Yöntem makalesi

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

DOI:

10.3791/56600

⸱

21 Aralık 2017

 ,  , 
1Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir yöntem bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için sabit bakterilerde etiketleme için tanımlanır. smFISH mRNA kopya numarası ilgi genlerin hücre hücre değişkenlik ölçümü transkriptleri hücre altı konumunu sağlar. Ana adımları bakteriyel hücre kültürü fiksasyonu, hücre zarları permeabilization ve hedef transkript hibridizasyon setleri ile piyasada kısa Oligonükleotid fluorescently etiketli probları vardır. smFISH farklı floresan işaretleri arasında spektral örtüşme tarafından uygulanan sınırlamaları ile aynı hücrede birden çok gen transkript görüntüleme izin verebilirsiniz. Aşağıda resimli Protokolü tamamlanmasını takiben, hücreleri kolayca düşük yoğunluktaki floresan için uygun bir fotoğraf makinesi ile birleştiğinde bir mikroskop kullanarak yansıması. Bu görüntüler, segmentasyon faz kontrast kare veya hücre zarı boyama, elde edilen hücre dağılımları ile birlikte mRNA kopya numarası dağıtım örneği açık kaynak veya özel olarak yazılmış yazılım kullanarak hücre hesaplama sağlar. Burada açıklanan etiketleme yöntemi Ayrıca resmi transkript Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına) ile uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stochasticity gen ifadesinin temel ve kaçınılmaz bir unsuru ve hücre-hücre heterojenite1, transkriptler ve proteinler2,3düzeyinde hem de açmaktadır. İyi tanımlanmış koşullar altında hücreler arasında değişkenlik miktarının benzersiz bir pencere gen ekspresyonu ve onun yönetmelik altında yatan temel işlemleri halinde sunmaktadır. Bakterilerde hücre-hücre heterojen bir önemli kaynağı transkripsiyon düzeyinde gerçekleşir. Transkript numaraları sadece stochasticity transkripsiyonu, aynı zamanda düzenleme gibi çoğu işlemleri nedeniyle küçük RNA'ların ve RNAases2tarafından değişir. Doğrudan erişim Bu heterojenlik nicel bir moda bir fluorescently smFISH içinde belirli bir gen bireysel Tutanaklar etiketleyerek yoludur. Bu metodoloji algılama ve belirli RNA molekülleri, hücre altı yerelleştirme sabit, bireysel bakteri hücreleri4sağlar. mRNA'ların seçmeli olarak faiz5,6transkript bağlamak için tasarlanmış fluorescently etiketli ~ 20 Bankası-uzun oligonucleotides bir dizi melezleşmiştir. Birden çok etiket yukarıda arka plan Floresans algılama sağlar ve bireysel mRNA molekülleri kırınım-sınırlı noktalar bir floresan mikroskop altında7 (bkz: şekil 1) olarak görünür. MRNA molekülleri, tamamlayıcı oligomer probları ikincil fluorescently etiketli muhabir teknikleri8kullanarak algılanır konjuge anhidridler (örneğin, biotin veya digoxigenin) taşımak etiketleme için diğer yaklaşım vardır.

Tutanaklar, ek olarak smFISH hakkında kantitatif bilgi başka yöntemleri de vardır. Kuzey gibi bazı leke veya kantitatif PCR, toplu yoklama ve böylece ne mRNA kopya sayısı ne de tek tek hücreler içindeki konumlarını ölçebilirsiniz. Bu nedenle bu yöntemler hücre hücre değişkenlik ölçmek uygun değildir. Hata-sağlam Floresans in situ hibridizasyon (MERFISH) hem RNA'ların kopya numarası hücrelerindeki hem de denilen hücre içi konumlarını miktar multiplexed için izin veren bir son görüntü tabanlı teknik geliştirilmiştir. MERFISH tanımlanmış bir arada sabit sayıda Oligonükleotid fluorescently etiketli sonda gelen oluşan benzersiz bir barkod atama temel alır. Bu barkodları smFISH ölçümleri sıralı tur olarak okunduğu, photobleaching ile hibridizasyon, böylece artan işlem hacmi iki büyüklük9,10tarafından aşağıdaki her yuvarlak. Bu teknik bir otomatik akışkan sistemi ve sonda kümesinin uygun tasarım gerektirir.

