Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

10.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56508

⸱

6 Şubat 2018

 ,  ,  , 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Biz insan kanında dolaşan nadir B hücreleri başlayarak insan antikorlar faiz, bir antijen için belirli üretim için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu doğal antikorlar nesil verimli ve hızlı ve elde edilen antikor arasında son derece ilgili antijenleri ayırt edebilirsiniz.

Özet

Monoklonal antikor (mAbs) güçlü her iki temel araştırma ve Biyomedikal yararlı araçlardır. Antikor (örneğin, bir normal protein ve bunların mutasyona uğramış bir sürüm) son derece ilgili yapılar arasında ayırt etmek gerektiğinde yüksek olmalarından vazgeçilmezdir. Böyle discriminative mAbs üreten geçerli yolu, pahalı ve zaman alıcı olan birden fazla Ab üreten B hücrelerinin geniş tarama içerir. Biz burada tamamen insan mAbs B lenfositler dolaşan kan grubundan başlayan discriminative, nesil için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem öneriyorum. Diğer tüm hücrelerin hazır periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) kullanarak karşı seçim ile kombine spesifik antijen bağlayıcı B hücre seçimini bu strateji özgünlük kaynaklanmaktadır. Belirli B hücreleri izole olduğunda, karşılık gelen mAb için kodlama cDNA (tamamlayıcı deoksiribonükleik asit) dizileri tek hücre ters transkripsiyon-Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) teknolojisini kullanan ve daha sonra insan ifade elde edilir hücreleri. Gibi az içinde 1 ay olarak, doğal olarak B hücre repertuar tarafından algılanan hemen hemen herhangi bir istenen antijen karşı son derece discriminative insan mAbs miligram üretmek mümkündür.

Giriş

Burada açıklanan yöntemi istenen antijen (Ag) karşı tamamen insan Monoklonal antikor (mAbs) hızlı ve çok yönlü üretimini sağlar. mAbs birçok temel araştırma uygulamaları içinde in vitro ve in vivotemel araç vardır: Örneğin Akış Sitometresi, Histoloji, western Blot, engelleme deneyleri. Ayrıca, mAbs daha fazla tıpta otoimmün hastalıklar, kanser, tedavisi için ve nakli ret1kontrol etmek için kullanılıyor. Örneğin, anti-CTLA-4 ve anti-PD-1 (ya da anti-PD-L1) mAbs son zamanlarda kanser tedavileri2bağışıklık denetim noktası inhibitörleri olarak kullanılmıştır.

İlk mAbs immünglobulin (Ig) tarafından üretildi-hybridomas salgılayan aşılı fare ya da sıçan dalak hücrelerinden elde. Ancak, fare ya da sıçan mAbs karşı güçlü bağışıklık yanıtı hızlı onların temizlik ve aşırı duyarlılık reaksiyonları3olası indüksiyon nedeniyle insanlarda terapötik kullanımları engellemektedir. Bu sorunu çözmek için hayvansal protein dizileri mAbs kısmen sözde chimeric fare-insan veya insanlaşmış antikorlar oluşturmak için insan olanlar tarafından değiştirilmiş. Ancak, bu strateji yalnızca kısmen önemli ölçüde maliyet ve zaman ölçekli üretim artırırken immünojenisite, azaltır. İnsan mAbs doğrudan insan B hücreleri oluşturmak için daha iyi bir çözümdür ve bunun için çeşitli stratejiler mevcuttur. Onlardan biri fajının veya Maya display kullanımıdır. Bu rastgele insan IG ağır Kombinatorik kitaplığından değişken etki alanları görüntüleme içerir ve ışık phages veya Mayalar ve ilgi spesifik antijen kullanarak bir seçim adım taşıyan zincirleri. Bu stratejinin büyük bir dezavantaj ağır ve hafif zincirleri rastgele ilişkili, çok büyük bir artış için oluşturulan antikorlar çeşitlilik içinde lider olmasıdır. Elde edilen antikor üzerinden belirli bir Ag karşı doğal bir bağışıklık yanıtı ortaya çıkacak karşılık gelmesi olası değildir. Ayrıca, insan protein katlanması ve translasyonel modifikasyonlar sistematik olarak prokaryot ve Mayalar hatta çoğaltılamaz değil. İkinci bir insan mAb üretim yöntem doğal insan B hücreleri, Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu veya anti-apoptotik faktörler BCL-6 ve BCL-XL4ifade tarafından əbadoləşdirmək olduğunu. Ancak, bu yöntem yalnızca bellek B hücreleri için geçerlidir ve az (varsa) mAb klonlar istenen antijenik özgüllük ile tanımlamak için çok sayıda mAb üreten ölümsüzleştirdi B hücreleri ile taranması gerektiren verimli değildir. Böylece pahalı ve zaman alıcı bir yöntemdir.

Yeni bir protokol son zamanlarda insan mAbs izole tek B hücreleri5üretiminin tarif edilmiştir. Bunun üzerine bir en iyi duruma getirilmiş tek hücreli ters transkripsiyon-Polimeraz zincir tepkimesi (RT-PCR) amplifikasyon her iki ağır - ve ışık-segmentleri bir tek sıralanmış B hücreden kodlama zinciri için dayanır. Bu böylece tamamen insan mAb yeniden inşası izin bir ökaryotik ifade sisteminde, klonlama ve ifade Bu kesimler tarafından takip ediyor. Bu iletişim kuralı başarıyla B hücreleri aşı bağışçılardan başlayarak kullanılmıştır. Hücreleri birkaç hafta sonra aşı B hücre istenen Ag karşı yönetmen yüksek frekansları almak ve böylece6eleme için gereken süreyi sınırlamak için hasat edildi. Tamamen insan diğer mAbs aynı zamanda enfekte HIV+ (insan immün yetmezlik virüsü) hastalar7 ve melanom hastalarda8üretilmektedir. Bu gelişmeler rağmen bu hala bir işlemdir Ag özgü B hücreleri kendi bellek fenotip veya frekans bağımsız yalıtım sağlayan kullanılabilir.

