Method Article

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

DOI:

10.3791/56513

⸱

December 5th, 2017

 , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz bir protokol yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu kullanılarak analiz tarafından takip HeLa hücreleri Çift Kişilik timidin eşitlenmesi için mevcut. Bu yöntem de interfaz işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri üzerinde çalışmalar etkinleştirme mitoz, zaman uyumlu olarak S faz geçin hücreleri çok sayıda elde anahtarıdır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma bir aşama bağlı şekilde hücre döngüsünün çeşitli düzenleyici olayların hücre büyümesi ve bölünme hakkında net bir anlayış sağlar. Hücre popülasyonlarının eşitleme hücre döngüsünün belirli aşamalarında bu tür deneysel gayretlerinde çok yararlı olduğu tespit edilmiştir. Hücreleri tarafından nispeten daha az toksik kimyasallar ile tedavi eşitlenmesi farmakolojik inhibitör uyuşturucu kullanımı sonucu hücre döngüsü olaylar ve seçili Mitotik aşamaları belirli zenginlik elde etmek için çalışma için yararlı olabilir. Burada, eşitleme insan hücreleri hücrenin farklı aşamalarında döngüsü, ikimiz de dahil olmak üzere S faz ve bir çift timidin blok-M faz ve yordam kromozom uyum içinde Mitotik proteinler işlevselliğini çalışmak için serbest bırakmak için protokol tarif ve segregasyon. Bu iletişim kuralı kurulan Interphase işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri çalışmak için son derece yararlı olmuştur. Sadece G2/M özel Cdt1 boşaldığında bizim durumumuzda, Cdt1, bir protein için lisans çoğaltma kaynağı G1 evresinde, kritik Mitotik rolü etkin bir şekilde ele. Biz Çift Kişilik timidin eşitlemeyi kullanarak tükenmesi G2/M özel Cdt1 için detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Biz de hücre fiksasyon Protokolü açıklamak ve yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu timidin yayımlanmasından sonra kullanarak hücre görüntüleme yaşamak. Yöntem de bir büyük örneklerin boyutu sabit ve canlı hücre için Mitotik hücre elde etmek kullanmasına olanak tanır Hec1, karmaşık, Ndc80 bir bileşeni için gibi fizyolojik ve perişan koşullarda Mitotik proteinlerin işlevi çözümlemek için yararlıdır analiz biz burada gösterdiği gibi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre döngüsünde hücreleri son derece düzenli ve geçici kontrollü olayları kendi genom ve nükleer silahların yayılmasına karşı doğru çoğaltılması için bir dizi tabi. Memelilerde, hücre döngüsü interfaz ve M-faz oluşur. Interphase içinde ki üç aşamaları - G1, S, oluşur ve G2, hücre genomunu çoğaltır ve normal hücre döngüsü ilerleme1,2için gerekli olan büyüme uğrar. M-mitoz (profaz, prometafaz, metafaz, anafaz ve telofaz) ve sitokinez oluşan aşamasında, bir ebeveyn hücre iki genetik olarak aynı kızı hücreleri üretir. Mitoz, chromatids yinelenen genom kopyası sıkıştırılmış (profaz) vardır ve onların kinetochores monte Mitotik spindle (prometafaz), mikrotübüller tarafından yakalanır kız kardeşi bu sürücüler onların hizalama metafaz ardından plaka (metafaz) onların Ne zaman chromatids doğru bölmek ve ters dönüş için yer değiştiren kız kardeşi (anafaz) Polonyalılar segregasyon eşit. İki kızı hücreleri fiziksel olarak bir aktin esaslı contractile yüzüğü (telofaz ve sitokinez) faaliyet tarafından ayrılır. Kinetochore ve chromatids centromeric bölge çeviren özel bir proteinaceous yapı iğ mikrotübüller için ek siteler olarak hizmet. Temel işlevi kromozom yakalama, hizalama, sürücü ve uygunsuz iğ Mikrotubul eki, Milli Meclis denetim noktası kromozom segregasyon3,4kalitesini korumak için arabuluculuk yaparken düzeltme yardım etmektir.