Birden çok floresan Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)11gibi roman süper çözümleme teknikleri ile birlikte bireysel transkript etiketlerine göre ile birlikte çözünürlükte panolarında bir artış sağlar transkript hücre altı lokalizasyonu. FIRTINADA, Floresans emisyon (yanıp sönen) prob molekül başına birden fazla döngüleri için uygun kombinasyonu floresan problar ve görüntüleme arabellek sağlar. Fırtına da E. coli transcriptome görüntü ve aynı anda transkriptlerinizin faiz12etiketleme tarafından RNA, genom çapında mekansal organizasyonu gözlemlemek için kullanılabilir.

Yukarıda gözden tüm tek hücreli yöntemleri sabit hücrelerdeki transkript görüntüleme üzerinde temel alır. Bu nedenle, onlar transkript hücrelerdeki Kinetik özelliklerinin ile ilgili herhangi bir bilgi vermeyin. Transkript canlı hücreleri13izlemek için mRNA'ların ilgi siteleri bağlama, bir dizi gen füzyonu tarafından etiketli. Bu ikinci o zaman bakteriyofaj gibi yeşil flüoresan protein (GFP)10,14,15floresan bir protein için erimiş MS2 kat protein gibi bir RNA-bağlayıcı protein tarafından tanınır.

Burada DNA probları fluorescently etiketli smFISH deneyler, kullanmak için bir dizi bireysel mRNA'ların özellikle E. colietiketleme yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, aynı etiketleme şeması fırtına ölçümleri ile küçük değişiklikler için kullanılan gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. sonda tasarım

Not: Bu protokol piyasada bulunan Oligonükleotid probları zaten fluorophores ile öğesini kullanır. Sondalar belirli dizileri bir hedef için tamamlayıcı bir dizi oluşur mRNA, floresan molekülünü Birleşik her sonda. Alternatif olarak, başka bir yerde5,16açıklandığı gibi probları için floresan işaretleri eklemek mümkündür.

  1. Tasarım smFISH sondalar Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); tarafından geliştirilen Probe Tasarımcısı16 algoritması kullanılarak Bu el yazması kullanılan smFISH sondalar dizisi malzemeleri tabloda listelenir.
    Not: Minimum algılanabilir sinyal için bir küme probları ~ 30 sayısıdır. Özellikle çok kısa transkript ölçülür Eğer hassas numarası faiz, gen göre değişebilir.
  2. Optik kurulum uygun bir boya seçin (malzemelerin tabloya bakın).
    Not: Cy3 boya veya düşük bir fotoğraf beyazlatma duyarlılık ile optik eşdeğer bir boya önerilir. Çift etiketleme için bir Cy5 ya da bir optik eşdeğer adaydır boya (malzemelerin tabloya bakın). Fırtına görüntüleme etiketli mRNA uygun boyaları kapasitelerini Floresans emisyon birden fazla döngüleri için karakterizedir. Bazı smFISH boya kullanılabilir fırtına görüntüleme için (malzeme tabloya bakın). İki (veya daha fazla) Tutanaklar aynı hücrede farklı genler karşılık gelen görüntü biri olan spectra az veya hiç çakışma var boyalar için Birleşik Oligonükleotid probları seçmelisiniz.

2. reaktif hazırlık

Not: Filtre uygulanmış pipet ipuçları ve tüpler gibi RNase free sarf malzemeleri kullanarak örnekleri RNAse free tutmak için ve herhangi bir çalışma ortamı temiz tutmak için önemlidir. Hedef transkript bozulma önlemek için hücre fiksasyon kullanılan tüm reaktifler nükleaz ücretsiz olması gerekir (malzemelerin tabloya bakın) veya diethylpyrocarbonate (DEPC)-tedavi ve sterilize.