Prosedür tanımlamak burada verimli ex vivo yalıtım insan dolaşımdaki B hücreleri tamamen insan antijen spesifik mAbs yüksek verim ve düşük tarama süresi ile üretim ardından BCR olmalarından temel yol açar. Yöntem bellek B hücreleri veya antikor salgılayan B hücreleri bağışıklık yanıtının sonra indüklenen için sınırlı değildir, ama insan naif B hücre repertuar için de uygulanabilir. O bile Ag özgü B hücreleri çok düşük frekanslarda mevcut başlayarak inşaat verimlilik iyi bir göstergesidir. Yönteminin prensibi aşağıdaki gibidir: periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) iki tetramers faiz antijen sunan lekeli, her bir farklı fluorochrome ile (örneğin, Phycoerythrin (PE) ve Allophycocyanin (APC)), etiketli ve üçüncü bir tetramer yakından ilgili bir antijen sunan bir üçüncü fluorochrome ile (örneğin, parlak mor 421 (BV421)) Birleşik. Antijen bağlayıcı hücreleri için zenginleştirmek için hücreleri daha sonra anti-PE ile kaplı boncuk ile inkübe ve anti-APC Abs ve hücre ayrılık sütunlarda sıralanabilir. PE+ APC+ hücre kesir, mAbs farklı PBMC hücre türlerine B hücreleri tanımlanmasına izin özgü çeşitli lekeli ve tabi Akış Sitometresi hücre sıralama için seçilir. PE+ ve APC+, parlak mor-, ama olan B hücreleri izole edilmiştir. Bu adımı karşı olan B hücreleri olmayan veya tetramerized antijen bind yapmak ama ya PE veya APC (Bu hücreler PE+ APC- veya PE- +APC olacak) veya tetramers (Bunlar kullanılan antijen parçası bağlamak hücreleri seçer hücre-ecek var olmak BV421+). B hücreleri değil son derece ilgi epitope için belirli karşı bu adımda belirlenmişse de (Bu hücreler-ecek da var olmak BV421+). Bu nedenle, bu yöntem B-hücre reseptörleri (BCRs) iki çok yakından ilgili antijenleri arasında ayrımcılık mümkün ifade son derece belirli B hücreleri arındırmak. Tek belirli B hücreleri tüplerde toplanır ve onların PCR güçlendirilmiş IG cDNAs (tamamlayıcı deoksiribonükleik asit) klonlanmış ve tarafından salgılanan IgG mAbs insan hücre çizgilerle ifade.

Kavramının bir kanıtı olarak, bu çalışmada bir peptid ben MHC kompleksi sınıf tarafından sunulan tanıyan insan mAbs, verimli nesil açıklar (MHC-ben) molekül ve bu peptid ve aynı yüklü diğer peptidler arasında ayırt edebilirsiniz MHC-ben gen. Bu AG karmaşıklık düzeyi önemli olmakla birlikte, bu yöntem, (i) Ag özel mAbs yüksek verimli kurtarma sağlar; (ii) üretim mAbs iki yapısal olarak yakın Ags arasında ayırımcılık yapması mümkün. Bu yaklaşım herhangi bir iletişim kuralı yapılmaksızın aşı veya enfekte hastalar için genişletilmiş ve ayrıca zaten başarıyla bir insanlaşmış sıçan sistem9' uygulamaya konmuştur. Böylece, bu çalışmada temel araştırma ve immünoterapi kullanılabilir tamamen insan mAbs oluşturmak için çok yönlü ve verimli bir yaklaşım açıklar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm insan periferik kan örnekleri anonim yetişkin bağışçılardan uygun olarak yerel Etik Komitesi (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, yordam Yayındayız NTS-2016-08) aydınlatılmış onam sonra elde edilmiştir.

1. insan periferik kan mononükleer hücre izolasyon

Not: malzeme başlayan toplam insan periferik kan ya da cytapheresis örnekleri olabilir. Örnekleri 8 h büyük olmamalıdır ve antikoagülanlar (örneğin, heparin) ile desteklenmiştir.

  1. Kan ile 2 cilt (İnsan periferik kan) veya RPMI (Roswell Park Memorial Enstitüsü) orta 5 cilt (cytapheresis örnek) oranında seyreltin.
  2. Dikkatle seyreltilmiş hücre süspansiyon üzerine 50 mL konik tüp yoğunluk gradient ortamda 15 mL 35 mL katman. Çok sayıda tüpler seyreltilmiş kan dağıtmak için gerekli yapmak. Sallanan-kova Open End oda sıcaklığında 25 min için 1.290 x g de kapalı tut ile santrifüj kapasitesi.
  3. Dikkatle yoğunluk gradient orta ve plazma katmanın arasında arayüz mononükleer hücre katmanında Aspire edin ve hücreleri yeni bir 50 mL konik tüp aktarın.
  4. Tüp RPMI orta ile doldurmak, mix ve oda sıcaklığında 10 dakika için 1.290 x g de santrifüj kapasitesi. Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın.
  5. Hücre Pelet RPMI orta ve santrifüj 200 x g trombosit kaldırmak 10 min için de 20 ml resuspend. Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın. Bir kez bu adımı yineleyin.
  6. RPMI orta % 10 ile hücre Pelet resuspend Fetal sığır Serum (FBS).
    Not: doğrudan tetramer etiketleme için devam etmek ya da bir konsantrasyon 107 hücre/mL, gecede 4 ° C'de hücreler tutmak.

