Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi
Bu makalede
Özet
Özet
Bir yöntem bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için sabit bakterilerde etiketleme için tanımlanır. smFISH mRNA kopya numarası ilgi genlerin hücre hücre değişkenlik ölçümü transkriptleri hücre altı konumunu sağlar. Ana adımları bakteriyel hücre kültürü fiksasyonu, hücre zarları permeabilization ve hedef transkript hibridizasyon setleri ile piyasada kısa Oligonükleotid fluorescently etiketli probları vardır. smFISH farklı floresan işaretleri arasında spektral örtüşme tarafından uygulanan sınırlamaları ile aynı hücrede birden çok gen transkript görüntüleme izin verebilirsiniz. Aşağıda resimli Protokolü tamamlanmasını takiben, hücreleri kolayca düşük yoğunluktaki floresan için uygun bir fotoğraf makinesi ile birleştiğinde bir mikroskop kullanarak yansıması. Bu görüntüler, segmentasyon faz kontrast kare veya hücre zarı boyama, elde edilen hücre dağılımları ile birlikte mRNA kopya numarası dağıtım örneği açık kaynak veya özel olarak yazılmış yazılım kullanarak hücre hesaplama sağlar. Burada açıklanan etiketleme yöntemi Ayrıca resmi transkript Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına) ile uygulanabilir.
Giriş
Stochasticity gen ifadesinin temel ve kaçınılmaz bir unsuru ve hücre-hücre heterojenite1, transkriptler ve proteinler2,3düzeyinde hem de açmaktadır. İyi tanımlanmış koşullar altında hücreler arasında değişkenlik miktarının benzersiz bir pencere gen ekspresyonu ve onun yönetmelik altında yatan temel işlemleri halinde sunmaktadır. Bakterilerde hücre-hücre heterojen bir önemli kaynağı transkripsiyon düzeyinde gerçekleşir. Transkript numaraları sadece stochasticity transkripsiyonu, aynı zamanda düzenleme gibi çoğu işlemleri nedeniyle küçük RNA'ların ve RNAases2tarafı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. sonda tasarım
Not: Bu protokol piyasada bulunan Oligonükleotid probları zaten fluorophores ile öğesini kullanır. Sondalar belirli dizileri bir hedef için tamamlayıcı bir dizi oluşur mRNA, floresan molekülünü Birleşik her sonda. Alternatif olarak, başka bir yerde5,16açıklandığı gibi probları için floresan işaretleri eklemek mümkündür.
- Tasarım smFISH sondalar Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); tarafından geliştirilen Probe Tasarımcısı16 algoritması kullanılarak Bu el yazması kullanılan smFISH sondalar dizisi m....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Biz smFISH ölçümleri galK ve sodB transkript E. coli hücrelerdeki yürüttü. Transkript belirli dizileri için hedef sıra, floresan molekülünü Birleşik her sonda tamamlayıcı bir dizi melezleşmiştir (malzemelerin tabloya bakın). Floresan ve faz kontrast görüntüleri MG1655 vahşi-tip e.coli suşu (WT) veya bir JW0740 (Keio koleksiyon)19 galK silinmiş yük (ΔgalK) 2 mm D-fucose şekil 1A ve 1Bgösterili.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
E. coli hücrelerdeki smFISH yöntem2kullanarak farklı genler transkript sayısı bizim laboratuvar olarak ölçülen var. Kısacası, bu yordamı aşağıdaki adımlardan oluşur: hücre fiksasyon, membranlar sonda penetrasyon için izin vermek için permeabilization sonda hibridizasyon ve örnek bir standart floresan mikroskop kullanarak görüntüleme. Bu yordam önceden yayınlanmış olanlar bazı değişiklikler6,7,16i.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser bir İsrail Bilim Vakfı Hibe 514415 (js) ve bir BSF-NSF (MCB) hibe 2016707 (js) tarafından desteklenmiştir. Destek Siegfried ve Irma Ullman ne bağlı elektrikli sandalyeye (js) da kabul edilmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dekstran sülfat sodyum tuzu | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Saf Etanol, %99,5, ACS reaktifi, mutlak | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Dietilpirokarbonat (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNaz içermeyen 20X SSC | Yaşam Teknolojileri/Ambion | AM9763 | |
| RNaz içermeyen 10X PBS | Yaşam Teknolojileri/Ambion | AM9625 | |
| TE tamponu (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, moleküler biyoloji için | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nükleaz içermeyen su | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Moleküler biyoloji için formaldehit çözeltisi, suda %36,5-38 | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deiyonize formamid, nükleaz içermez | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonükleik asit, escherichia'dan transfer tipi xx) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg / ml) | Thermo Fisher Scientific / Ambion | AM2616 | |
