Hücresel bileşenleri tanımlamak için basit Floresans tabanlı muhabir tahlil Risin toksin için Maya ticareti bir zincir (RTA) gerekli.

Björn Becker; Manfred J. Schmitt

doi:10.3791/56588

Yöntem makalesi

Hücresel bileşenleri tanımlamak için basit Floresans tabanlı muhabir tahlil Risin toksin için Maya ticareti bir zincir (RTA) gerekli.

DOI:

10.3791/56588

⸱

15 Aralık 2017

Björn Becker¹ , Manfred J. Schmitt¹

¹Molecular and Cell Biology, Department of Biosciences and Center of Human and Molecular Biology (ZHMB), Saarland University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El yazması, bir maya tabanlı Floresans muhabir tahlil kaçakçılığı dahil ve bitki toksin Risin (RTA) bir alt birim sitotoksik süreçleri öldürmek hücresel bileşenleri tanımlamak için nasıl kullanılacağını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel ve bitki A / B toksinler yararlanmak doğal ticaret yolları ökaryotik hücrelerde sitozol onların hücre içi isabet ulaşmak için ve en sonunda öldürmek için. Böyle A / B toksinler genellikle oluşur bir enzimatik etkin Asubunit (örneğin, "Risin" toksin (RTA)) ve bir veya daha fazla hücre için belirli bağlama toksin yüzey reseptörleri hücre için sorumlu olan Bsubunit(s), bağlama. Nasıl bizim mevcut bilgi A / B toksinler verimli endositoz ve intraselüler protein yüksek ökaryotik hücrelerde sıralama gibi temel hücresel mekanizmaları anlamaya yardımcı hücreleri bilim adamları sarhoş edici yetenekli. Tıbbi açıdan, aynı şekilde büyük toksin ticaret yolları hastalar için yeterli tedavi çözümleri bulmak veya sonunda kanser tedavisi için tedavi toksin tabanlı uygulamalar geliştirmek için tanımlamak önemlidir.

Beri genom çapında analizleri a / B toksin memeli hücrelerinde kaçakçılığı, zaman alıcı, karmaşık ve pahalı, çeşitli çalışmalarda a / B toksin taşıma Saccharomyces cerevisiaeMaya model organizma olarak gerçekleştirilen. Maya ve daha yüksek ökaryotik hücrelerin daha az karmaşık, temel hücresel süreçler olmasına rağmen çok sık Maya elde edilen sonuçlar ve vardır benzer memeli durumuna aktarılabilir.

Burada, hücre içi RTA Maya ticareti analiz etmek için hızlı ve kolay muhabir tahlil açıklayın. Yeni tahlil önemli bir avantajı sitozol sadece RTA retro-translocation endoplazmik retikulum (ER) üzerinden araştırmak için bir fırsattır, ama oldukça endositoz ve retrograd toksin acil servise plazma zarı taşıma. Tahlil geçici kullanma-in RTA toksisite Floresans emisyon yeşil flüoresan protein (GFP) aracılığıyla dolaylı ölçüm sağlar bir muhabir plazmid vivo içinde çeviri sonra. RTA verimli 28S rRNA depurination tarafından protein biyosentezi inisiyasyon önlediğinden bu tahlil konak hücre proteinleri tanımlaması değişiklikleri tespiti yoluyla hücre içi RTA ulaşım dahil Floresans emisyon sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etkili tedavi tedaviler hala büyük ölçüde eksik olduğundan hastalarda bulaşan bakteri üreten toksin tarafından her sosyal sağlık sistemi için ciddi bir tıbbi ve mali yük özellikle temsil eder. Yeni tedavi stratejileri, tıbben a karmaşık bağımlılık yapan maddeler mekanizmaları geliştirmek için / B toksinler kolera toksini, Shiga toksin veya "Risin" gibi tam olarak uygulanmalıdır roman güçlü deneyleri üzerinde dayalı moleküler seviyede anlaşılması gerekir.

Son yıllarda, birçok araştırma A analiz girişiminde / B toksin taşımacılığında Maya ve radyoaktif toksin gibi zaman alıcı ve maliyet yoğun yöntemleri kullanarak memeli hücreleri etiketleme ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Resim 1' de genel deneysel iş akışı genel bakış tasvir edilir.