2. tetramer ilişkili manyetik zenginleştirme Ag özgü B hücre

  1. Her iki PE ekleyerek AG-tetramers hazırlamak veya APC etiketli premium sınıf streptavidin veya BV421 etiketli streptavidin molar oranı 1:4 biotinylated antijen monomer için de. Bir aliquot her 10 min oda sıcaklığında ekleyerek üç ayrı bölümlerinde streptavidin eşlenik uygun miktarda ekleyin.
  2. 15 mL konik tüpler (3 x 108 tüp başına) hücrelerde dağıtmak ve 5 min için 460 x g, santrifüj kapasitesi.
    Not: Aşağıdaki protokol için bir tüp var.
  3. PBS (fosfat tamponlu tuz) 200 µL % 2 ile hücre Pelet resuspend FBS. PE, APC ve tetramers, her bir son konsantrasyonu 10 µg/ml BV421 Birleşik ekleyin. Mix iyi ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
  4. Buz gibi hücre ayrılık arabelleği (SB) % 0.5 BSA (sığır Serum albümin) ve EDTA (Ethylenediaminetetraacetic asit) ile PBS kullanarak hazırlamak 2 mM.
  5. SB. Pelet hücre 10 mL aralıklarla 460 x g 5 min için de ekleyebilirsiniz.
  6. Buz gibi SB. ekle 50 µL anti-APC manyetik lastikteki anti-PE ve 50 µL olan 500 µL hücrelerde resuspend.
  7. Mix iyi ve 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
  8. Adım 2.5 iki kez tekrarlayın.
  9. Dikkatle süpernatant ortadan andresuspend 2 x 108 hücre/mL buz soğuk SB bir konsantrasyon, hücre Pelet.
  10. Bir mıknatıs SB 3 mL ile üzerinde konumlandırılmış büyük bir manyetik sütun equilibrate.
  11. Hücre süspansiyon 2,9 dengelenmiş sütunun üst üzerine aktarmak ve tamamen drenaj sağlar. : Kritik sütun topaklanma önlemek için hücreleri bir 70 µm naylon ağ geçiş adım.
  12. Hangi hücrelerin buz soğuk SB 3 mL ile bulunan tüp durulama ve arabellek sütun (durumunda filtrasyon, durulama 70 µm naylon mesh) doğrudan üzerine aktarın.
  13. Arabellek sütuna tamamen süzülmüş, buz soğuk SB başka bir 3 mL için sütun ekleyin.
  14. 2.13 başka bir 3 mL yıkama için yineleyin.
  15. Sütun üzerinde 15 mL konik toplama tüp mıknatıs ve yer çıkarın.
  16. Buz soğuk SB sütunun üst üzerine 5 mL ekleyin ve hemen pistonu kullanarak sütun hücreleri temizle. Bir kez bu adımı yineleyin.
  17. 460 x g 5 min için de kendine hakim hücre (zenginleştirilmiş ilgili tetramer pozitif hücre kesir) santrifüj kapasitesi ve ek antikor boyama için devam edin.
    Not: Havuz, hücreleri uygunsa tüm tüpler toplanan.

3. Ag özgü insan B hücreleri ve hücre sıralama boyama

  1. Hücre Pelet CD3 karşı anti-insan antikorların bir kokteyl ile resuspend (son seyreltme: 1:20), CD19 (1:20) CD14 (1:50), CD16 (1:50) ve 7AAD (1: 1000) PBS 100 µL % 2 ile son bir hacim içinde FBS. 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
  2. Hücreleri, 460 x g, santrifüj 5 min için PBS 10 mL ekleyin ve süpernatant ortadan kaldırmak. Bir kez bu adımı yineleyin. Hücre Pelet PBS, filtre üzerine 70 µm naylon mesh 200 µL resuspend.
  3. Belirli B hücreleri tek hücre düzeyinde bir hücre sıralayıcısı sitometresi 100 µm meme ve 20 psi basınç ile üzerinde 1.000 olaylar/s9aşmadan sıralamak için devam edin.
    Not: kullanılan gating strateji şekil 1'. de gösterilen Hücreleri ilk geçişli CD14 üzerinde-CD16-7AAD- hücreleri monosit, NK ve ölü hücreleri ( şekil 1' de gösterilen değil) dışlamak için. O zaman CD19+ B hücre seçildi Çift Kişilik lekeli hücrelerdeyse çoğunluğuna önce PE ve APC ilgili Ag-tetramers tarafından. Spesifik olmayan B hücreleri (alakasız Ag-tetramer tarafından günahı) BV421 negatif hücreleri üzerinde perdeleme tarafından dışlandı.
  4. Daha önce 1 x PBS 10 µL ve RNAse inhibitörü ile 10 birim dolu ve bir raf 96 mikrotüpler için yerleştirilen 8-şerit PCR tüpleri içine tek B hücreleri toplamak. Hemen PCR tüpleri-80 ° C'de dondurmak
    Not: sitometresi araç üzerinde seçilen sıralama maskeleri verim maske vardır: 0, saflık maskesi: 32 ve faz maskesi: 0. bu tek hücreli depozito bir 96 - veya 384-da PCR plakasına gerekirse ayarlanmış olabilir. Tek B hücreleri kısa zamanda dondurulmuş olması ve-80 ° C'de birkaç hafta için gerekirse bırakılabilir.