  1. Arabellekleri için smFISH
    1. 1 x PBS (fosfat tamponlu tuz, bir fosfat tampon konsantrasyonu 0.01 M ve Sodyum Klorür konsantrasyon 0.154 m, (pH 7,4) ile çözüm) RNase free hazır olun. 10 x PBS RNase free seyreltik (malzemelerin tabloya bakın) nükleaz-serbest su (malzemelerin tabloya bakın) 1:10, v/v oranı.
      1. Alternatif olarak DEPC tedavi 1 hazırlamak PBS x.
    2. RNase free hazırlamak 2 x SSC (serum sodyum sitrat arabellek, 0,03 M sodyum sitrat, (pH 7,0) 0.3 M NaCl). RNase free seyreltik 20 x SSC (malzemelerin tabloya bakın) nükleaz ücretsiz su 1:10 v/v oranı.
      1. Alternatif olarak, DEPC tedavi 2 hazırlamak x SSC.
  2. Oligonükleotid sonda hisse senedi çözüm.
    1. Bir sonda hazır 25 µM. oluşturmak için TE arabelleği (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 200 µL kurutulmuş Oligonükleotid sonda grubunda yeniden dağıtılması Mix de tarafından yukarı ve aşağı, pipetting ve sonra girdap ve santrifüj kısaca.
    2. Donma ve hisse senedi çözüm tüp tezcan önlemek için karşılık gelen tutarı çalıştırmak tek bir deneysel kullanılacak beklenen stok çözümün birkaç aliquots edin. -20 ° c veya daha düşük stok çözüm depolamak ve ışıktan korumak.
      Not: 250 hibridizasyon reaksiyonlar 5 nmol sonda kümesi sağlar.
  3. Hibridizasyon arabellek (aşağıdaki Skinner vd. 7 ):
    1. 5 mL su nükleaz ücretsiz 50 mL polipropilen alt konik tüp ekleyin. Dextran sülfat 1 g için su ekleyin ve dinç vortexing tarafından çözülür. Kadar kabarcıklar (~ 30 min) ortadan içeriği bir orbital shaker karıştırın.
    2. Deiyonize suyla formamide, E. coli tRNA, 10 mg çözüm 3,530 µL 20 SSC x 1 mL, 100 µL 200 mM vanadyl-ribonucleoside kompleks ve 50 mg/ml BSA 40 µL ekleyin. Homojen olana son hacim için 10 mL DEPC tedavi su veya su nükleaz-Alerjik ve girdap eklenmesi tarafından çözüm getirin.
      Not: donma ve erime çözüm önlemek için karşılık gelen tutarı çalıştırmak tek bir deneysel kullanılacak beklenen stok çözümün birkaç aliquots olun. Mağaza-20 ° C'de hisse senedi çözüm Şişeyi açmadan önce oda sıcaklığına kadar sıcak formamide bildirin emin olun. Arka plan azaltmak için en uygun formamide konsantrasyonu (% 10-40 hacmen oranı) kalibre için önerilmektedir.
      Uyarı: UYARI! Formamide çok zehirli ve bilinen bir teratogen. Gözleri ya da deri, solunum veya sindirim ile temasından sakının. Bir duman başlık altında koruyucu eldiven ve önlük giyerken başa.
    3. Çözüm 0,22-µm filtreden geçirilerek sterilize. Aliquots içinde tutmak ve bir yıl için-20 ° C depolama yapar.
  4. 1 x PBS'ye % 37 formaldehit (v/v) ekleyerek fiksasyon arabellek (1 x PBS % 4.6 formaldehit) hazırlamak (bkz. 2.1.1) 1:8 v/v oranı ve girdap.
    DİKKAT: UYARI! Formaldehit çok zehirli ve bilinen bir kanserojen. Bir duman başlık altında koruyucu eldiven ve önlük giyerken başa.
  5. SmFISH için yıkama arabellek hazırlamak (% 20 formamide 2 x SSC) 2'ye deiyonize suyla formamide ekleyerek x SSC (bkz: 2.1.2) 1:4 v/v oranı ve girdap.
  6. Görüntüleme arabellek arabellek yıkamak için 5 mM cysteamine ve oksijen gidericiler (7 µM glikoz oksidaz, 56 nM katalaz ve % 10 glikoz (w/v)) ekleyerek smFISH için hazırlamak (% 20 formamide 2 x SSC)
  7. Fırtına arabellekleri
    1. Arabellek A 50 mM Tris-HCl ve 10 mM NaCl nükleaz ücretsiz su ekleyerek hazırlayın.
      Not: RT yıl boyunca dükkanda.
    2. Arabellek B 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl ve % 10 w/v ekleyerek glikoz nükleaz ücretsiz su için hazırlayın.
      Not: Mağaza 4 ° C'de için bir yıl kadar.
    3. MEA arabellek 77 mg cysteamine 1 ml (1 M çözüm sağlar) arabelleği A çözülerek hazırlayın.
      Not: Bu 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.
    4. Gloxy arabellek 8,440 AU (rasgele adet) glikoz oksidaz ekleyerek hazırlamak ve 1 ml 70,200 AU katalaz tampon A.
      Not: 50 x hisse senedi çözüm, yapar o-ebilmek var olmak stok 4 ° C'de 1 ay için.
    5. MEA arabellek ve 1 Gloxy arabellek arabellek B. x 50 mM ekleyerek fırtına için görüntüleme arabellek hazırlamak
      Not: Görüntüleme arabellek fırtına için 5 mM cysteamine, oksijen gidericiler (7 µM glikoz oksidaz ve 56 nM katalaz) 50 mm Tris ile 10 mM NaCl ve % 10 glikoz pH 8.0 oluşur. Sadece görüntüleme önce hazırlamak, saklanır ve RT yaklaşık 2 saat için kullanılır.

