Yöntem makalesi

Hücresel bileşenleri tanımlamak için basit Floresans tabanlı muhabir tahlil Risin toksin için Maya ticareti bir zincir (RTA) gerekli.

DOI:

10.3791/56588

15 Aralık 2017

Bu makalede

Özet

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El yazması, bir maya tabanlı Floresans muhabir tahlil kaçakçılığı dahil ve bitki toksin Risin (RTA) bir alt birim sitotoksik süreçleri öldürmek hücresel bileşenleri tanımlamak için nasıl kullanılacağını açıklar.

Özet

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel ve bitki A / B toksinler yararlanmak doğal ticaret yolları ökaryotik hücrelerde sitozol onların hücre içi isabet ulaşmak için ve en sonunda öldürmek için. Böyle A / B toksinler genellikle oluşur bir enzimatik etkin Asubunit (örneğin, "Risin" toksin (RTA)) ve bir veya daha fazla hücre için belirli bağlama toksin yüzey reseptörleri hücre için sorumlu olan Bsubunit(s), bağlama. Nasıl bizim mevcut bilgi A / B toksinler verimli endositoz ve intraselüler protein yüksek ökaryotik hücrelerde sıralama gibi temel hücresel mekanizmaları anlamaya yardımcı hücreleri bilim adamları sarhoş edici yetenekli. Tıbbi açıdan, aynı şekilde büyük toksin ticaret yolları hastalar için yeterli tedavi çözümleri bulmak veya sonunda kanser tedavisi için tedavi toksin tabanlı uygulamalar geliştirmek için tanımlamak önemlidir.

Beri genom çapında analizleri a / B toksin memeli hücrelerinde kaçakçılığı, zaman alıcı, karmaşık ve pahalı, çeşitli çalışmalarda a / B toksin taşıma Saccharomyces cerevisiaeMaya model organizma olarak gerçekleştirilen. Maya ve daha yüksek ökaryotik hücrelerin daha az karmaşık, temel hücresel süreçler olmasına rağmen çok sık Maya elde edilen sonuçlar ve vardır benzer memeli durumuna aktarılabilir.

Burada, hücre içi RTA Maya ticareti analiz etmek için hızlı ve kolay muhabir tahlil açıklayın. Yeni tahlil önemli bir avantajı sitozol sadece RTA retro-translocation endoplazmik retikulum (ER) üzerinden araştırmak için bir fırsattır, ama oldukça endositoz ve retrograd toksin acil servise plazma zarı taşıma. Tahlil geçici kullanma-in RTA toksisite Floresans emisyon yeşil flüoresan protein (GFP) aracılığıyla dolaylı ölçüm sağlar bir muhabir plazmid vivo içinde çeviri sonra. RTA verimli 28S rRNA depurination tarafından protein biyosentezi inisiyasyon önlediğinden bu tahlil konak hücre proteinleri tanımlaması değişiklikleri tespiti yoluyla hücre içi RTA ulaşım dahil Floresans emisyon sağlar.

Giriş

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etkili tedavi tedaviler hala büyük ölçüde eksik olduğundan hastalarda bulaşan bakteri üreten toksin tarafından her sosyal sağlık sistemi için ciddi bir tıbbi ve mali yük özellikle temsil eder. Yeni tedavi stratejileri, tıbben a karmaşık bağımlılık yapan maddeler mekanizmaları geliştirmek için / B toksinler kolera toksini, Shiga toksin veya "Risin" gibi tam olarak uygulanmalıdır roman güçlü deneyleri üzerinde dayalı moleküler seviyede anlaşılması gerekir.

Son yıllarda, birçok araştırma A analiz girişiminde / B toksin taşımacılığında Maya ve radyoaktif toksin gibi zaman alıcı ve maliyet yoğun yöntemleri kullanarak memeli hücreleri etiketleme ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Resim 1' de genel deneysel iş akışı genel bakış tasvir edilir.

Dikkat: RTA insanlar için çok toksiktir. Emanet laboratuvar izni S2 (Biyogüvenlik seviye 2 eşdeğeri) gereklidir. Lütfen tüm deneme sırasında eldiven.

