Yöntem makalesi

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon kullanarak fare tetkikine genetik Vivo içinde değişiklik kurucu ve indüklenebilir sistemleri

DOI:

10.3791/56613

⸱

2 Şubat 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine II, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Pneumology, Center for Medicine, Medical Center University of Freiburg

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon transposon dayalı Tümleştirme vektörlerin sağlar fare tetkikine istikrarlı transfection içinde vivo. Burada, tek bir transgene uzun vadeli kurucu ifade veya kombine kurucu ve Doksisiklin indüklenebilir ifade bir transgene veya miR-shRNA karaciğerde sağlayan pratik bir protokol transfection sistemler mevcut.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karaciğer kanseri, rejenerasyon, inflamasyon ve fibrozis araştırma modelleri esnek sistemler içinde vivo gen ekspresyonu ve susturmak için son derece yararlıdır. Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon transposon tabanlı yapıları, hepatositlerin yetişkin farelerde genetik manipülasyon için verimli bir yöntemdir. Kurucu transgene ifade ek olarak, bu sistem shRNA-aracılı gen knock-down, dolaylı, gen mutasyonlarının ikna etmek için CRISPR/Cas9 sistem veya indüklenebilir sistemleri gibi daha gelişmiş uygulamalar için kullanılabilir. Burada, bünye CreER ifade ile birlikte bir transgene indüklenebilir ifade birleşimi veya miR-shRNA tercih Bu teknik bir örnek olarak sunulur. Uyuyan güzelhazırlanması başlangıç Multi-step yordamı kapak-transposon oluşturur, enjeksiyon ve tedavi farelerin ve analiz için karaciğer dokusu hazırlanması için immunostaining tarafından. Sunulan sistem tetkikine karmaşık genetik manipülasyon elde etmek için güvenilir ve etkili bir yaklaşımdır. Cre/loxP tabanlı fare suşları ile birlikte özellikle yararlıdır ve karaciğer hastalığının araştırmasında modeller çeşitli uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kronik karaciğer hastalığı önemli sağlık yük dünya çapında1sunar. Hayvan araştırma modelleri karaciğer hastalığı çalışmanın temel araçlar ve karaciğer rejenerasyonu, karaciğer iltihabı ve yağlanma yanı sıra karaciğer kanseri2karmaşık sorulara cevap yardımcı oldu. Bu hayvan modellerin önemli bazı karaciğer hücreleri genetik değişiklik olmasına bağlıdır. Bu nedenle, yararlı3gen ekspresyonu tetkikine içinde işlemek için verimli araçlar bulunmaktadır. Kurulan yolu üreme genetiği fare suşları veya viral vektörler oluşturulmasında Hepatosit enfeksiyon gibi zaman alıcı, her iki liman güvenlik endişeleri, veya tetkikine vivo içinde zavallı transgene ifade verim 4 , 5. hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon (HTVI) bırakmak için kolay, hızlı ve maliyet-etkin sorgu karaciğerde gen işlevinin tetkikine vivo içinde transfection için alternatif bir yöntem olduğunu. HTVI için istenen DNA dizisi taşıyan bir vektör serum enjekte hayvanın vücut ağırlığının % 10'una karşılık gelen bir birimdeki feshedilmiştir. Çözüm sonra 5-10 s6içinde kuyruk damar içine enjekte edilir. Kardiyak çıkış aşan, serum karaciğer genişlemesi ve hidrodinamik transfection tetkikine7' nin önde gelen karaciğer damarlar içine inferior vena kava akar. İstikrarlı genomik entegrasyonu sağlamak için yöntem transposon tabanlı vektörel çizimler, güzellik - uykutransposon sistemi gibi ile birleştirilmiştir. Bu sistemler bir güzellik - uykutransposase8,9tarafından katalize genomik rekombinasyon siteleri ile hedef vektörel çizimler rekombinasyon aracılık. Karaciğer fibrozis ya da karsinojenezis modeller için bu kez overexpress veya sessizlik genlerin hastalık modeli belirli zaman noktalarda için arzu edilir. Bu amaçla indüklenebilir gen ekspresyonu Cre/LoxP-sistem veya tetrasiklin-indüklenebilir gen ifade system için araçları kullanılan10(Tet-On) olabilir.

