Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Summary

Biz bir protokol yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu kullanılarak analiz tarafından takip HeLa hücreleri Çift Kişilik timidin eşitlenmesi için mevcut. Bu yöntem de interfaz işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri üzerinde çalışmalar etkinleştirme mitoz, zaman uyumlu olarak S faz geçin hücreleri çok sayıda elde anahtarıdır.

Abstract

Çalışma bir aşama bağlı şekilde hücre döngüsünün çeşitli düzenleyici olayların hücre büyümesi ve bölünme hakkında net bir anlayış sağlar. Hücre popülasyonlarının eşitleme hücre döngüsünün belirli aşamalarında bu tür deneysel gayretlerinde çok yararlı olduğu tespit edilmiştir. Hücreleri tarafından nispeten daha az toksik kimyasallar ile tedavi eşitlenmesi farmakolojik inhibitör uyuşturucu kullanımı sonucu hücre döngüsü olaylar ve seçili Mitotik aşamaları belirli zenginlik elde etmek için çalışma için yararlı olabilir. Burada, eşitleme insan hücreleri hücrenin farklı aşamalarında döngüsü, ikimiz de dahil olmak üzere S faz ve bir çift timidin blok-M faz ve yordam kromozom uyum içinde Mitotik proteinler işlevselliğini çalışmak için serbest bırakmak için protokol tarif ve segregasyon. Bu iletişim kuralı kurulan Interphase işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri çalışmak için son derece yararlı olmuştur. Sadece G2/M özel Cdt1 boşaldığında bizim durumumuzda, Cdt1, bir protein için lisans çoğaltma kaynağı G1 evresinde, kritik Mitotik rolü etkin bir şekilde ele. Biz Çift Kişilik timidin eşitlemeyi kullanarak tükenmesi G2/M özel Cdt1 için detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Biz de hücre fiksasyon Protokolü açıklamak ve yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu timidin yayımlanmasından sonra kullanarak hücre görüntüleme yaşamak. Yöntem de bir büyük örneklerin boyutu sabit ve canlı hücre için Mitotik hücre elde etmek kullanmasına olanak tanır Hec1, karmaşık, Ndc80 bir bileşeni için gibi fizyolojik ve perişan koşullarda Mitotik proteinlerin işlevi çözümlemek için yararlıdır analiz biz burada gösterdiği gibi.

Introduction

Hücre döngüsünde hücreleri son derece düzenli ve geçici kontrollü olayları kendi genom ve nükleer silahların yayılmasına karşı doğru çoğaltılması için bir dizi tabi. Memelilerde, hücre döngüsü interfaz ve M-faz oluşur. Interphase içinde ki üç aşamaları - G1, S, oluşur ve G2, hücre genomunu çoğaltır ve normal hücre döngüsü ilerleme^1,2için gerekli olan büyüme uğrar. M-mitoz (profaz, prometafaz, metafaz, anafaz ve telofaz) ve sitokinez oluşan aşamasında, bir ebeveyn hücre iki genetik olarak aynı kızı hücreleri üretir. Mitoz, chromatids yinelenen genom kopyası sıkıştırılmış (profaz) vardır ve onların kinetochores ....

Protocol

1. çift timidin blok ve yayın: reaktif hazırlıkları

1. 500 mL Dulbecco'nın kartal orta (DMEM) orta %10 FBS, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş değişiklik yapmak.
2. Steril su ve aliquots-80 ° C'de deposunda timidin stokunun 100 mM olun

2. sabit hücre görüntüleme Mitotik ilerleme (şekil 1A) için iletişim kuralı

1. Günde 1, tohum ~ 2 x 10⁵ HeLa hücreleri ile bir kapak (% 70 etanol ve UV radyasyon vermeliyiz ile sterilize) kayma ve DMEM orta 2 mL 6-şey plaka kuyu içine. 37 ° C ve % 5 CO₂24 h için oksijen bir kuluçka hücrelerin büyümesine.
2. 1^st<....

Results

Mitotik ilerleme ve Mikrotubul istikrar hücrelerde çalışma çift timidin blok sürümden sonra sabit
Cdt1 DNA çoğaltma kökenleri G1 aşamasında lisansı içinde yer almaktadır. S aşamasında bozulmuş ama G2/M aşamasında yeniden birikir. Mitoz rolü çalışmaya, endojen Cdt1 en uygun hücre eşitleme tekniği Çift Kişilik timidin blok¹⁵kullanarak özellikle G/M aşamasında tükenmiş gerekiyor. Hücreleri faz ve hangi zaman çoğaltma kökeni G1, ayrıca Cdt1 işlevi g.......

Discussion

Bu hücreler mitoz böylece aynı zamanda kromozom hizalama, bipolar analizlerini etkinleştirme uyum içinde girerek birçoğunu içeren bir kısa sürede pencerede Mitotik hücre bir artan örnek boyutu sağlar Çift Kişilik timidin eşitleme en önemli avantajı olduğunu oluşumu ve kromozom ayrımı çok daha yüksek verimlilik ile iğ.

Birçok düzenleyici protein kompleksleri ve sinyal yollar mitoz yoluyla normal ilerleme sağlamaya adadık ve deregülasyon bu sürecin tumorigenesis için neden. Stabil mCherry-H2B ve.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Yaşam Teknolojileri	11965-092	4 & derecede mağaza; C
DPBS (1x)	Yaşam Teknolojileri	14190-144	4 > C
Leibovitz' s (1x) L-15 orta	Yaşam Teknolojileri	21083-027	4 > C
Serum azaltılmış orta (Opti-MEM)	Yaşam Teknolojileri	319-85-070	4 > C
Penisilin ve streptomisin	Yaşam Teknolojileri	15070-063 (Kalem Strep)	1:1.000 seyreltme
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	4 & deg'de saklayın; C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	Steril damıtılmış suda çözülmüş
Cdt1 siRNA	Yaşam Teknolojileri		Ref 10
Hec1 siRNA	Yaşam Teknolojileri		Ref 13
GFP-H2B
HeLa hücreleri GFP-&alfa;-tubulin ve mCherry H2B eksprese eden HeLa hücreleri	Tohoku'dan Dr. Kozo Tanaka'dan cömert hediye üniversite, Japonya
Formaldehit çözeltisi	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	Toksik, dikkatli olması gerekiyor
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	Toksik, dikkatli olması gerekiyor
Fare anti-&alfa;-tubulin	Santa Cruz Biyoteknoloji	Sc32293	1:1.000 seyreltme
Tavşan karınca-Zwint1	Bethyl	A300-781A	1:400 seyreltme
Fare anti-fosfo-&gama; H2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, klon JBW301	1:300 seyreltme
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250 seyreltme
Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 seyreltme
BioLite 6 kuyulu çok amaçlı	Thermo Fisher Scientific	130184
35 mm Cam alt çanak	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE ters mikroskop	Nikon Instruments
Konfokal	Yokagawa	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Kamera	Andor	iXon Ultra EMCCD
4 dalga boyu lazer	Agilent Technologies
İnkübasyon Sistemi	Tokai Hit	TIZB
NIS elemanları yazılımı	Nikon Instruments