3. örnek fiksasyon

  1. Bakteri hücreleri (örneğin, E. büyümek
coli MG1655) büyüme medya seçimi (örneğin, LB orta) gecede inan orbital shaker 260 devir/dakika ve 37 ° c
Not: arka plan sondalar non-spesifik bağlanması nedeniyle belirlemek için faiz gen silinmiş bir yük ölçümlerde, (bkz: şekil 1 ve ΔsodB içinde Δgalk aynı yordamı yapılmalıdır Şekil 2).
  • Gecede kültür 1: taze ortamda 100 sulandırmak ve optik yoğunluğu (OD600) bir Spektrofotometre 0,2 - değeri kadar her ~ 1 h ölçü birimi 0.4; 4 mL kültür-meli var olmak yeterli.
    Not: Seçilen mikroskop faz kontrast veya fark girişim kontrast yetenekleri varsa, E. coli dış membran 2 mikron lipofilik floresan marker ile Etiketlenmiş (malzemelerin tabloya bakınız), hangi eklenmektedir Bakteriyel süspansiyon 20 dk önce fiksasyon17. Fiksasyon ve daha ileri tedavi aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirilir. Bir farklı emisyon spektral örtüşme etiketli-sonda seti ile en aza indirmek için spektrum, sahip bir floresan işaretçisi seçmeye özen göstermelidir.
  • Pelet hücreleri tarafından Santrifüjü 4 ° C'de 4500 g de 5 min için Süpernatant tüm tüpler kaldırın.
  • 1 mL 1 x PBS için her tüpün ekleyin ve hücre-hücre toplama en aza indirmek için Pelet resuspend. Sonra yavaşça fiksasyon tampon ve girdap 4 mL ekleyin.
  • 24 ° C'de 30 min için bir orbital Çalkalayıcı-260 devirde örneklerinde kuluçkaya
  • Pelet hücreleri tarafından Santrifüjü 10 dk, 1000 g, 4 ° C. Süpernatant kaldırın. 1 mL 1 x PBS ekleyin.
  • Süspansiyonlar (malzemelerin tabloya bakın) 1.8 µL alt konik mikro-santrifüj tüpleri için aktarmak ve iki kere 3,6 adımı yineleyin.

    • 4. örnek Permeabilization

    1. Süpernatant çok dikkatli bir şekilde çıkarın. Küçük hacimli Pipetler, gerekirse, pelet dışında tüm sıvı kaldırmak kullanın.
    2. 300 µL DEPC tedavi su veya su nükleaz ücretsiz resuspend. 350 µL yüksek dereceli mutlak etanol (% 99) ekleyin ve karışımı yavaşça tüp ters çevirme. Etanol ve mix yeniden, son etanol konsantrasyonu % 70 (v/v oranı) ulaşmak için başka bir 350 µL ekleyin.
      DİKKAT: UYARI! Etanol yanıcı.
    3. Örnek 20 rpm (RT) oda sıcaklığında 1 h için bir tüp rotator ile döndürme, veya bir gece 4 ° C'de. Örnekleri 4 ° C'de bir haftaya saklanabilir.