Burada, HTVI bir uyuyan güzel transposon tabanlı sistemi kullanarak fare tetkikine vivo içinde transfection için bir protokol açıklayın. Bir karaciğer özgü organizatörü kontrol altında bir transgene istikrarlı, kurucu ifade bir protokolüne ek olarak, biz bünye tamoxifen bağımlı Cre recombinase (CreER) ifade ile birleştirir daha gelişmiş bir vektör sistemi tarif bir transgene veya shRNA (miR-shRNA), mikroRNA adapte indüklenebilir ifade denilen pTC TET-sistem11. Bu vektör sisteminde indüklenebilir transgenes veya miR-shRNAs tetrasiklin bağımlı ifade için bir recombinational klonlama sisteminde, yeni vektörel çizimler12hızlı ve kolay nesil ile omurga vektör içine klonlanır. Bu video tabanlı kılavuz indüklenebilir transgene/miR-shRNA ifade ulaşmak için hazırlanması uygun vektörel çizimler, enjeksiyon ve farelerde tedavi ve sonunda analiz için karaciğer dokusunun hazırlık kapsar. Bu protokol için açıklanan yöntemi fare sistemiyle ifade Cre/loxP aracılı herhangi bir kombinasyonu veya knock-down tercih, yapım o bir yerde geçerli sistem karaciğer hastalığı araştırmada herhangi bir gen etkinleştirmek için tasarlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri için bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanım esaslarına göre gerçekleştirilen ve sorumlu yetkilileri (Regierung von Oberbayern, Münih, Almanya ve Stanford hayvan Kurulusları ve kullanma, Komitesi tarafından kabul edildi Stanford, CA, Amerika Birleşik Devletleri). (Adım 1'den 4) klonlama için tüm plazmid listesi ek tablosunda S1 sağlanır.

1. kurucu gen ekspresyonu için bir Transgene klonlama

  1. Astar transgene amplifikasyon13,14için tasarım.
  2. Kısıtlama siteleri PacI (TTAATTAA için) 5' uç ileri astar için ekleyin. Kısıtlama siteleri ASCI (GGCGCGCC) veya FseI (GGCCGGCC) için 5' uç ters astar için ekleyin.
  3. Tarafından istenen transgene14için optimize edilmiş koşullar kullanarak PCR transgene yükseltmek. Piyasada bulunan bir DNA arıtma kit kullanarak arındırmak.
    Not: Saat tavlama adım 1.1 tasarlanmış astar bağlıdır., uzama süresi inşa uzunluğuna bağlıdır. Örneğin, bir 1000 bp uzunluğu kullanım 60 s uzama zaman yapısı için.
  4. Transgene ve vektör bünye gen ifade15 (bkz. Adım 1.2) ilgili kısıtlama nükleaz ve 37 ° C'de 50 µL toplam hacmi arabellek için gecede sindirmek. Örneğin, 5 adet PacI sahip yapı ve 5 adet FseI uygunsa sindirmek (bkz. Adım 1.2).
  5. Jel arındırmak sindirilir vektör ve üreticinin yönergelerine göre ticari jel ekstraksiyon kiti kullanarak ekle. Bir standart tüp ligasyonu 100 ng vektör ve 100 – 1000 ng 400 U T4 ligaz 14 ° c 16 h. ısı için devre dışı bırakabilirsiniz 65 ° C'de 10 dakikadır kullanarak ekleme gerçekleştirin.
  6. Yetkili bakteri bir standart ısı şok protokol16kullanarak dönüştürmek.
  7. Plaka üzerinde agar içeren 100 µg/mL Ampisilin tabaklar. 24 h 30 ° C'de kuluçkaya.
  8. Tek kolonileri almak, üreticinin yönergelerine göre bir ticari miniprep kit kullanarak plazmid DNA arındırmak ve sıra Sanger sıralama17 tarafından doğrulayın (sıralama astar: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
  9. Koloniler maxi için plazmid DNA amplifikasyon ölçeği ve üreticinin yönergelerine göre endotoksin-Alerjik plazmid hazırlık seti18 kullanarak arındırmak olumlu kullanın.
  10. Yapı enjeksiyon için hazır olduğunu, böylece adım 5 ile devam edin.