Hücre eşitleme tekniği moleküler ve yapısal olaylar hücre döngüsü ilerlemesinde dahil anlamak için ideal bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu yaklaşım belirli aşamaları için çeşitli analizler, gen ifadesi, profil oluşturma dahil olmak üzere hücresel biyokimyasal süreçlerin analizleri ve proteinlerin hücre altı yerelleştirme tespiti, hücre popülasyonlarının zenginleştirmek için kullanılmıştır. Eşitlenmiş memeli hücreleri-ebilmek var olmak kullanılmış sadece bireysel gen ürünlerinin incelenmesi için aynı zamanda Analizi Mikroarray analiz gen ifade5, miRNA ifade desenleri6dahil olmak üzere bütün genleri içeren yaklaşımlar için translasyonel yönetmelik7ve protein değişiklikler8proteomik analizi. Eşitleme gen ekspresyonu veya protein knock-down veya knock-out veya kimyasal maddelerin etkileri, hücre döngüsü gelişimi çalışma için kullanılabilir.

Hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında eşitlenebilir. Hem fiziksel hem de kimyasal yöntemler hücre senkronizasyonu için yaygın olarak kullanılır. Hücre eşitlemesi için en önemli kriterleri eşitleme noncytotoxic ve geri dönüşümlü olması gerekir vardır. Hücreleri farmakolojik ajanlar tarafından eşitleme potansiyel olumsuz hücresel sonuçları nedeniyle, kimyasal bağımlı yöntemleri anahtar hücre döngüsü olaylar eğitim için avantajlı olabilir. Örneğin, hidroksiüreye, amphidicolin, mimosine ve lovastatin, G1/S faz hücre eşitleme için kullanılabilir ancak, onlar inhibe biyokimyasal yolları üzerindeki etkileri nedeniyle onlar hücre döngüsü kontrol noktası mekanizmaları etkinleştirmek ve önemli bir öldürmek kesir hücreleri9,10. Öte yandan, DNA ikileşmesi "timidin taşı" olarak bilinen büyüme basına timidin ekleyerek geribildirim inhibisyonu hücre döngüsünün belirli Puan11,12,13tutuklayabilirsin. Hücreleri de G2/M aşamasında nocodazole ve RO-33069,14ile tedavisi ile senkronize edilebilir. Nocodazole Mikrotubul derleme önleyen bir nispeten yüksek sitotoksisite vardır. Ayrıca, hücreleri nocodazole tutuklandı tanımışlar tarafından Mitotik kayma Interphase geri dönebilirim. Çift timidin blok tutuklama hücreleri G1/S faz ve blok sürümden sonra zaman uyumlu olarak G2 ve mitoz içine devam etmek için hücreleri bulunur. Timidin bloğundan çıkış hücrelerin hücre döngüsünün normal ilerleme yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu altında hücre fiksasyon veya canlı görüntüleme tarafından görülebilir. Özellikle hücre girin ve mitoz Kişilik timidin blok sürümden sonra devam pertürbasyon Mitotik proteinlerin etkisi okudu. Cdt1, çok fonksiyonlu bir protein DNA çoğaltma kaynağı G1 aşamasında lisansı içinde yer alan ve aynı zamanda mitoz15sırasında kinetochore Mikrotubul ekleri için gereklidir. Cdt1 fonksiyonu mitoz sırasında çalışmaya bir lisans çoğaltmayı G1 aşamasında, aynı zamanda onun tükenmesi özellikle aşamasında G2/M sadece etkileyen üzerinde onun tükenmesi etkisini önler bir yöntem evlat edinmek gerekiyor. Burada, sabit ve canlı hücre görüntüleme tarafından birden fazla işlevi hücre döngüsünün farklı aşamalarında gerçekleştirme proteinlerin Mitotik rol çalışmaya Çift Kişilik timidin blok dayalı ayrıntılı iletişim kuralları mevcut.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. çift timidin blok ve yayın: reaktif hazırlıkları

