Biz burada Salmonella typhimuriumyalıtım için basit ve hızlı bir yöntem tarif-biotin ve streptavidin bakterilerle kaplama tarafından phagosomes üzerinden makrofajlar içeren.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren
Bu makalede
Özet
Özet
Salmonella typhimurium insanlarda mide iltihabı neden olur fakültatif intraselüler bir bakteridir. Lamina propria, S. işgalinden sonra Typhimurium bakteriler hızla tespit ve makrofajlar tarafından phagocytized ve bozulmuş için phagosomes bilinen veziküller içinde bulunan. S. yalıtım Typhimurium-içeren phagosomes yaygın olarak kullanılan çalışma nasıl S. Typhimurium enfeksiyonu bakteriyel bozulma önlemek için phagosome olgunlaşma sürecinin değiştirir. Klasik, yalıtım bakteri içeren phagosomes Sükroz degrade Santrifüjü tarafından gerçekleştirilen. Ancak, bu işlem zaman alır ve özel ekipman ve belirli bir ölçüde beceri gerektirir. Burada açıklanan S. yalıtım için basit ve hızlı bir yöntem olduğunu Typhimurium-makrofajlar üzerinden phagosomes bakterileri biotin streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplama tarafından içeren. Bu yöntemle elde edilen phagosomes deneyleri, protein, metaboliti ve lipid çözümlemesi gibi geniş bir yelpazesi için izole phagosomes kullanımını sağlayan seçtikleri herhangi bir arabellekte askıya alınabilir. Özet olarak, bu yöntem S. yalıtım için Typhimurium-phagosomes içeren belirli, verimli, hızlı, en az ekipman için ve yalıtım Sükroz degrade-ultrasantrifüj tarafından klasik yöntem'den daha çok yönlüdür.
Giriş
Makrofajlar algılayan, yutmak ve herhangi bir yabancı parçacık mikroorganizmalar bakteri gibi işgal için apoptotik hücreler arasında değişen periferik dokularda mevcut aşağılamak özel fagositik hücreler dolaşmaktadır. Reseptör aracılı yüzey tanıma patojen belirli işaretleri (patojen ilişkili moleküler desen veya PAMPs da bilinir) mikroorganizmalar yüzeyinde yaygın olarak mevcut makrofajlar içinde hücresel membran karmaşık bir yeniden yapılanma başlatmak. sipariş surround ve patojen1işbirliği için.
Yutulmak patojen sonra phagosome bilinen bir hücre içi vezikül makrofaj tarafından yer alıyor. Diğer veziküller endosomes....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
patojen S. kullanımıyla ilgili tüm adımları Typhimurium BSL-2 veya daha yüksek biyolojik güvenlik seviye yapılmalıdır. Kültür ve S. kaplama Typhimurium gibi kemik iliği türevi makrofajlar (BMDMs) enfeksiyonu önlemek amacıyla laminar akış başlık altında gerçekleştirilmelidir. S. yalıtım Typhimurium-phagosomes içeren herhangi bir BSL-2 laboratuvar tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir.
kemik iliği çıkarma fareler makrofajlar içine onun farklılaşma için hayvan refah kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilen ve doğa, Kuzey Ren-Vestfalya Eyalet ajansı tarafından onaylanmış Çevre ve tüketici ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yalıtım bakteri içeren phagosomes bu iletişim kuralı tarafından bakteri biotinylation bir ilk adım olarak gerektirir. Biz bu nedenle S. etkinliği değerlendirilir Typhimurium biotinylation biotinylated ile enfekte BMDMs confocal mikroskobu analizi tarafından mCherry -S. typhimurium Cy5-Streptavidin ile Etiketlenmiş. Kısaca, BMDMs mCherry -Sbu iletişim kuralıyla açıklandığı gibi bulaşmış. Typhimurium daha önce biotinylated ama streptavid.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
S. yalıtım için yeni bir yöntem Typhimurium-phagosomes bakterileri biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplama tarafından içeren burada anlatılan. Hücre zarının nazik bozulma sonra bakteri içeren phagosomes kolayca bir manyetik raf kullanarak elde edilebilir. Gösterdiğimiz bakteri etiketleme iltihap ikna etmek için kapasite patojenin koruyan ve ana hücrenin fagositik özelliğini değiştirmez. Bakteri ve endosome/lysosome bu yöntemle elde edilen phagosomes önemlisi, zenginleştirilmiş işa.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Robinson'ın laboratuarında araştırma hücresel stres yanıt Aging-Associated hastalıkları, Köln Üniversitesi, Almanya Köln mükemmellik kümede fon tarafından desteklenmektedir (CECAD; DFG içinde mükemmellik girişimi Alman Federal tarafından finanse edilen ve hükümetlerin devlet) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln servet ve Maria-Pesch Vakfı Üniversitesi Köln, Almanya dan gelen hibe.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| BORULAR | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sükroz | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Proteaz ve Fosfataz inhibitör kokteyli | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL veya DynaMag Mıknatıs | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spektrofotometre | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bakteri döngüsü (10 & mikro; l) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Enstitüsü DSMZ-Alman Mikroorganizmalar | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-aktin antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-47778 | |
| anti-mCherry antikoru | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-10764 | |
| anti-v-ATPaz (V0) antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-28801 | |
| anti-v-ATPaz (V1) antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-20943 | |
| anti-katepsin D antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-17764 | |
| anti-kalneksin antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antikoru | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-20357 |
Kaynaklar
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-79....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Daha fazla makale keşfet