2. bir Transgene ile indüklenebilir gen ekspresyonu için klonlama

  1. Astar transgene amplifikasyon13,14için tasarım.
  2. Kısıtlama siteleri sacı (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) veya KpnI (GGTACC) için 5' uç ileri astar için ekleyin. Kısıtlama siteleri NotI (GCGGCCGC) veya XhoI (CTCGAG) için 5' uç ters astar için ekleyin.
  3. Tarafından istenen transgene14için optimize edilmiş koşullar kullanarak PCR transgene yükseltmek. Bir ticari DNA arıtma kit kullanarak arındırmak.
  4. Arıtılmış transgene ve giriş vektörünün 4 µg sindirmek (pEN_TTmcs-vektör, Tablo malzemelerigörmek) ayrıca (bkz: adım 2.2) uygun kısıtlama nükleaz ve arabellekte bir gecede 37 ° C'de 50 µL hacmi ile19 .
  5. Jel arındırmak sindirilir vektör ve üreticinin yönergelerine göre ticari jel ekstraksiyon kiti kullanarak ekle. 100 ng vektör ve 100 – 1000 ng 400 U T4 ligaz 14 ° c 16 h. ısı için devre dışı bırakabilirsiniz 65 ° C'de 10 dakikadır kullanarak ekleme ile standart ligasyonu gerçekleştirin.
  6. Yetkili bakteri bir standart ısı şok protokol16kullanarak dönüştürmek.
  7. Plaka üzerinde agar içeren 15 µg/mL gentamisin tabaklar. 16 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
  8. Tek kolonileri alın, plazmid DNA arındırmak ve pCEP ileri astar kullanarak sıralama17 tarafından INSERT doğrulayın: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
    Not: Astar pCEP ileri ile ön arıtma olmadan PCR tek koloniler üzerinde gerçekleştirilen ve pCEP ters (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). Bu adım olumlu kolonilerin ön seçim için yararlı olabilir.
  9. Adım 4'e geçin.

3. klonlama, miR shRNA indüklenebilir Gene Knock-down için

  1. MiR-shRNA oligonucleotides protokolü19klonlama pSLIK göre dizayn. Tavlama ve oligonucleotides arındırmak ve 1:20 GKD2O. seyreltik
  2. Özet 3 µg giriş vektörünün 5 U BfuAI 3 h için 50 ° c ile sonra 20 dk 65 ° C'de tepki devre dışı.
    Not: yeşil flüoresan protein (GFP) ortak ifade isterseniz bir giriş vektör olarak, aksi takdirde kullanım pEN_TTmiRc219pEN_TTGmiRc19 kullanın.
  3. Jel adım 2,5 olduğu gibi sindirilir vektör arındırmak. 100 standart birleştirmesini gerçekleştirmek vektör ng ve 1 µL saflaştırılmış ve shRNA oligonucleotides (Adım 3.1) seyreltilmiş ligaz 1 h. ısı için oda sıcaklığında devre dışı 65 ° c 10 dk 400 U T4 kullanarak.
  4. Yetkili bakteri bir standart ısı şok protokol16kullanarak dönüştürmek.
  5. Plaka üzerinde agar içeren 15 µg/mL gentamisin tabaklar. 16 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
  6. Tek kolonileri alın, plazmid DNA arındırmak ve INSERT Sanger sıralama17 tarafından doğrulayın (sıralama astar: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
  7. Adım 4'e geçin.