Dikkat: RTA insanlar için çok toksiktir. Emanet laboratuvar izni S2 (Biyogüvenlik seviye 2 eşdeğeri) gereklidir. Lütfen tüm deneme sırasında eldiven.

1. Contegra ifadesi O'nun öğesini RTA Escherichia coli olarak

E. coli hücreleri ifade plazmid pET24-RTA_{(onun) 6}veya standart elektroporasyon protokolleri⁹^,¹⁰kullanarak boş vektör pET24a⁽⁺⁾ ile dönüşümü. Boş plazmid içeren hücreler bir negatif kontrol hizmet ve....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kabaca başarılı RTA ve sonraki GFP muhabir tahlil deney için tek adımları özetleyen Resim 1, bu el yazması açıklanan Protokolü'nün genel iş akışı gösterilmektedir. Tek tek her adım daha ayrıntılı bir açıklamasını iletişim kuralında bulunabilir. Şekil 2 bir başarılı RTA arıtma beklenen sonucu benzeşme Kromatografi (şekil 2A) ve boş vektör kontrolü (şekil 2B) tarafından gö.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki Protokolü gerçekleştirirken, biz deneme başarılı bir sonuç elde etmek için aşağıdaki önerileri öneririz.

Kapaklı protein ifade için 1 mM IPTG konsantrasyonu aşmayacak şekilde önemlidir. IPTG konsantrasyonları > 1 mM inhibe organizatörü kaynaklı RTA ifade ve toksin verimleri düşürmek için kurşun. Ayrıca, hücreleri 28 ° C eklenmesi vücut oluşumu, verimsiz katlama ve toksin inactivation önlemek için daha yüksek sıcaklıklarda ekili olmamalıdır. RTA ifade (örneğin, 20-28 ° C.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada parçalar (SFB 1027, A6) Deutsche Forschungsgemeinschaft hibe tarafından desteklenen nazik vardı.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bakteri ve maya suşları
E. coli BL21 DE3(Altın)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 delesyon mutantları	Dharmacon	YSC1054	tüm koleksiyon
Name	Company	Katalog Numarası<	strong>Comments
Bu protokolde kullanılan plazmitler
pET24a⁽⁺⁾(Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA_(His6)	Becker et al. (2016)³
Name<	strong>Company	Katalog Numarası	Yorumlar
Reagents
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250	hücre duvarı için litik enzim çıkarma
LB et suyu ortamı	Thermo Scientific	10855021	Plaka üretimi için 15 g agar eklendi
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Amonyum sülfat	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Lösin içermeyen maya bırakma karışımı supplemts	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-glikoz	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-rafinoz	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-galaktoz	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Termo Bilimsel
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
İmidazol	Roth	3899.1
SAYFA cetvel önceden boyanmış	Fermentas	26616	protein merdiveni Batı analizi için kullanılır
Ad< / strong><	strong>Company< / strong>	Katalog Numarası< / strong>	Yorumlar<
güçlü>RTA saflaştırma, tuzdan arındırma ve okuyucu ölçümleri için malzeme
Spektrofotometre Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		eski model, diğer modeller mevcut
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	eski model, artık mevcut değil
ve Auml; KTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	Ürünün üretimi durduruldu ve değiştirildi
HisTRAP HP sütunu	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP tuz giderme sütunu	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart steril filtre	Sartorius	16534K	0.2 & mikro; m gözenek boyutu
BCA protein test kiti	Pierce	23225
660 nm test kiti	Thermo Scientific	22660
96 kuyulu plakalar	Thermo Scientific	260860
Name<	strong>Company	Katalog Numarası	Comments
Antikorlar (isteğe bağlı), < / güçlü >
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	birincil antikoru; 1: 1.000 seyreltme
Anti-fare-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	ikincil antikor, 1: 10.000 seyreltme

11811031

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Maya Modeli Floresan Rapor r Analizi GFP Ekspresyonu Protein Trafi i Endositoz Retrograd Ta ma Afinite Safla t rma Tuz Giderme Kolonu Ak Sitometrisi

Hücresel bileşenleri tanımlamak için basit Floresans tabanlı muhabir tahlil Risin toksin için Maya ticareti bir zincir (RTA) gerekli.

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler