Bu kağıt malzemelerin ve monosit hedefleme peptid Amfifil micelles içeren bir yöntem sunar ve Biyouyumluluk ve monosit için bağlamak için micelle yeteneğini sınamak için ilgili deneyleri.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Monosit hedefleme peptid Amfifil Micelles için düşsel ateroskleroz sentezi
Bu makalede
Özet
Özet
Ateroskleroz hangi 17.3 milyon kişinin hayatına her yıl kalp-damar hastalıkları, dünya çapında, ölüm önde gelen nedenidir için büyük bir katkıda bulunuyor. Ateroskleroz da miyokard infarktüsü, rüptürü ve damar uyarmadan tıkamanın kararsız plaklardan tarafından teşvik ve ani ölüm önde gelen nedenidir. Geçerli görüntüleme yöntemleri rüptürü istikrarlı ve kararsız plaklar arasında ayırt edemez. Özellikle hastalıklı doku için bağlamak moieties hedefleyen çeşitli ile değiştirilebilir gibi peptid amphiphiles micelles (PAMs) bu dezavantaj üstesinden gelebilir. Monosit monosit büyük birikimi rüptürü eğilimli plaklar ile ilişkili olmakla birlikte ateroskleroz, erken işaretler olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, monosit hedefleyebilirsiniz nano tanecikleri ateroskleroz farklı aşamalarında ayırımcılık için kullanılabilir. Bu amaçla, biz burada, monosit hedefleme-PAMs hazırlık için bir protokol tarif (monosit chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs kendinden 15 formu nano tanecikleri için hafif koşullarda sentez yoluyla monte nm ile çapı nötr yüzey şarj yakınındaki. Vitro, PAMs Biyouyumlu bulundu ve monosit için yüksek bağlama ilgi vardı. Burada açıklanan yöntemleri ateroskleroz yanı sıra diğer inflamatuar hastalıklar geniş bir uygulama yelpazesi için umut verici.
Giriş
Kalp-damar hastalıkları önde gelen yaklaşık 17.3 milyon ölüm dünya çapında1ile tüm dünyada ölüm nedenleri olarak kalır. Kalp-damar hastalıkları ateroskleroz, hangi arterler, böylece inhibe kan ve oksijen akışı vücut2,3hücrelere plaklar inşa bir koşul tarafından katkıda bulunmuştur. Ateroskleroz ilerleme bir enflamatuar yanıt, düzensiz lipid metabolizması ve plak birikmesi, plak rüptürü ve miyokard infarktüsü4,5' e lider tarafından kalınlaşma ve damar sertliği içerir. Endotel hücreleri monosit6,....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: MSDS reaktifler için okumak ve tüm kimyasal güvenlik önlemleri yerel kurum tarafından gerektiği gibi izleyin.
1. MCP-1 PAMs hazırlanması
-
MCP-1 peptid hazırlanması
- Fmoc-L-Lys (Boc) 0,25 mmol tartmak-Wang bir reaksiyon gemi (RV) içinde. 5 mL dimethylforamide (DMF) ile RV tarafında kimyasal duman mahallede durulayın.
- RV bir otomatik benchtop peptid synthesizer üzerine yükleyin. Önceden paketlenmiş amino asit şişeleri, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', c N-terminus yükleyin. Vasıl belgili tanımlık son final deprotection adım için boş bir şişe içerir.
Not: Şifreli bir peptit dizisi, N '-....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
MCP-1 PAM hazırlanması
MCP-1 protein [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] veya şifreli peptid [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] CCR2-bağlama motif (artıkları 13-35) N-terminus üzerinde bir sistein kalıntı ekleyerek güncellenmiştir. MCP-1 peptid bir Fmoc-aracılı katı faz yöntemiyle bir otomatik peptid synthesizer kullanarak sentez. Ham peptid ters fazlı HPLC C8 sütun kullanarak %0,1 50 ° C'de tarafından saflaştırıldı TFA Asetonitril/su karışımları ve maldı kütle spektrometresi (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
MCP-1 PAMs bir hidrofilik hedefleme peptid ve nanoparçacık kendi kendine monte doğası sürücüler hidrofobik kuyruk oluşan bir umut verici moleküler görüntüleme platformu vardır. Bu monosit hedefleme micelle basit sentez ve arıtma adımlardan MCP-1 peptid ve DSPE-PEG (2000)-MCP-1 tarafından hazırlanmış olabilir. PAMs vivo içinde gibi moleküler görüntüleme için birçok yararlı özelliklere sahip kendi kendinden montajlı altında hafif koşulları, iç biodegradability ve yapısal ve kimyasal çeşitlilik diğer görüntüleme mo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Yazarlar mali desteği ile University of Southern California, ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (NHLBI), R00HL124279, Eli ve Edythe geniş inovasyon ödülü ve L.K. Whittier Vakfı sigara kanser kabul etmek istiyorum EJC için verilen translasyonel araştırma ödülü. Yazarlar Merkezi elektron mikroskobu ve Microanalysis, Center of Excellence NanoBiophysics içinde Center of Excellence için moleküler karakterizasyonu ve Translational görüntüleme Merkezi, University of Southern California için yardım için teşekkür ederiz enstrümantal kurulumları.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Peptit sentezi için | 1,2-etanedithiol | VWR | E0032 |
| 10 mL tek kullanımlık serolojik pipetler | Hücre kültürü için | VWR | 89130-898 |
| 15 mL santrifüj tüpleri, polipropilen | uygulamalar için | VWR | 89401-566 |
| 2,5-dihidroksibenzoik asit, %99 | MALDI 25 | ||