4. tek hücre RT-PCR

  1. Hücreleri doğrudan PCR şeritler kuru bir banyoda 5 min için 70 ° C'de Donmuş numuneler Isıtma tarafından parçalayıcı.
  2. Buz ve transkripsiyon (RT) 2 x 1 mM dNTP, 25 µg/mL oligod(T) astar, 5 µM rastgele hexamers, 20 birim RNAse inhibitörü ve transkriptaz 400 Ünite içeren ana mix tampon tüp başına 10 µL ekleyerek tersine çevirmek için devam etmek için şeritler aktarın.
    Not: hücre çözdürme sonra RT hızlı bir şekilde RNA yıkımı önlemek için gerçekleştirilmesi gerekir.
  3. 25 ° c melez, sonra 1s 50 ° c için kuluçkaya ve 95 ° c reaksiyonu durdurmak 3 min için bir kuluçka ile bitirmek rasgele hexamers izin vermek 5 min için kuluçkaya.
  4. İç içe geçmiş PCR güçlendirme için her değişken ağır (vH) ve kappa (vLκ) veya lambda hafif zincirleri (vLλ) için kodlama bölgede iki tur ile devam edin.
    Not: Alternatif olarak, RT örnekleri olabilir-20 ° C'de donmuş ve bir hafta boyunca devam etti.
    1. CDNA 1.5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, DNA polimeraz 2.5 birimleri ve 200 içeren bir 40 µL son birim için 3 µL PCR ilk turu için eklemek nM dış astar (bkz: Şekil 2 ve Tablo malzemeler için astar serileri).
      Not: Kompozisyon dış astar karıştırın. Ağır zincir amplifikasyon için: 4 ileri astar (5' SVH mix) ve 2 ters astar (3' CµCγ mix). Işık kappa zinciri amplifikasyon için astar 3 ileri (5' LV | mix) ve 1 ters astar (3' Cκ543-566). Işık lambda zinciri amplifikasyon için astar (5' LVl mix) 7 ileri ve astar (3' Cl) 1 ters.
      Not: Astar tarafından Tiller vd. tüm ağır ve hafif zincir aile genleri5amplifikasyon için tasarlanmış.
    2. Bisiklete binme aşağıdaki koşullar geçerlidir: 94 ° C 4 dk, 30 40 döngüsü tarafından takip 94 ° c, 30 s s VH ve VLκ VLλ için (60 ° C) ve 55 58 ° C'de s son bir uzama ile 72 ° C'de adım 7 dk 72 ° C'de.
    3. İkinci yuvarlak PCR için ilk amplifikasyon ürünü 3 µL 40 son bir hacim için kullanın µL 1.5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, DNA polimeraz 2.5 birimleri ve 200 içeren iç astar ifadeye klonlama için restriksiyon enzimi siteleri içeren nM (astar dizileri için bkz: Şekil 2 ve Malzemeler tablo ) vektörel çizimler.
      Not: Kompozisyon iç astar karıştırın. Ağır zincir amplifikasyon için: 9 ileriye astar (5' AgeIVH mix) ve 3 geriye doğru astar (3' SalIJH mix). Işık kappa zinciri amplifikasyon için 9 astar ileri (5' AgeIV | mix) ve 3 ters astar (3' BsiWIJκ mix). Işık lambda zinciri amplifikasyon için astar (5' AgeIVl mix) 6 ileri ve astar (3' XhoICl) 1 ters.
      Not: Astar tarafından Tiller vd., tüm ağır ve hafif zincir aile genleri5amplifikasyon için tasarlanmış.
    4. Bisiklete binme aşağıdaki koşullar geçerlidir: 94 ° C 4 dk, 30 40 döngüsü tarafından takip 94° c, 30 s s VH ve LCκ LCλ için (60 ° C) ve 45 58 ° C'de s son bir uzama ile 72 ° C'de adım 7 dk 72 ° C'de.
  5. PCR ürünlerinin vH, vLκ ve vLλ (500 bp ürünler değişken ağır zincir kodlama segmentler için) ve bir 350 bp ürün segmentleri kodlama değişken hafif zinciri için % 1.5 özel jel üzerinde geçirme 5 μL tarafından olumlu wells tanımlayın.
  6. PCR ürünlerinin arıtma için tasarlanmış Ultrafiltrasyon membranları kullanarak pozitif kuyulardan kalan kalan 35 µL PCR ürün arındırmak.
  7. H2O. 60 µL PCR ürünleri elute