    5. hibridizasyon

    1. Pelet hücreleri tarafından Santrifüjü 7 dk, 750 x g, 4 ° C. Süpernatant kaldırın.
    2. 1 mL % 20 örnekleri arabelleğe yıkama ve ayakta birkaç dakika veya pipet Pelet tamamen erimesi için bırakın ekleyin.
    3. Pelet hücreleri Santrifüjü için 750 x g, 4 ° c de 7 min tarafından
    4. Süpernatant çok yavaşça pipetting tarafından çıkarın. Küçük hacimli Pipetler gerekirse, pelet dışında tüm sıvı kaldırmak kullanın.
    5. Oligonükleotid sonda ayarla hisse senedi çözüm hibridizasyon arabellek aliquot böylece son Oligonükleotid konsantrasyon 250 eklemek nM; girdap şiddetle.
      Not: Bir iki veya daha fazla farklı hedef mRNA'ların aynı hücrede aynı anda etiketleyebilirsiniz. Her iki hedef grupları sonda hibridizasyon arabelleğe ekleyin. Boyalar farklı emisyon spektral örtüşme (örneğin, Cy3 ve Cy5) en aza indirmek için spectra sahip seçmek için özen göstermelidir. Fırtına görüntüleme için amaçlanan örnekleri ayarla (örneğin, tablo malzemelerin) fırtına için uygun bir boya ile konjuge bir Oligonükleotid sonda ile melezleşmiştir emin olun.
    6. (Bkz. Adım 5,4) örnekleri (çözüm oldukça viskoz) kabarcıklar nesil kaçınırken Oligonükleotid probları içeren 50 µL hibridizasyon arabelleği askıya.
    7. Örnekleri gece karanlıkta 30 ° C sıcak bir blok üzerinde bırakın.
      Not: Bu örnekleri 6 ay 4 ° C'de depolanmış olabilir

    6. çamaşır

    1. Görüntü için her örnek için bir yeni microcentrifuge tüp kullanın. 1 mL yıkama arabellek ekleyin.
    2. 10-15 µL melezleşmiştir örneklerinden yıkama tamponu ve mix/girdap içeren yeni tüp ekleyin.
    3. Pelet hücreleri tarafından 7 dakika aralıklarla, 750 x g 4 ° C'de Süpernatant kaldırın.
      Not: arka plan azaltmak için 30 ° C'de 1 h için kuluçkaya
    4. İki kez daha fazla yıkamak (1 mL yıkama arabellekte resuspend, santrifüj kapasitesi ve Pelet kaldırın).
    5. 25 µL yıkama arabellekte resuspend.
      Not: bir fotoğraf beyazlatma azaltmak için yıkama arabelleğe tek molekül Floresans deneyler6boya kararlılığını artırmak için sistem (2,6) atma bir oksijen ekleyebilirsiniz.

    7. görüntüleme için örnek hazırlanması

    Not: Hücreleri floresan ve faz kontrast mikroskop altında uygun görüntüleme izni vermesi için immobilize gerekir. Hangi bakış farklı alanları farklı odak uçaklar yansıma örnekleri hazırlamak için aşağıdaki yöntemleri kullanılabilir.

    1. Özel jel hazırlık
      1. 150 mg özel 10 mL 2 x SSC arabelleğe ekleyin. 2 eklemek değil x SSC için özel, ya da o değil düzgün dağıtılması.
      2. Mikrodalga fırında 10-15 s her zaman-e kadar büyük kabarcıklar oluşmaya başlar. Birkaç dakika soğuması için bir kenara koyun.
      3. Böylece slaytın Merkezi maruz kalır ayıran bir silikon çerçeve slayt üzerinde yer.
      4. Bir 10 mm çapında (1-2 mm kalınlığında) katı halka slaytın ortasına yerleştirin ve jel küçük bir miktar, sızdırmazlık için mevduat. Sertleşmesine o için birkaç dakika bekleyin.
      5. Yüksek kubbe şekli kurdu kadar daha jöle ekleyin. Sertleşmesine bunun için 10 dakika bekleyin ve (iyi cımbız veya başka bir yöntemi kullanarak) yüzük kaldırın.
      6. (Bkz: 6.5) yıkanmış bakteriyel hücre jel ve mühür #0 coverslip slayt ile ~ 10 μL Kasası.
    2. Odası numune hazırlama smFISH için
      1. Alternatif olarak (için adım 7.1) örnekleri (bkz: 6.5) yıkanmış bakteri hücreleri Poli-D-lizin-kaplı cam alt tek kullanımlık plastik petri yemekleri immobilizing tarafından görüntüleme için hazır olun.
      2. Karanlık gecede görselleştirme hücre yüzeyine yapışma sağlamak için önce oda sıcaklığında örneklerinde kuluçkaya. Görselleştirme daha önce bir kez yıkama arabellek ile yıkayın (. 5); smFISH (2,6) için yıkama buffer(2.5) veya görüntüleme arabellek ile ıslak örnek tutmak.
    3. Fırtına için odası numune hazırlama
      1. Örnekleri fırtına için Poli-D-lizin-kaplı cam alt tek kullanımlık plastik petri yemekler üzerinde görüntüleme için hazır olun.
      2. Örnekleri, RT, karanlık gecede kuluçkaya. Görselleştirme yıkama daha önce bir kez ile yıkama arabellek için smFISH (2.5); ve görüntüleme arabellek fırtına (2.7.5) ekleyin.