  1. 500 mL Dulbecco'nın kartal orta (DMEM) orta %10 FBS, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş değişiklik yapmak.
  2. Steril su ve aliquots-80 ° C'de deposunda timidin stokunun 100 mM olun

2. sabit hücre görüntüleme Mitotik ilerleme (şekil 1A) için iletişim kuralı

  1. Günde 1, tohum ~ 2 x 105 HeLa hücreleri ile bir kapak (% 70 etanol ve UV radyasyon vermeliyiz ile sterilize) kayma ve DMEM orta 2 mL 6-şey plaka kuyu içine. 37 ° C ve % 5 CO224 h için oksijen bir kuluçka hücrelerin büyümesine.
  2. 1st timidin blok: 2 günde timidin taze DMEM medya (100 mM hisse senedi, 2 mM son konsantrasyonu) gerekli hacmi iyice karıştırın.
  3. Timidin içeren 2 mL ekleyin her şey 6-iyi hücrelerde medya plaka ve 18 h için kuluçkaya.
  4. Gün 3, orta Aspire edin ve hücreleri 2 mL 1 x PBS ile iki kez ve bir kez taze prewarmed DMEM ile yıkayın; hücre Block serbest bırakmak 9 h için taze prewarmed DMEM ortamda hücrelerin büyümesine.
  5. 2nd timidin bloğu: tekrar timidin içeren 2 mL ekleyin medya (2 mM son konsantrasyonu) her şey 6-şey plaka hücrelerde.
  6. Başka bir 18 h için kuluçkaya.
  7. Günde 4, orta Aspire edin ve hücreleri 2 mL 1 x PBS ile iki kez ve bir kez taze prewarmed DMEM ile yıkayın.
  8. Seyreltik çift (Denetim ve Cdt1) ve transfection reaktif serum ücretsiz büyüme orta 10 dk. için ayrı ayrı bunları karıştırın ve RT., 20 dk için kuluçkaya Her transfection içinde kullanılan siRNA son konsantrasyonu 100 oldu nM. Timidin dışarı yıkanmış hücrelere tepki karışımı ekleyin.
  9. 9-10 h bloke edilen serbest bırakmak ve hücreleri üzerinde kapak makbuzları ile % 4 saptamak için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya PFA RT., 20 dk
    Dikkat: PFA toksik, uygun koruma giymek.
  10. Immunostain hücreleri, RT, 10 min için % 0,5 (v/v) deterjan ile permeabilizing ve 5 min için 1 x PBS iki kez hücrelerle yıkama sonra.
    1. 1 x PBS için 1 h %1 (w/v) birincil antikor (1:1, 000, tavşan anti-Zwint1 antikor 1: 400 ve fare anti-fosfo-ɣ H2AX 1:300 seyreltilmiş seyreltilmiş seyreltilmiş fare anti-α-tübülin antikor) 50 µL hücrelerle tedavi tarafından takip RT olarak % 1 BSA (w/v) içeren hücreleri engellemek 1 x PBS 37 oC. 1 h için BSA
    2. 1 x PBS hücrelerle dışarı üç kez yıkadıktan sonra RT, 1 h için her kapak cam (Alexa 488 ve rodamine kırmızı 1:250 dilutions %1 (w/v) BSA 1 x PBS,) için ikincil antikorların 50 µL hücrelerle tedavi
    3. 1 x PBS iki kez 5 min için hücrelerle yıkadıktan sonra DAPI hücrelerle tedavi (0.1µg / mL 1 x PBS) RT., 5 min için
    4. 1 x PBS iki kez 5 min için hücrelerle yıkadıktan sonra kapak notu hücrelere uygun montaj medya net mikroskobik bir slayt üzerinde karşı karşıya koyun.
  11. Hücreler immunostained proteinler ile 60 X veya 100 X 1.4 NA planı Apochromatic DIC yağı daldırma amaç için gerekli görüntülerin kalitesi için gerektiği şekilde uygun bir kamera ile donatılmış bir ters yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu monte görüntü.
  12. Z-0.2 µm kalınlık yazılımını kullanarak yığını için mikroskop gerektiği oda sıcaklığında görüntüleri elde etmek.