1. Contegra ifadesi O'nun öğesini RTA Escherichia coli olarak

  1. E. coli hücreleri ifade plazmid pET24-RTA(onun) 6 veya standart elektroporasyon protokolleri9,10kullanarak boş vektör pET24a(+) ile dönüşümü. Boş plazmid içeren hücreler bir negatif kontrol hizmet ve....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kabaca başarılı RTA ve sonraki GFP muhabir tahlil deney için tek adımları özetleyen Resim 1, bu el yazması açıklanan Protokolü'nün genel iş akışı gösterilmektedir. Tek tek her adım daha ayrıntılı bir açıklamasını iletişim kuralında bulunabilir. Şekil 2 bir başarılı RTA arıtma beklenen sonucu benzeşme Kromatografi (şekil 2A) ve boş vektör kontrolü (şekil 2B) tarafından gö.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki Protokolü gerçekleştirirken, biz deneme başarılı bir sonuç elde etmek için aşağıdaki önerileri öneririz.

Kapaklı protein ifade için 1 mM IPTG konsantrasyonu aşmayacak şekilde önemlidir. IPTG konsantrasyonları > 1 mM inhibe organizatörü kaynaklı RTA ifade ve toksin verimleri düşürmek için kurşun. Ayrıca, hücreleri 28 ° C eklenmesi vücut oluşumu, verimsiz katlama ve toksin inactivation önlemek için daha yüksek sıcaklıklarda ekili olmamalıdır. RTA ifade (örneğin, 20-28 ° C.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada parçalar (SFB 1027, A6) Deutsche Forschungsgemeinschaft hibe tarafından desteklenen nazik vardı.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bakteri ve maya suşları
E. coli BL21 DE3(Altın)Aligent Technologies230130
S. cerevisiae BY4742EuroscarfY10000
S. cerevisiae BY4742 delesyon mutantlarıDharmaconYSC1054tüm koleksiyon
NameCompanyKatalog Numarası<strong>Comments
Bu protokolde kullanılan plazmitler
pET24a(+) (Novagen)Millipore69772-3
pET-RTA(His6)Becker et al. (2016)3
Name<strong>CompanyKatalog NumarasıYorumlar
Reagents
Zymolyase 20TUSBioZ1000.250hücre duvarı için litik enzim çıkarma
LB et suyu ortamıThermo Scientific10855021Plaka üretimi için 15 g agar eklendi
YNBThermo ScientificDF0335-15-9
Amonyum sülfatSigma-AldrichA4418-100G
Lösin içermeyen maya bırakma karışımı supplemtsSigma-AldrichY1376-20G
AgarSigma-Aldrich05040-100G
D-glikozSigma-AldrichG8270-100G
DTTSigma-Aldrich10197777001
D-rafinozSigma-Aldrich83400-25G
D-sorbitolSigma-AldrichS1876-1KG
D-galaktozSigma-AldrichG0750-10MG
G418Termo Bilimsel
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
İmidazolRoth3899.1
SAYFA cetvel önceden boyanmışFermentas26616protein merdiveni Batı analizi için kullanılır
Ad< / strong><strong>Company< / strong>Katalog Numarası< / strong>Yorumlar<
güçlü>RTA saflaştırma, tuzdan arındırma ve okuyucu ölçümleri için malzeme
Spektrofotometre Ultrospec 2100 proAmersham
Soniprep 150MSEeski model, diğer modeller mevcut
Fluoroskan AscentThermo Scientific5210470eski model, artık mevcut değil
ve Auml; KTAPurifierThermo Scientific28406266Ürünün üretimi durduruldu ve değiştirildi
HisTRAP HP sütunuGE Healthcare17-5248-02
HiTRAP tuz giderme sütunuGE Healthcare11-0003-29
Midisart steril filtreSartorius16534K0.2 & mikro; m gözenek boyutu
BCA protein test kitiPierce23225
660 nm test kitiThermo Scientific22660
96 kuyulu plakalarThermo Scientific260860
Name<strong>CompanyKatalog NumarasıComments
Antikorlar (isteğe bağlı), < / güçlü >
Anti-Tetra-HisQiagen34670birincil antikoru; 1: 1.000 seyreltme
Anti-fare-HRPSigma-AldrichA9044-2MLikincil antikor, 1: 10.000 seyreltme
11811031

Kaynaklar

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
  2. Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Maya ModeliFloresan Rapor r AnaliziGFP EkspresyonuProtein Trafi iEndositozRetrograd Ta maAfinite Safla t rmaTuz Giderme KolonuAk Sitometrisi

İlgili makaleler