5. ifade klonlama

  1. Ekler hazırlamak
    Not: 60 µL saflaştırılmış her PCR sindirmek son hacmi 100 µL uygun restriksiyon enzimi arabellek içeren ürün.
    1. VH PCR ürünleri, AgeI 50 birim ve SalI 50 birim eklemek ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
    2. VLλ PCR ürünleri, AgeI 50 birim ve XhoI 50 birim eklemek ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
    3. VLκ PCR ürünlerinin, AgeI 50 birim eklemek ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya 96 PCR membranlar kullanarak özetleri arındırmak ve H2o Digest 60 µL ile BsiWI restriksiyon enzimi arabelleği 100 µL son hacmi 60 µL eluate elute, BsiWI 50 birim eklemek ve 55 ° C'de 1 h için kuluçkaya
    4. Isıtma için 15 dk 80 ° C'de tarafından enzimler devre dışı bırakabilirsiniz.
  2. Vektörel çizimler ifade hazırlık
    Not: vH PCR ürünleri sürekli ağır zincir Igg1 Cγ1 içeren bir ifade vektör içinde (HCγ1) klonlanır. vLκ PCR ürünleri sürekli hafif zincir Cκ içeren bir ifade vektör içinde (LCκ) klonlanır. vLλ PCR ürünleri sürekli hafif zincir Cλ içeren bir ifade vektör içinde (LCλ) klonlanır.
    1. Aşağıdaki sindirim gerçekleştirin:
      1. Mix 1 µg ifade HCγ1 AgeI 10 ünite ve toplam hacmi 20 µL üretici tarafından önerilen kısıtlama arabelleği SalI endonucleases 10 ünite ile vektör ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
      2. İfade vektör LCκ Mix 1 µg AgeI restriksiyon enzimi 20 µL kısıtlama arabelleğinin toplam hacmi 10 ünite ile üretici tarafından önerilen ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya 10 ünite BsiWI restriksiyon enzimi ekleyin ve 1 h 55 ° C'de için kuluçkaya
      3. İfade vektör LCλ Mix 1 µg AgeI 10 ünite ve toplam hacmi 20 µL kısıtlama arabelleği XhoI endonucleases 10 ünite ile üretici tarafından önerilen ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
    2. Her sindirim karışımı enzimleri devre dışı bırakabilirsiniz 10 dk 65 ° C'de ısı.
    3. Sindirilir PCR ürünü 5 µL 2 µL ile birleştirmesini gerçekleştirmek (100 ng) 1 DNA ligaz arabellek x 20 µL tarafından kuluçka gecede 4 ° C'de 1 adet T4 DNA-ligaz ile toplam hacmine karşılık gelen doğrusallaştırılmış ifade vektör
      Not: Alternatif olarak, 4 ° C'de 3 h için ligasyonu gerçekleştirilir
  3. Klonlama
    1. Electroporate 1 µL ev yapımı electrocompetent TOP10 E. coli (Moleküler Biyoloji, Bölüm 1.8.4-1.8.8 geçerli protokoller) 45 µL içine 20 µL ligasyonu karışımı. 2 X YT orta 500 µL eklenir ve bir su banyosunda 30 dakika süreyle 37 ° C'de 2 x YT Ampisilin plakaları dönüştürülmüş yayılan bakteri kuluçkaya. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya
    2. Her dönüşüm için PCR tarafından sekiz kolonileri ekran.
      1. Bir reaksiyon Premiks aşağıdaki gibi buza ayarla: 45 µL PCR tampon, 12 µL MgCl2 (25 mM), dNTPs (üzerinden bir hisse senedi içeren 10 mM her) 4 µL, 10 µL ileri astar (hisse senedi 10 µM) vektör sıra (astar Ab vec anlamda) hybridizing x 5 ve geriye doğru astar (hisse senedi 10 µM) sürekli ağır veya hafif zincir bölge hedefleme 10 µL ( Tablo reçetesi astar dizileri için bakınız). H2O. ile 200 µL son hacmi için makyaj Daha sonra 4 µL DNA polimeraz enziminin (5 U/µL) ekleyin.
      2. Reaksiyon Premiks 8-şerit PCR tüp buz üzerinde başına 25 µL dağıtın.
      3. Bireysel koloniler almak için steril bir kürdan kullanın. Kürdan Çoğalt bir tabak oluşturur ve sonra bir PCR reaksiyon tüp içine daldırma için 2 x TY Ampisilin plaka üzerine çizgi.
      4. Bisiklete binme aşağıdaki koşullarda PCR tarama gerçekleştirmek: 94 ° C için 10 min, 30 25 döngüsü tarafından takip 94 ° c, 30 s s 55 ° c ile 50 72 ° C'de s
      5. Pozitif bakteriler tarafından geçirme 5 µL PCR ürünlerinin % 1.5 özel jel üzerinde tanımlayın.
        Not: Pozitif kolonileri bir PCR ürünü yaklaşık 850 vermek ağır zincir vektör ve 600 için bp bp hafif zincir vektör için.
    3. Dört olumlu kolonileri Çoğalt plaka 2 mL LB orta aşılamak ve gecede 37 ° C'de 200 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.
    4. Plazmid sıvı kültürleri bir plazmid arıtma kit kullanarak üreticisi tarafından belirtildiği şekilde ayıklayın.
    5. Değişken etki alanı Sanger tarafından doğru yerleştirilmesi doğrulayın Plasmid'ler ile Ab vec anlamda astar, sıralama.
      Not: Plazmid (HC ve karşılık gelen LC kodlama) doğru eklemek ile 293A hücrelere salgılanması için cotransfected olacaksın. Küçük ölçekli üretilen mAbs özgüllük tarafından ELISA denetlesinler. Sonra büyük ölçekli üretim varsa gerçekleştirilir.

6. mAbs imalatı

  1. Özgüllük kontrol etmek için küçük ölçekli üretim
    1. Transfection, tohum 15,000 insan embriyonik böbrek 293A önceki gün (HEK 293A) hücreleri 200 µL olan Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 10 ile desteklenmiş DMEM) içinde FBS 96-şey plakaları bir kuyu başına. Gecede 37 ° C'de CO2 kuluçka (%5 CO2) kuluçkaya
    2. DMEM orta % 10 içeren hücrelerde 293A cotransfect FBS doğrusal polyethylenimine türev transfection reaktifi kullanarak.
      Not: transfection triplicates içinde gerçekleştirin. Bir düz dipli 96-şey plaka bir şey için aşağıdaki iletişim kuralıdır.
      1. DNA transfection reaktif 0.5 µL 150 mM NaCl 10 µL sulandırmak. VH 0,125 µg ve vL ifade vektörlerin 0,125 µg 150 mM NaCl 10 µL oranında seyreltin. Girdap her seyreltme için 10 s.
      2. 10 µL DNA transfection reaktif seyreltilmiş 10 µL DNA çözüm ekleyin. Girdap 15 s ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. 20 µL mix drop-wise 293A hücreleri üzerinde ve yavaşça plaka dönen tarafından karıştırın.
    3. Orta 16 h serum-Alerjik orta 5 gün boyunca transfection ve kültür hücreleri sonra değiştirin.
      Not: serum-Alerjik orta serum IGS üretilen antikorlar kirletici önlemek için kullanın.
    4. Hücreleri ve enkaz Santrifüjü 460 x g 5 min için de tarafından ortadan kaldırmak.
    5. Aspirasyon ile çok kanallı pipet tarafından supernatants hasat ve V-alt 96-şey plaka aktarabilirsiniz.
    6. Gecede 4 ° C'de Sulandırılan ELISA/ELISPOT kaplama kuyu başına 100 µL içinde kat ilgili Ag 1 x 96-Peki ELISA tabak 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon, tampon. 9örneklere bakın.
    7. Blok wells ile % 10 FBS DMEM orta 37 ° C'de 2 h için
    8. Supernatants transfected 293A hücre 50 µL 6.1.5 adımından ekleyin ve RT. 2 h için kuluçkaya
    9. Horseradish peroksidaz (HRP) enzim 1 µg/mL, 100 µL IgG Ab Birleşik bir anti-insan ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. 50 µL chromogenic substrat (TMB) ekleyin ve 20 dk için kuluçkaya.
    10. 450 de optik yoğunlukları okumak nm bir Spektrofotometre üzerinde.
      Not: ELISA tahlil tarafından ortaya belirli mAbs daha büyük ölçekte üretilmektedir ve protein saf insan IgG için ilgi gösteren bir sütun.
  2. Büyük ölçekli üretim ve belirli mAbs arıtma
    1. Transfection, tohum 6 x 106 insan embriyonik böbrek 293A önceki gün (HEK 293A) hücreleri 25 mL % 10 ile desteklenmiş DMEM içeren 175 cm2 şişe içine FBS. Gecede 37 ° C'de CO2 kuluçka (%5 CO2) kuluçkaya
      Not: Hücreleri transfected zaman % 70 birleşmesi olmalıdır.
    2. DMEM orta % 10 içeren hücrelerde 293A cotransfect FBS doğrusal polyethylenimine türev transfection reaktifi kullanarak.
      1. DNA transfection reaktif 50 µL 150 mM NaCl 450 µL sulandırmak. VH 10 µg ve vL ifade vektörlerin 10 µg 150 mM NaCl 500 µL oranında seyreltin. Girdap 10 s her seyreltme.
      2. Seyreltilmiş DNA transfection reaktif DNA ekleyin. Girdap 15 s ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. 1 mL karışımı drop-wise hücrelere ve yavaşça şişeye dönen tarafından karıştırın.
    3. Orta 16 h serum-Alerjik orta 5 gün boyunca transfection ve kültür hücreleri sonra değiştirin.
    4. Hasat orta tarafından 25 mL pipet ile alıyorum.
    5. Hücreleri ve enkaz Santrifüjü 460 x g 5 min için de tarafından ortadan kaldırmak.
    6. Protein A 4 ° C'de bir hızlı protein sıvı Kromatografi (FPLC) sistemde ile kaplı bir 1 mL sütun kullanarak antikorlar arındırmak
      1. Protein sepharose sütun 20 mM fosfat tampon (pH 7) ile equilibrate.
      2. Hücre kültür ortamından 6.2.5 1.22 µm filtre sonra 0,45 µm filtre kullanarak filtre.
      3. Sütuna filtre uygulanmış orta yük.
      4. 20 mM fosfat tampon (pH 7) yıkama ve 0.1 M sitrat arabellek (pH 3.5) ile elute.
      5. 280, optik yoğunlukları okumak nm Absorpsiyon Spektrofotometre ve hemen protein içeren kesirler 1 M Tris arabelleği (pH 9) ile nötralize.
    7. Gecede 4 ° C'de karşı PBS tampon (pH 7,4) kesme 3.5 K Moleküler ağırlığı ile bir kaset içinde arıtılmış Ab diyaliz.
    8. 0.2 µm filtrasyon ve denetim saflık olarak üretici tarafından belirtilen boyut-dışlama Kromatografi tarafından sterilize.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

PBMC bu proje hediye peptid Pp65495 tanıyan insan mAbs, nesil sağlıklı bağışçılardan başlayan (Pp65, insan Sitomegalovirüs üzerinden) sunulan MHC kompleksi sınıf tarafından ben (MHC-ben) molekül HLA - A * 0201 () HLA-A2). Bu mAbs bu karmaşık ve aynı MHC yüklenen diğer peptidler temsil eden konut projeleri arasında ayırt edebilirsiniz-ben molekül.