3. canlı hücre görüntüleme Mitotik ilerleme (şekil 3A) için iletişim kuralı

  1. Gün 1, yaklaşık 0,5-1 x 105 HeLa hücreleri stabil mCherry-H2B GFP-α-tübülin (biraz hücre tipi ve onlar hızlı proteinler göre değişken) içine 35 mm cam alt yemekler 1.5 mL DMEM orta ile ifade etmek tohum ve onları bir oksijen büyümek kuluçka makinesi 24 h 37 oC ve %5 CO2.
  2. 1st timidin blok: 2 günde 1,5 mL timidin içeren ekleyin (100 mM timidin, 2 mM son konsantrasyonu,) çanak hücrelerde medya.
  3. 18 h için kuluçkaya.
  4. Gün 3, timidin içeren orta Aspire edin ve hücreleri üç kez, 2 mL 1 x PBS ile iki kez ve bir kez taze prewarmed DMEM ile yıkayın.
  5. Seyreltik çift (Denetim ve Hec1) ve transfection reaktif serum ücretsiz büyüme orta 10 dk. için ayrı ayrı ile onları karıştırın ve RT., 20 dk için kuluçkaya Her transfection içinde kullanılan siRNA son konsantrasyonu 100 oldu nM. Timidin dışarı yıkanmış hücrelere tepki karışımı ekleyin.
  6. Taze prewarmed DMEM Orta hücre Block serbest bırakmak 8 h için 1,5 mL hücrelerinde büyür.
  7. 2nd timidin bloğu: 1,5 mL timidin içeren ekleyin medya (2 mM son konsantrasyonu) çanak hücrelerde.
  8. Başka bir 18 h için kuluçkaya.
  9. Günde 4, orta Aspire edin ve hücreleri üç kez, 2 mL 1 x PBS ile iki kez ve bir kez taze prewarmed DMEM ile yıkayın. Hücrelerin büyümesine taze prewarmed iyi (L-15) orta %10 FBS ve 20 mM ile HEPES pH 7,0 hücre Block serbest bırakmak 8 h için takıma'nın.
  10. Zaten en az 30 dakika sahnede ve deneysel sıcaklıklar dengelemek için görüntüleme başlamadan önce açık yüksek çözünürlüklü confocal mikroskop set sıcaklık kontrol odasında çanak yerleştirin.
  11. Sonra hücreleri görünür hale gelene kadar parlak alanı ile 60 x objektif odak el ile sahne alanı üzerinde seçim bölgesine elemek.
  12. Işık ve lazer güç/pozlama, görüntü edinme parametreleri ve mikroskop görüntü alma yazılım kullanarak deneme süresi ayarlayın. Filtreleri GFP (488 uyarma; 385 nm emisyon) ve mCherry (561 nm uyarma ve 385 nm emisyon) görüntüleri elde etmek için kullanın.
  13. Ayrı ayrı pulsed iletilen ışık ve floresan görüntüleri her 10 min 16 s kadar bir süre için elde etme tarafından hızlandırılmış deneme gerçekleştirin.
  14. On iki 1.0 µm ayrılmış z-uçak yazılım kullanarak Çift Kişilik timidin blok sürümden sonra 9 h için mikroskop gerektiği görüntüleri elde etmek.
  15. Tek tek hücreler için Mitotik ilerleme izleme görüntüleri analiz ve nihayet bir araya kaynak yazılım Fiji/ImageJ ile ilgili film.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitotik ilerleme ve Mikrotubul istikrar hücrelerde çalışma çift timidin blok sürümden sonra sabit
Cdt1 DNA çoğaltma kökenleri G1 aşamasında lisansı içinde yer almaktadır. S aşamasında bozulmuş ama G2/M aşamasında yeniden birikir. Mitoz rolü çalışmaya, endojen Cdt1 en uygun hücre eşitleme tekniği Çift Kişilik timidin blok15kullanarak özellikle G/M aşamasında tükenmiş gerekiyor. Hücreleri faz ve hangi zaman çoğaltma kökeni G1, ayrıca Cdt1 işlevi g...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu hücreler mitoz böylece aynı zamanda kromozom hizalama, bipolar analizlerini etkinleştirme uyum içinde girerek birçoğunu içeren bir kısa sürede pencerede Mitotik hücre bir artan örnek boyutu sağlar Çift Kişilik timidin eşitleme en önemli avantajı olduğunu oluşumu ve kromozom ayrımı çok daha yüksek verimlilik ile iğ.

