
TGX FastCast Akrilamid Kiti, %12 Bio-Rad1610175
Mini-Protean 3 Çoklu Döküm HaznesiBio-Rad1654112
4X Laemmli Numune TamponuBio-Rad1610747
2-MerkaptoetanolSigma-AldrichM3148-100ML
GlisinBio-Rad1610718
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ML
Anında Yağsız Kuru SütKaranfil
Rubicon (D9F7) Tavşan mAbHücre Sinyalizasyon Teknolojisi8465S
Monoklonal Anti-β-Farede üretilen antikorSigma-AldrichA2228-100UL
Anti-tavşan IgG, HRP'ye bağlı AntikorHücre Sinyal Teknolojisi7074S
Anti-fare IgG, HRP'ye bağlı AntikorHücre Sinyalizasyon Teknolojisi7076S
SuperSignal West Pico PLUS Kemilüminesan YüzeyThermo Scientific34578
LS002139

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
  2. van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
  3. Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
  4. Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
  5. Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
  6. Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
  7. Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
  8. Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
  9. Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
  10. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  11. Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
  12. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  13. Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
  14. Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
  15. Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
  16. Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
  17. Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
  18. Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
  19. Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
  20. Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
  21. Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
  22. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
  23. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
  24. Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
  25. Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975(2014).
  26. Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
  27. Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Trofolblast zolasyonuVill z Doku rneklemesiTNF Alfa UygulamasPrimer H cre K lt rWestern Blottingmm nositokimyasal AnalizYo unluk Gradyan Santrif jasyonuRubicon EkspresyonuMaternal Obezite ModeliOtofaji Reg lasyonu

İlgili makaleler