    8.Transkript görselleştirme

    1. Görüntü hücre motorlu bir sahne ile donatılmış geniş alanlı floresan mikroskop ile (malzemelerin tabloya bakın).
      Not: Bir boya ile floresan emisyon birden fazla döngüleri yetenekli etiketli hücreleri fırtına değiştirilmek üzere kullanın. 3D süper çözünürlük görüntüleme sistemi kullanarak örnek resim (örneğin, malzemelerin tabloya bakın).
    2. (Önerilen) kullan bir 60-100 x N.A > 1.3 yağı daldırma faz kontrast objektif lens cıva veya metal halide lamba; gibi güçlü bir ışık kaynağı ile LED tabanlı ışık kaynakları da önerilir.
    3. Bir standart soğutmalı CCD kamera, ideal olarak düşük ışık düzeyi görüntüleme hızı (biz kullanmak yerine bir kamera ile 16 µm piksel boyutu) için optimize edilmiş kullanımı (malzeme tabloya bakın).
      Not: Kullanım bir soğutulmuş EMCCD (elektron birleştiğinde şarj cihaz çarparak) kamera CCD kamera algılama, özellikle tek moleküllerin engeller termal gürültü azaltmak gereklidir.
    4. Filtresi kullan seçilen fluorophores için uygun ayarlar.
    5. Düzgün hücre sınırlarını belirlemek için her örnek faz kontrast optik ile veya dış hücre membran fluorescently etiketleme görünümünde farklı alanları görüntülerini elde etmek. Görüntüleri tüm kanallar için farklı odak uçaklar (z-yığın), (genellikle 13 dilimleri ayırarak tarafından 250 nm alınır).
      Not: Mikroskop ve filtre setleri, motorlu sahne ticari tarafından kontrol edilmelidir (malzemelerin tabloya bakın) ya da bir yığın görüntülerin sırayla yakalayabilir şirket içi bilgisayar yazılımı.

    9. veri analizi

    1. Görüntü yığınları veri analizi için uygun bir biçime dönüştürme.
    2. Hedef kopya sayısını tahmin mRNA floresan foci hücrede toplam yoğunluğunu, yerine ayrık 'noktalar' şu anda mevcut diğer iletişim kuralları olduğu gibi sayma.
    3. Görüntü analizi ile açık kaynak yazılım18 veya özel olarak oluşturulmuş bir program ile yerine getirir. Veri ayrıntıları için bkz: görüntüleme ve analiz Skinner vd. 7

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Sonuçlar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Biz smFISH ölçümleri galK ve sodB transkript E. coli hücrelerdeki yürüttü. Transkript belirli dizileri için hedef sıra, floresan molekülünü Birleşik her sonda tamamlayıcı bir dizi melezleşmiştir (malzemelerin tabloya bakın). Floresan ve faz kontrast görüntüleri MG1655 vahşi-tip e.coli suşu (WT) veya bir JW0740 (Keio koleksiyon)19 galK silinmiş yük (ΔgalK) 2 mm D-fucose şekil 1A ve 1Bgösterili...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Tartışma

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    E. coli hücrelerdeki smFISH yöntem2kullanarak farklı genler transkript sayısı bizim laboratuvar olarak ölçülen var. Kısacası, bu yordamı aşağıdaki adımlardan oluşur: hücre fiksasyon, membranlar sonda penetrasyon için izin vermek için permeabilization sonda hibridizasyon ve örnek bir standart floresan mikroskop kullanarak görüntüleme. Bu yordam önceden yayınlanmış olanlar bazı değişiklikler6,7,16i...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Açıklamalar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Teşekkürler

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Bu eser bir İsrail Bilim Vakfı Hibe 514415 (js) ve bir BSF-NSF (MCB) hibe 2016707 (js) tarafından desteklenmiştir. Destek Siegfried ve Irma Ullman ne bağlı elektrikli sandalyeye (js) da kabul edilmektedir.