4. recombinational enjeksiyon için hazır klonlar oluşturmak için klonlama

  1. Mix 150 ng giriş vektörünün (--dan adım 2 veya 3. adım) ve 150 ng pTC TET-vektör20.
  2. TE arabellek 8 µL toplam bir birime eklemek (pH = 8).
  3. II ( Tablo malzemelerigörmek) buz için kuluçkaya 2 dk. girdap için iki kere LR-clonase enzim karışımı aktarın.
  4. LR-clonase enzim karışımı II 2 µL için tepki ekleyin ve 1 h için 25 ° C'de kuluçkaya.
  5. Reaksiyon İndinavir K-çözüm 1 µL ekleyerek durdurmak. 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
  6. Bir standart ısı şok protokol16kullanarak yetkili bakteri recombinational klonlama 2 µL ile karıştırın Stbl3 dönüşümü.
  7. Plaka üzerinde agar içeren 100 µg/mL Ampisilin tabaklar. 24 h 30 ° C'de kuluçkaya.
  8. Tek kolonileri almak, üreticinin yönergelerine göre endotoksin-Alerjik plazmid hazırlık seti18 kullanarak plazmid DNA arındırmak ve vektör bütünlük Sanger sıralama17 tarafından (sıralama astar 5' onaylamak AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
  9. Yapı enjeksiyon için hazır olduğunu, adım 5'e geçin.

5. çözüm hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon için hazırlanması

Not: Kurucu ve indüklenebilir gen ekspresyonu için hazırlık yapıları, 1, 2, 3 ve 4. adımda açıklanan.

  1. Enjeksiyon için steril % 0,9 serum hazırlamak (yapmak değil kullanma PBS). Fare vücut ağırlığının yaklaşık % 10'una karşılık gelen ses kullanın. Örnek: 20 g ağırlığında bir fare için 2 mL çözeltisi hazırlamak.
  2. Endotoksin-Alerjik plazmid arıtma seti18 (bkz. Adım 1.8 veya 4.8, sırasıyla) kullanarak saf enjeksiyon vektörel çizimler hazır olun.
  3. 10 µg veya 15 µg endotoksin ücretsiz uyuyan güzel vektör yapı ekleme (Adım 1 kullanım 10 µg gelen 4 kullanım 15 µg, sırasıyla adım) ve 1 µg endotoksin ücretsiz pc-HSB5 mL steril serum21 .
  4. Çözüm için en fazla 4 saat 4 ° C'de depolayın Dondurma değil.

6. performans gösteren hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon

  1. Bir restrainer kuyruk ven enjeksiyon (ticari veya 50 mL konik tüp delik nefes ve kuyruk ile hazırlanmış) için kullanın. Tüp alt doku kağıt ile doldurun.
  2. Enjeksiyon için yaklaşık 8-10 hafta-in yaş fareler ile 20-25 g ağırlık kullanın.
  3. Enjeksiyon önce fareler tartmak ve enjeksiyon hacmi vücut ağırlığına göre hazırlamak (vücut ağırlığının % 10'una karşılık gelen bkz: adım 5.1). Steril 3 mL-şırıngayla 27 G iğneyle enjeksiyon ve dolgu gerekli birim ile hazırlayın.
  4. Fare restrainer yerleştirin. Kağıt mendil miktarını ayarlayın (bkz. Adım 6.1) nefes için yeterli alan ama hareket için sadece minimum boşluk bırakmayı.
  5. Fare düzenli olarak nefes olun.
  6. Sıcak bir Kızılötesi lamba 30-60 s. için dikkatli bir şekilde kullanarak kuyruk, aşırı ısınma işaretlere dikkat.
  7. Kuyruk bir alkol bez ile temizleyin.
  8. İğne neredeyse yatay kuyruk tabanına yakın iki yanal kuyruk damarlar birini takın.
    Not: Eğer başarıyla yerleştirilmişse iğne koni geri az miktarda kan akışı. Bu iğne ek herhangi bir hareketi, yer değiştirme ve/veya yaralanma damarın içinde neden olabileceğinden aktif Aspire için tavsiye edilmez.
  9. Toplam hacim içinde 8-10 s kuyruk damar içine enjekte.
  10. Hemen fareyi restrainer kaldırın. En az 30 için yara enjeksiyon sıkıştırmak s veya herhangi bir kanama azalır kadar.
  11. Fare ayrı bir kafesin içine yerleştirin. Fare yordam (yaklaşık 30-60 dakika) kurtarıldı sonra fare orijinal kafese geri aktarın. Fareyi bir sonraki 24 h için düzenli olarak kontrol edin.
    Not: Fare hafif sedasyon enjeksiyon sonra en fazla 2 saat için rutin olarak görülmektedir.
  12. Daha fazla deney (Yani, adım 7) ile devam etmeden önce izni olmayan entegre vektörlerin 10-15 gün bekleyin.