Birçok düzenleyici protein kompleksleri ve sinyal yollar mitoz yoluyla normal ilerleme sağlamaya adadık ve deregülasyon bu sürecin tumorigenesis için neden. Stabil mCherry-H2B ve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar onlar rakip mali niyetimiz yok bildirin.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stabil mCherry-Histon H2B ve GFP-α-tübülin ifade HeLa hücreleri paylaşımı için Tohoku Üniversitesi, Japonya'nın Dr Kozo Tanaka için minnettarız. Bu eser DV (R00CA178188) için bir ncı hibe ve Northwestern Üniversitesi'nden başlamak-yukarıya fon tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM (1x)Yaşam Teknolojileri11965-0924 & derecede mağaza; C
DPBS (1x)Yaşam Teknolojileri14190-1444 > C
Leibovitz' s (1x) L-15 ortaYaşam Teknolojileri21083-0274 > C
Serum azaltılmış orta (Opti-MEM)Yaşam Teknolojileri319-85-0704 > C
Penisilin ve streptomisinYaşam Teknolojileri15070-063 (Kalem Strep)1:1.000 seyreltme
Dharmafect2GE DharmaconT-2002-024 & deg'de saklayın; C
ThymidineMP Biomedicals LLC103056Steril damıtılmış suda çözülmüş
Cdt1 siRNAYaşam TeknolojileriRef 10
Hec1 siRNAYaşam TeknolojileriRef 13
GFP-H2B
HeLa hücreleri GFP-&alfa;-tubulin ve mCherry H2B eksprese eden HeLa hücreleriTohoku'dan Dr. Kozo Tanaka'dan cömert hediye üniversite, Japonya
Formaldehit çözeltisiSigma-Aldrich CorporationF8775Toksik, dikkatli olması gerekiyor
DAPISigma-Aldrich CorporationD9542Toksik, dikkatli olması gerekiyor
Fare anti-&alfa;-tubulinSanta Cruz BiyoteknolojiSc322931:1.000 seyreltme
Tavşan karınca-Zwint1BethylA300-781A1:400 seyreltme
Fare anti-fosfo-&gama; H2AX (Ser139)Upstate Biotechnology05-626, klon JBW3011:300 seyreltme
Alexa 488Jackson ImmunoResearch1:250 seyreltme
Rodamine Red-XJackson ImmunoResearch1:250 seyreltme
BioLite 6 kuyulu çok amaçlıThermo Fisher Scientific130184
35 mm Cam alt çanakMatTek CorporationP35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE ters mikroskopNikon Instruments
KonfokalYokagawaCSU-X1
Ultra 888 EM-CCD KameraAndoriXon Ultra EMCCD
4 dalga boyu lazerAgilent Technologies
İnkübasyon SistemiTokai HitTIZB
NIS elemanları yazılımıNikon Instruments
eksprese eden için eğirme diski Mikroskoplar için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
  2. Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
  3. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
  4. Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5(2017).
  5. Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
  6. Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
  7. Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
  8. Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
  9. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
  10. Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
  11. Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
  12. Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
  13. Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
  14. Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
  15. Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
  16. Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
  17. Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
  18. Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
  19. Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819(2017).
  20. Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
  21. Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitotic Cell SynchronizationHigh Resolution Confocal MicroscopyDouble Thymidine BlockCell Cycle AnalysisMitotic Protein FunctionChromosome Alignment SegregationCdt1 Depletion ProtocolHec1 Kinetochore AnalysisLive Cell ImagingFixed Cell Analysis

Related Articles