PBMC HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC ve yukarıdaki protokolünde açıkland...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Önerilen protokol doğrudan kanda dolaşan Ag özgü B hücreleri insan mAbs üretimi için güçlü bir yöntem olmasıdır. Bu üç önemli yönleri birleştirir: (i) bile nadir Ag bağlayıcı B hücreleri; bir ex vivo yalıtım sağlayan bir tetramer ilişkili manyetik zenginleştirme, kullanımı (II) etiketli üç Ag tetramers (iki ilgili olanlar ve bir alakasız bir) ile üç farklı fluorochromes izole, Akış Sitometresi tarafından yalnızca B hücreleri BCR belirli istenen Ag için bir ifade kullanır bir perdeleme strateji; (iii) karşılık ge...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Sitometresi tesis "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) uzman teknik destek için teşekkür ederiz. Ayrıca tüm personel rekombinant protein üretim (P2R) ve etkisi platformları (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) onların teknik destek için teşekkür ederiz. Biz Emmanuel Scotet ve Richard Breathnach el yazması yapıcı yorumlar için teşekkür ederim. Bu eser mali Fransız Ulusal araştırma Ajansı (ANR tarafından) (ANR-10-IBHU-005) yönetilen «Investissements d'Avenir» Fransız hükümeti programı tarafından finanse edilen IHU Cesti projesi tarafından desteklenmiştir. IHU Cesti projesi de Nantes Métropole ve Région Pays de la Loire tarafından desteklenmektedir. Bu eser gelecek program ANR-11-LABX-0016-01 yatırım üzerinden ulusal araştırma ajansı tarafından desteklenen LabEX IGO program kapsamında gerçekleşmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HEK 293A hücre hattıThermo Fisher scientificR70507
DMEM (1X) Dulbecco'nun Modifiye Kartal OrtamıGibco yaşam teknolojileri tarafından21969-035(+) 4,5g/L D-Glikoz
0,11g/L sodyum piruvat
(-) L-Glutmin
RPMI medium1640 (1X)Gibco by yaşam teknolojileri31870-025
Sığır Serumu Albümin (BSA)PAAK45-001
Nutridoma-SPRoche11011375001100X Conc
PBS-Fosfat Tamponlu Salin (10X) pH 7,4AmbionAM9624
EDTA (Etilendiamintetraasetik asit) 0,5M pH=8Life Technologies tarafından Invitrogen15575-020
Fetal Sığır serumu (FBS)Dominique DutscherS1810-500
Ficoll - lenfositlerin ayrılması ortaEuroBioCMSMSL01-01yoğunluk 1,0777 +/- 0,001
streptavidin R-fikoeritrin konjugatıInvitrogen by Life TechnologiesS21388premiun grade 1mg / ml 5mM sodyum azid
Streptavidin, allofikosiyanin konjugatıscientific S32362tarafından Invitrogen1mg / ml
2mM azid birinci sınıf
Parlak menekşe 421 streptavidinBiolegend405225konsantre : 0,5mg/ml
Anti-PE konjuge manyetik Mikro BoncuklarMiltenyi Biotec130-048-801
Anti-APC konjuge manyetik Mikro BoncuklarMiltenyi Biotec130-090-855
MidiMACs veya QuadroMACS separotorMiltenyi Biotec130-042-302 / 130-090-976
LS SütunlarMiltenyi Biotec130-042-401
CD3 BV510 BD horizonBD Pharmingen / BD Biosciences563109Kullanılan seyreltme 1:20
CD19 FITCBD Pharmingen / BD Biosciences345788Kullanılan seyreltme 1:20
CD14 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences561116Kullanılan seyreltme 1:50
CD16 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences338440Kullanılan seyreltme 1:50
7AADBD Pharmingen / BD Biosciences51-68981E (559925)Kullanılan seyreltme 1:1000
FACS ARIA III Hücre Sıralayıcı SitometreBD Biosciences
8 şeritli PCR tüpleriAxygen321-10-061
96 mikrotüp için RaflarDominique Dutscher45476
RNAseOUT Ribonükleaz İnhibitörü (rekombinant)ThermoFisher scientific tarafından invitrojen10777-019adet: 5000U (40U / ul)
Damıtılmış Su Dnase / Rnase FreeGibco10977-035
Oligod (T) 18 mRNA PrimerNew England BioLabsS1316S5.0 A260unit
Rastgele heksamerThermoFisher scientific tarafından InvitrogenN8080127adet : 50uM, 5nmol
Üst simge III Ters transkriptazİnvitrojen thermoFisher scientifictarafından18080-044adet : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polimerazPromegaM7805
dNTP Seti, Moleküler biyoloji sınıfıThermo ScientificR01824*100umol
5LVH1EurofinsACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		PCR'nin ilk turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - Dış astarlar - İleri Prmers
5LVH3EurofinsAAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		PCR'nin ilk turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - Dış astarlar - İleri Prmers
5LVL4_6EurofinsCCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		PCR'nin ilk turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - Dış astarlar - İleri Prmers
5LVH5EurofinsCAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		PCR'nin ilk turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - Dış astarlar - İleri Prmers
3HuIgG_const_antiEurofinsTCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		PCR'nin ilk turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - Dış astarlar - İnsan Ig- Bakteriler için ters primerler PCR taraması
3CuCH1EurofinsGGGAATTCTCACA
GGAGACGA		PCR'nin ilk turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - Dış astarlar -İnsan Ig 5AgeIVH1_5_7 için ters primerler
CTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler
5AgeIVH3EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler
5AgeIVH3_23EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler
5AgeIVH4EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler
5AgeIVH4_34EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri astarlar
5AgeIVH1_18EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler
5AgeIVH1_24EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler
5AgeIVH3__9_30_33EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler
5AgeIVH6_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -İleri primerler
3SalIJH1_2_4_5EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç primerler -Ters primerler
3SalIJH3EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -Ters astarlar
3SalIJH6EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		PCR'nin ikinci turu - Ağır zincirlerin amplifikasyonu - İç astarlar -Ters astarlar
5' LVk1_2EurofinsATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - Dış astarlar -İleri astarlar
5'LVk3EurofinsCTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - Dış astarlar -İleri astarlar
5'LVk4EurofinsATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - Dış astarlar -İleri primerler
3'Ck543_566EurofinsGTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - Dış primerler -Ters primerler - Bakteri PCR taraması
5'AgeIVk1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri primerler
5'AgeIVk1_9_1– 13EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar
5'AgeIVk1D_43_1_8EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar
5'AgeIVk2EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar
5'AgeIVk2_28_2_30EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar
5'AgeVk3_11_3D_11EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTTGACACAGTC		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar
5'AgeVk3_15_3D_15EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar
5'AgeVk3_20_3D_20EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTTGACGCAGTCT		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri primerler
5'AgeVk4_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri primerler
3'BsiWIJk1_2_4EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri astarlar
3'BsiWIJk3EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri primerler
3'BsiWIJk5EurofinsGCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin amplifikasyonu k - İç astarlar -İleri primerler
5'LVl1EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri astarlar
5'LVl2EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri astarlar
5'LVl3EurofinsGCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri primerler
5'LVl4_5EurofinsGGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri astarlar
5'LVl6EurofinsGTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri astarlar
5'LVl7EurofinsGGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri astarlar
5LVl8EurofinsGAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri astarlar
3'ClEurofinsCACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		PCR'nin ilk turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - Dış astarlar -İleri primerler
5'AgeIVl1EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -ileri astarlar
5'AgeIVl2EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -ileri astarlar
5'AgeIVl3EurofinsCTGCTACCGGTTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -ileri astarlar
5'AgeIVl4_5EurofinsCTGCTACCGGTTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -ileri primerler
5'AgeIVl6EurofinsCTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -ileri astarlar
5'AgeIVl8EurofinsCTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -ileri astarlar
3'XhoIClEurofinsCTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		PCR'nin ikinci turu - Hafif zincirlerin ve lambdaların amplifikasyonu; - İç astarlar -Ters primerler - Bakteri PCR taraması
Ab-vec-senseEurofinsGCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		Bakteri PCR taraması
QA Agarose-TM, Moleküler Biyoloji SınıfıMP BioAGAH0500
NucleoFast 96 PCR PlakasıMacherey Nagel743.100.100
Enzim Yaşı I HFNew England BiolabsR3552L20000U/ml
Enzim SalI HFNew England BiolabsR3138L20000U/ml
Enzim Xho INew England BiolabsR0146L20000U/ml
Enzim BSIWINew England BiolabsR0553L10000U/ml
HCg1 (Genbank katılım numarası FJ475055)
LCk (Genbank katılım numarası FJ475056 )
LCl (Genbank katılımı sayı FJ517647)
T4 DNA ligazThermoFisher scientific tarafından Invitrogen15224.017100U (1U/ul)
2X YT ortamıSigma AldrichY1003-500ML
AmpisilinSigma Aldrich10835242001
LB (Luria Bertani) Et Suyu (Lennox)Sigma AldrichL3022-250G
Nükleospin Plazmid DNA, RNA ve protein saflaştırmaMacherey Nagel740588.250
Jet PEI DNA transfeksiyon reaktifiPolyPlus101-40
Düz tabanlı96 kuyulu plakaFalcon353072
V tabanlı 96 kuyulu plakaNunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2 şişelerNunc/Thermofisher12-562-000
ELISA/ELISPOT kaplama tamponueBiosciences00-0044-59
Nunc maxisorp düz tabanlı 96 kuyulu ELISA plakalarıNunc/Thermofisher44-2404-21yüksek protein bağlayıcı
Yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge anti-insan IgG AbPharmingen / BD Biosciences55788
TMB substratBD Biosciences555214
StreptavidinSigmaS0677
1 mL-HiTrap proteini A HP sütunuGE Healthcare17-0402-01
Ä KTA FPLCGE Healthcare18190026
Superdex 200 10/300 GL sütunuGE Healthcare17517501
NGC Quest 10 Plus Kromatografi SistemiBioRad7880003
içerir ThermoFisher

Kaynaklar

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532(2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3(2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

Etiketler

Periferik Kan Mononükleer HücreleriTek Hücreli RT-PCRAkış Sitometrisi SıralamaHLA-A2/Pp65 TetramerleriManyetik Mikroboncuk AyırmaELISA AnaliziYüzey Plazmon Rezonansıİmmünoglobulin Gen Amplifikasyonu
Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.