7. indüksiyon Tamoxifen ile Transfected CreER

Dikkat: Tamoxifen zararlıdır, kanserli veya olabilir doğurganlık zarar. Güvenlik bilgi formu için bakınız.

  1. Mayi tamoxifen enjeksiyonları üç gün üst üste planlayın.
  2. 1 günde 10 mg 40 µL etanol tamoxifen geçiyoruz. 10 dk. girdap için 55 ° C'de tamoxifen eriyene kadar birkaç kez kuluçkaya.
  3. 960 µL mısır yağı ekleyin. 55 ° C'de 5 dakika için kuluçkaya Girdap net bir çözüm elde etmek için birkaç kez.
  4. 1-mL insülin şırınga çözümde bir 27 G iğne ile hazırlayın.
  5. Scruff fareyi fare dikkatli bir şekilde baş ve ikinci parmak ile boyun kapma tarafından el altyapı ve dördüncü ve beşinci parmak arasında kuyruk sabitleme.
  6. 0.1 mL (tamoxifen 1 mg =) çözümü intraperitoneally karın sol alt çeyrekte enjekte.
  7. Enjeksiyonlar ikinci ve üçüncü günlerinde tekrarlayın.

8. indüksiyon tetrasiklin bağımlı gen veya shRNA ifade

Uyarı: Doksisiklin zararlı olabilir. Güvenlik bilgi formu için bakınız.

Not: türüne ve deneme süresi bağlı olarak Doksisiklin içme suyu (Adım 8.1) veya chow (Adım 8.2) sağlanabilir

  1. Kısa süreli deneyler için (< 10 gün) Doksisiklin içme suyu aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak aracılığıyla yönetmek.
    1. 5 g Sükroz dokunun su 100 ml geçiyoruz. Basınçlı kap.
    2. 100 mg Doksisiklin-hyclate 5 mL sukroz çözeltisi (Adım 8.1.1) bir 15 mL konik tüp içinde çözülür.
    3. Bir 10 mL şırınga steril filtre solution'ı 0.2 µm filtre kullanarak. 8.1.1. adımda hazırlanan Sükroz çözüm ekleyin.
    4. Fare için içme suyu olarak Doksisiklin Sükroz çözüm kaynağı. Çözüm Bakteriyel büyüme (değiştir net çözüm en geç üç gün sonra) gösteren bulutlu olduğunda günlük ve Değiştir kontrol edin.
  2. Uzun süreli deneyler için (> 10 gün) veya metabolik değişiklikler için hassas deneyler ticari Doksisiklin-chow kullanın (örneğin, doksisiklin Hyclate Chow 0.625 g/kg) dehidratasyon ve/veya sukroz kaynaklı değişiklikleri tedavi hayvanların karaciğerleri önlemek için.

9. Immunostaining göre analiz için fare karaciğer hazırlanması

Uyarı: Paraformaldehyde zararlı olabilir. Güvenlik bilgi formu için bakınız.

Not: ne zaman fare incelenecek timepoint deney üzerinde bağlıdır. Bu karaciğer dokusu Doksisiklin tedavi yeterli indüksiyon transgene veya shRNA ifade emin olmak için en az üç gün sonra analiz etmek için tavsiye edilir.