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    Dekstran sülfat sodyum tuzuSigma-AldrichD8906
    Saf Etanol, %99,5, ACS reaktifi, mutlakMallinckrodt Baker - Avantor8025.25
    Dietilpirokarbonat (DEPC)Sigma-AldrichD5758
    RNaz içermeyen 20X SSCYaşam Teknolojileri/AmbionAM9763
    RNaz içermeyen 10X PBSYaşam Teknolojileri/AmbionAM9625
    TE tamponu (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, moleküler biyoloji içinSigma-Aldrich93283
    nükleaz içermeyen suThermo Fisher Scientific10977035
    Moleküler biyoloji için formaldehit çözeltisi, suda %36,5-38Sigma-AldrichF8775
    Deiyonize formamid, nükleaz içermezThermo Fisher Scientific/AmbionAM9342
    E. coli tRNA (ribonükleik asit, escherichia'dan transfer tipi xx)Sigma-AldrichR1753-500UN
    UltraPure BSA (50mg / ml)Thermo Fisher Scientific / AmbionAM2616
    Vanadil-ribonükleozit kompleksi, VRC, 200 mMNew England BiolabS1402S
    Poli-L-LizinSigmaP4707
    Sisteamin ve oksijenSigma-Aldrich30070
    Aspergillus niger'den Glikoz Oksidaz, Tip VII, 50KUSigma-AldrichG2133
    KatalazSigma-AldrichC40
    D-glikozSigma-AldrichG8270
    D-fukozSigma-AldrichF8150
    Vybrant DiO Hücre Etiketleme Çözeltisi Ömrü TeknolojilerV2286
    Agaroz, düşük erime noktalı reaktifSigma-AldrichA9414
    Yapıştırıcı silikon izolatör 24-2mm Çap X 1.8 mm derinlik JTR24R-A2-2.0Grace Bio-LabsJTR24R-A2-2.0 < / açıklık>666208
    poli-D-lizin kaplı cam alt Cam Alt Kültür YemekleriMatTek CorporationP35GC-1.5-14-C
    Süper yaşam nitril pudrasız muayene eldivenleriSupermaxTC-N-9889
    Marka sterilizasyon inkübatör bandıSigma-AldrichBR61750
    Mikrosantrifüj tüpleri (1.8 ml)Axygen - Corning Yaşam BilimleriMCT-175C
    Falcon yuvarlak tabanlı polipropilen tüpler (14 ml)BD Biosciences352059
    Konik tabanlı santrifüj polipropilen tüpler (50 ml)Corning430828
    Serolojik pipetler (Corning 5 ml)Corning Life Sciences4051
    Serolojik pipetler (Corning 10 ml)Corning Life Sciences4488
    Serolojik pipetler (Corning 25 ml)Corning Life Sciences4251
    Spektrofotometre küvetleriSarstedt67.742
    RNaz içermeyen pipet uçları 0,2 - 20 μ lFroggaBioFT20
    RNaz içermeyen pipet uçları 10 - 200 μ lAxigene / corningTF-200
    RNaz içermeyen pipet uçları 100 - 1000 μ lFroggaBioFT1000
    RNaz içermeyen pipet uçları 100 - 1000 μ lSorenson14200
    Şırınga tek kullanımlık 10 mL iğne G-21Becton Dickinson, BiosciencesBD-309643
    Minisart 0.2 um Şırınga FiltresiSartorius16534 K
    Nikon aletleri mikroskop tipi A daldırma yağı A, 8ccNikonMXA20233
    Mikroskop slaytları 76 x26, 3 "x1" x1mmThermo Fisher Scientific421-004ET
    # 0 lamel slayt 24x60Thermo Fisher Scientific/MenzelBNBB024060A0
    Orbital çalkalayıcıM.R.CTOU-50
    Sıcak blokM.R.C
    VortexFried Electric CompanyG-560-E Mikrosantrifüj
    Eppendorf5427R
    SantrifüjEppendorf5810R
    Taşınabilir Pipet Yardımı XP2, Pipet Kontrol CihazıDrummond Scientific Company4-000-501-I
    OD600 Bakteri Büyüme Oranları için Spektrofotometre DiluPhotometerMidsciOD600-10
    iXon X3 EMCCD kameraAndorDU-897E-CS0-#BV
    Eclipse Ti mikroskopNikonMEA53100
    CFI plan apochromat DM 100X yağ objektif lambda PH-3 NA 1.45 WD 0.13NikonMRD31905
    Filtre seti (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LPNikon49005
    Filtre seti (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660PNikon49009
    Nis-elements AR otomatik reaserch yazılımıNikonMQS31000
    STORM mikroskobuVutaraSR-200
    NA 1.2 suya daldırma objektif Olympus
    SRX görüntü elde etme ve analiz yazılımıVutara
    Evolve 512 EMCCD kameraFotometri
    Stellaris® FISH Probları, CAL Fluor ile Özel Test® Kırmızı 590 BoyaBiyoarama Teknolojileri A.ŞSMF-1083-5
    Prob Dizisi: < / güçlü>
    gtgttttttttttcagactc
    tagccaaatgcgttggcaaa
    ctgaatggtgtgagtggcag