| Vanadil-ribonükleozit kompleksi, VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poli-L-Lizin | Sigma | P4707 | |
| Sisteamin ve oksijen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Aspergillus niger'den Glikoz Oksidaz, Tip VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Katalaz | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glikoz | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fukoz | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Hücre Etiketleme Çözeltisi Ömrü | Teknolojiler | V2286 | |
| Agaroz, düşük erime noktalı reaktif | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Yapıştırıcı silikon izolatör 24-2mm Çap X 1.8 mm derinlik JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 < / açıklık>666208 | |
| poli-D-lizin kaplı cam alt Cam Alt Kültür Yemekleri | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Süper yaşam nitril pudrasız muayene eldivenleri | Supermax | TC-N-9889 | |
| Marka sterilizasyon inkübatör bandı | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Mikrosantrifüj tüpleri (1.8 ml) | Axygen - Corning Yaşam Bilimleri | MCT-175C | |
| Falcon yuvarlak tabanlı polipropilen tüpler (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Konik tabanlı santrifüj polipropilen tüpler (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serolojik pipetler (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serolojik pipetler (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serolojik pipetler (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spektrofotometre küvetleri | Sarstedt | 67.742 | |
| RNaz içermeyen pipet uçları 0,2 - 20 μ l | FroggaBio | FT20 | |
| RNaz içermeyen pipet uçları 10 - 200 μ l | Axigene / corning | TF-200 | |
| RNaz içermeyen pipet uçları 100 - 1000 μ l | FroggaBio | FT1000 | |
| RNaz içermeyen pipet uçları 100 - 1000 μ l | Sorenson | 14200 | |
| Şırınga tek kullanımlık 10 mL iğne G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Şırınga Filtresi | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon aletleri mikroskop tipi A daldırma yağı A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Mikroskop slaytları 76 x26, 3 "x1" x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| # 0 lamel slayt 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital çalkalayıcı | M.R.C | TOU-50 | |
| Sıcak blok | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E Mikrosantrifüj | |
| Eppendorf | 5427R | ||
| Santrifüj | Eppendorf | 5810R | |
| Taşınabilir Pipet Yardımı XP2, Pipet Kontrol Cihazı | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Bakteri Büyüme Oranları için Spektrofotometre DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD kamera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti mikroskop | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X yağ objektif lambda PH-3 NA 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filtre seti (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filtre seti (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR otomatik reaserch yazılımı | Nikon | MQS31000 | |
| STORM mikroskobu | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 suya daldırma objektif | Olympus | ||
| SRX görüntü elde etme ve analiz yazılımı | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD kamera | Fotometri | ||
| Stellaris® FISH Probları, CAL Fluor ile Özel Test® Kırmızı 590 Boya | Biyoarama Teknolojileri A.Ş | SMF-1083-5 | |
| Prob Dizisi: < / güçlü> | |||
| gtgttttttttttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| Gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| atattgttcagcgagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probları, Quaser Fluor ile Özel Test® Kırmızı 670 Boya | Biyoarama Teknolojileri A.Ş | SMRNA için SMF-1083-5 | |
| Prob Dizisi: < / güçlü> | |||
| gtgttttttttttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| Gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| atattgttcagcgagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttaçäca |
Kaynaklar
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14)....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