  1. 27 G iğne 1 mL % 4 paraformaldehyde çözeltisi (PFA) ile 1 mL şırınga hazırla.
  2. Fare tarafından onaylanmış bir hayvan protokolüne göre uygun bir yöntem ötenazi.
    Not: Yönergeleri için uygun yöntemleri ötenazi kurum bağlı olarak değişebilir.
  3. Diseksiyon makası ve anatomik forseps kullanarak, karın boşluğu dikkatle karaciğer ortaya çıkarmak için medyan laparatomi ile açın. İnce bağırsak portal ven ve inferior vena kava (IVC) ortaya çıkarmak için sağa taşır.
  4. Hazır şırınga iğne takın (bkz. adım 9.1) IVC ve kesim portal ven içine. İngiltere'de yılın 1 mL yavaş yavaş karaciğer dokusu sıvı ve auto-floresan kırmızı kan hücreleri (immünfloresan boyama yapılır eğer arzu) kaldırmak için IVC enjekte.
  5. Karaciğer kaldırın. Suyla durulayın ve 5-10 mL % 4 İngiltere'de yılın çözeltisi için transfer.
  6. Parafin kesitler için 36-48 h. doku için düzeltme doku dehidratasyon ve parafin katıştırma için hazırdır.
  7. Donmuş bölümleri için % 4 dokusunda düzeltmek PFA 1 h için.
    1. Cryoprotection için % 10 Sükroz eriyik-e doğru nakletmek. 60 dk kuluçkaya.
    2. % 20 Sükroz eriyik-e doğru nakletmek. 60 dk kuluçkaya.
    3. % 30 Sükroz eriyik-e doğru nakletmek. 12-16 katıştırma olarak h. Embed donmuş bölümleri için bileşik kuluçkaya ve -20 ° C'de dondurmak

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfection etkinliği hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyonla: Hydrodynamically tarafından tek bir enjeksiyon transfected fare tetkikine yüzdesi değişkendir ve enjeksiyon hacmi, enjeksiyon zaman, enjekte DNA miktarı ve enjekte yapı6boyutu gibi birden çok parametre bağlıdır, 22,23. Ayrıca, transfection verimliliği genellikle nerede bir büyük damar çapı yanı sıra daha büyük sinüsoid...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tetkikine hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyonlu transfection sunulmasından bu yana daha 15 yıl önce kurulan bir yöntem olmuştur6. Enjekte birimi kardiyak çıkış aşıyor ve inferior vena kava karaciğer7transfection, yaklaşık 10-%20, bazı durumlarda tetkikine25,%2640 kadar önde gelen, sinusoids akar. Başarılı bir transfection belirleyicileri enjekte birim başına eklenen saat22,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa yoktur