    caccaatcaaattcacgcgg
    acgaaaccgtcgttgtagtagtc
    tgataatcaatcgcgcaggg
    gtggtgcacaactgatcacg
    acgcgaactttacggtcatc
    gctgattttcataatcggct
    gcatcgagggaaaactcgtc
    gttttcatgtgcgacaatgg
    cacgccacgaacgtagttag
    ttacgcagttgcagatgttt
    tccagtgaagcggaagaact
    tgctgcaatacggttccgac
    gtccagcggcagatgataaa
    tgaccgttaagcgcgatttg
    agcctacaaactggttttct
    gcggaaattagctgatccat
    aaggcatgatctttcttgcc
    cagtgagcggcaatcgatca
    tgggcatggaaactgctttg
    gatgatgacgacagccacac
    gggtacgtttttgaagttactg
    gtgttgtattcgctgccaac
    ggtttcgcactgttcacgac
    tggctgctggaagaaacgcg
    ttcaatggtgacatcacgca
    catgcgcaacaacagcgttgaac
    ggcgttttcagtcagtatat
    atacgtttcaggtcgccttg
    tgagactccgccatcaactc
    Gaaatcatcgcgcatagagg
    caatttgcggcacggtgatt
    ttgacgatttctaccagagt
    acctttgtcgccaatcacag
    atattgttcagcgagctt
    gtctctttaatacctgtttt
    ctccttgtgatggtttacaa
    Stellaris® FISH Probları, Quaser Fluor ile Özel Test® Kırmızı 670 BoyaBiyoarama Teknolojileri A.ŞSMRNA için SMF-1083-5
    Prob Dizisi: < / güçlü>
    gtgttttttttttcagactc
    tagccaaatgcgttggcaaa
    ctgaatggtgtgagtggcag
    caccaatcaaattcacgcgg
    acgaaaccgtcgttgtagtagtc
    tgataatcaatcgcgcaggg
    gtggtgcacaactgatcacg
    acgcgaactttacggtcatc
    gctgattttcataatcggct
    gcatcgagggaaaactcgtc
    gttttcatgtgcgacaatgg
    cacgccacgaacgtagttag
    ttacgcagttgcagatgttt
    tccagtgaagcggaagaact
    tgctgcaatacggttccgac
    gtccagcggcagatgataaa
    tgaccgttaagcgcgatttg
    agcctacaaactggttttct
    gcggaaattagctgatccat
    aaggcatgatctttcttgcc
    cagtgagcggcaatcgatca
    tgggcatggaaactgctttg
    gatgatgacgacagccacac
    gggtacgtttttgaagttactg
    gtgttgtattcgctgccaac
    ggtttcgcactgttcacgac
    tggctgctggaagaaacgcg
    ttcaatggtgacatcacgca
    catgcgcaacaacagcgttgaac
    ggcgttttcagtcagtatat
    atacgtttcaggtcgccttg
    tgagactccgccatcaactc
    Gaaatcatcgcgcatagagg
    caatttgcggcacggtgatt
    ttgacgatttctaccagagt
    acctttgtcgccaatcacag
    atattgttcagcgagctt
    gtctctttaatacctgtttt
    ctccttgtgatggtttaçäca
    . ggatçagcgcgacgatacag . ggatçagcgcgacgatacag

    Kaynaklar

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
    2. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
    3. Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
    4. van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523(2016).
    5. Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
    6. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
    7. Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
    8. Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628(2014).
    9. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
    10. van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
    11. Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
    12. Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
    13. Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
    14. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
    15. Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
    16. So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
    17. Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
    18. Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
    19. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8(2006).
    20. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
    21. Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Yeniden basım ve izinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

    İzin iste

    Etiketler

    Single molecule FISHE coli mRNA labelingvisualizationFluorescent oligonucleotide probesBacterial cell fixationPermeabilization protocolHybridization bufferAgarose gel mountingFluorescence microscopySTORM imaging

    İlgili makaleler