| mL tek kullanımlık için Fisher Scientific AC165200050 serolojik pipetler | kültürü için | VWR | 89130-900 |
| 2-Merkaptoetanol, 50 mM | kültürü için | ThermoFisher Scientific | 31350010 |
| 5 mL tek kullanımlık serolojik pipetler | Hücre kültürü için | VWR | 89130-896 |
| 50 mL santrifüj tüpleri | uygulamalar için | VWR | 89039-658 |
| 75 cm2 kültür şişesi | Fisher Scientific | Hücre kültürü için 13-680-65 | |
| 75 mL reaksiyon kabı | Peptit sentezi için | 3000005 | |
| 96 kuyulu hücre kültürü plakası | MTS tahlili için | VWR | 40101-346 |
| Asetonitril, HPLC sınıfı | HPLC saflaştırması için | Fisher Scientific | A998SK-4 |
| Borosilikat cam, PAM | sentezi için | VWR | 66011-041 |
| Borosilikat cam pipet, Çeşitli | uygulamalar için | VWR | 14673-043 |
| Lamel, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mm | Konfokal mikroskopi için | Fisher Scientific | 12-542B |
| Cy5 amin | Abcam | ab146463 | Peptit çökeltme için |
| dietil eter, ACS sınıfı | Fisher Scientific | E138-1 | |
| Tek kullanımlık şırıngalar, | HPLC saflaştırması için | Fisher Scientific | 14-817-54 |
| Hücre sayımı için | çift neubauer kurallı hemositometre | VWR | 63510-13 |
| Peptit konjugasyonu için | DSPE-PEG (2000) amin | Avanti | 880128P |
| için | DSPE-PEG (2000 | ||
| ) -NHS ester ve nbsp; | konjugasyon için | Nanocs | PG2-DSNS-10K |
| Hücre kültürü için | Sigma Aldrich | D5796-500ML | |
| Fetal sığır serumu, nitelikli, ısıyla inaktive edilmiş | ThermoFisher Bilimsel | 10438026 | kültürü için |
| Fmoc-L-Ala-OH / HBTU | Protein Teknolojileri | Peptit sentezi | |
| için PS3-H5-APeptit sentezi için Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Teknolojileri | PS3-H5-RBF | Peptit |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH/HBTU | Protein Teknolojileri | Peptit sentezi için | Fmoc-L-Cys |
| (Trt)-OH /HBTU | Protein Teknolojileri | Peptit sentezi için | PS3-H5-CT |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Teknolojileri | Peptit sentezi için | PS3-H5-QT |
| Peptit sentezi için | Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Teknolojileri | PS3-H5-I |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Teknolojileri | PS3-H5-L | Peptit sentezi için |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Teknolojileri | Peptit sentezi için | PS3-H5-KBC |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Teknolojileri | PS3-H5-F | |
| Peptit sentezi için | Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Teknolojileri | PS3-H5-SB |
| Peptit sentezi için | Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Teknolojileri | PS3-H5-TB |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Teknolojileri | Peptit sentezi için | PS3-H5-YB |
| Peptit sentezi için | Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Teknolojileri | PS3-H5-V |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang reçinesi, peptit sentezi için 100-200 gözlü | Novabiochem | 856013 | |
| Formik asit, optima LC / MS sınıfı | HPLC saflaştırması için | Fisher Scientific | A117-50 |
| Konfokal mikroskopi için | Gliserol | VWR | M152-1L |
| Hücre sayımı için | el çetele sayacı | Fisher Scientific | S90189 |
| Manyetik karıştırma çubukları, | peptit konjugasyonu için | VWR | 58949-006 |
| Metanol, ACS sertifikalı | PAM sentezi için | Fisher Scientific | A412-4 |
| MTS hücre proliferasyonu kolorimetrik test kiti MTS | tahlili için | VWR | 10191-104 |
| N, N-Dimetilformamid, sıralama derecesi | Peptit sentezi için | Fisher Scientific | BP1160-4 |
| N-Metilmorfolin | Peptit sentezi için | Protein Teknolojileri | S-1L-NMM |
| Paraformaldehit | Fisher Scientific | AC416780250 | sabitlemek için |
| PBS, pH 7.4 | uygulamalar için | ThermoFisher Scientific | 10010049 |
| Penisilin/streptomisin, 10.000 U/mL | kültürü için | ThermoFisher Scientific | |
| 15140122 Peptit sentez kabı, 25 mL& nbsp; | Peptit sentezi için | Fisher Scientific | CG186011 |
| Fosfotungstik asit | TEM | Fisher Scientific | A248-25 |
| Peptit sentezi için | P1146-2.5LTGL | ||
| Düz cam mikroskop lamı 75 x 25 mm | Konfokal mikroskopi | Fisher Scientific | 12-550-A3 |
| Reaktif rezervuarları, steril ve nbsp; | Hücre kültürü için | VWR | 95128093 |
| TEM için | kendiliğinden kapanan cımbız | ||
| TEM için TEM destek filmi | TedPella | 01814F | |
| Trifloroasetik asit | Peptit bölünmesi ve HPLC saflaştırması için | Fisher Scientific | BP618-500 |
| Peptit bölünmesi için | triizopropilsilan | VWR | TCT1533-5ml |
| Tripan mavisi çözeltisi, | hücre sayımı için | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
| konfokal mikroskopi için | genel amaçlı tırtıklı | VWR | 231-SA-SE |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murin monosit |
| otomatik tezgah üstü peptit sentezleyici | Protein Teknolojileri | PS3 Tezgah Üstü Peptit Sentezleyici | |
| ve alfa; - siyano-4-hidroksisinnamik asit, | MALDI için | Sigma Aldrich | 476870-2G |
Kaynaklar
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
- Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