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Deutsche Krebshilfe, Almanya (grant sayıya 111289 UE), Çocuk Sağlığı (Ernest ve Amelia Gallo donatılmış doktora sonrası bursu - CTSA grant sayıya UL1 RR025744 UE) Lucile Packard Vakfı tarafından desteklenmiştir. Vektör yapıları için Dr Mark A. Kay teşekkür ediyoruz ve deneysel tavsiye ve Dr Julien Sage fareler için ve deneysel destek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Genel Malzeme
GeneRuler 1 kb Plus DNA MerdiveniThermo Fisher#SM1331elektroforez için DNA merdiveni
Tissue-Tek O.C.T.Sakura4583kriyo-kesitlerin gömülmesi
Biozym LE AgaroseBiozym840004
Etidyum bromürSigma-AldrichE7637-1G
D (+) - SakkarozCarl Roth4621.1Doksisilin çözeltisinin tatlandırılması için
Ampisilin Sodyum TuzuAppliChemA0839,0010Amp'e dayanıklı klonların
LB Agar (Luria/Miller)Carl RothX969.1
LB Et Suyu (Luria/Miller)Carl RothX968.1
S.O.C. OrtaThermo Fischer15544034
Gentamisin sülfatAppliChemA1492,0001Gentamisin dirençli klonların seçimi için
Roti-Histofix %4 Fa. RothP087.6para-formaldehit çözeltisi
T4 DNA LigazNew England BioLabsM0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzim Karışımıinvitrojen/ThermoFisher11791-020LR-klonaz enzim karışımı II ve proteinaz K
DB3.1 içerir Yetkin HücrelerThermo Fisher11782-018
Stbl3 Kimyasal Olarak Yetkin E. coliThermo FisherC737303
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Kısıtlama Enzimleri
PacINew England BioLabsR0547S
AscINew England BioLabsR0558S
FseINew England BioLabsR0588S
SacINew England BioLabsR0156S
SpeINew England BioLabsR0133S
KpnINew England BioLabsR0142S
NotINew England BioLabsR0189S
XhoINew England BioLabsR0146S
BfuAINew England BioLabsR0701S
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Kits
QIAquick Jel Ekstraksiyon KitiQiagen28704Jel
NucleoSpin Jel ve PCR Temizlemeiçin Nagel740609.10
NucleoBond PC20Macherey & Nagel740571Plazmid ekstraksiyonu (Mini hazırlık)
NucleoBond PC500Macherey & Nagel740574Plazmid ekstraksiyonu (Maxi hazırlık)
Phusion Yüksek Sadakatli DNA PolimerazThermo FisherF530S
İsimCompanyKatalog NumarasıYorumlar
>Fare Deneyleri için Malzemeler
Injekt Şırınga F 1 mlBraun9166017Vİntraperitoneal enjeksiyon için
Omnifix Luer 3 mlBraun4616025Vİntravenöz enjeksiyon için
Sterican Kanül 24GBraun4657675
Sterican Kanül 27GBraun4657705
TamoksifenSigma-AldrichT5648-1GCreER aktivasyonu için
Mısır yağıSigma-AldrichC8267-500MLTamoksifen enjeksiyonları için taşıyıcı
Doksisiklin hyclateAppliChemA2951,0025Tetrasiklin bağımlı ekspresyonun aktivasyonu
Injekt 10 ml ŞırıngaBraun4606108V
Filtropur S 0.2Sarstedt831,826,001Doksisiklin
NaCl filtrasyonu için %0,9Braun3200905 İntravenöz enjeksiyonlar için taşıyıcı
Falcon Konik Tüp 50mlCorning Yaşam Bilimleri352095
Kızılötesi LambaN/AN/AFare kuyruğunun ısınması için
IVISPerkin Elmer124262In vivo görüntüleme sistemi
NameCompanyKatalog Numarası>Comments
Uyuyan güzelin klonlanması için plazmitler-HTVI.
pTCn/aYapısal gen ekspresyonu için vektör, ref. 15
pEN_TTmcsAddgene #25755İndüklenebilir gen ekspresyonu için giriş vektörü, ref. 19
pEN_TTGmiRc2Addgene #25753GFP'nin ortak ekspresyonu ile indüklenebilir miR-shRNA ekspresyonu için giriş vektörü, ref. 19
Addgene #25752GFP'nin ko-ekspresyonu olmadan indüklenebilir miR-shRNA ekspresyonu için giriş vektörü, ref. 19
CMV promotor ile indüklenebilir gen veya miR-shRNA ekspresyonu için ekspresyon vektörü, ref. 11
seçimi için, için transpozon vektörleri pEN_TTmiRc2 pTC ApoE-Tet Addgene #85578 ApoE.HCR.hAAT promotor ile indüklenebilir gen veya miR-shRNA ekspresyonu için ekspresyon vektörü, ref. 11 pTC-CMV-Tet Addgene #85577

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159(2014).
  2. Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
  3. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  4. Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236(2014).
  5. Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
  6. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  7. Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029(2014).
  8. Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
  9. Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
  10. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  11. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
  12. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
  13. Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  15. Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
  16. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
  19. Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
  20. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
  21. Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50(2007).
  22. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
  23. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
  24. Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
  25. Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
  26. Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
  27. Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
  28. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  29. Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
  30. Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
  31. Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
  32. Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
  33. Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
  34. Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894(2016).
  35. Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
  36. Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
  37. Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
  38. Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
  39. Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936(2015).
  40. Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
  41. Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
  42. Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
  43. Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79(2014).
  44. Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023(2014).
  45. Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sleeping Beauty TranspozonuCreER nd klenebilir SistemiGen Ekspresyon AnaliziKaraci er Dokusu Haz rlamaTamoksifen nd ksiyon ProtokolDoksisiklin Uygulama Y ntemiBiyol minesans G r nt leme Tekni iPlazmid Konstr kt Haz rlamaFare Hepatosit Transfeksiyonu

İlgili makaleler