Bu iletişim kuralı ile nörotransmitter Glutamat wholemount sıçan retina vitro kimyasal neurostimulation bir tür inceleme için bir roman yöntemi açıklar. Kimyasal neurostimulation konvansiyonel elektrik neurostimulation retina nöronların tarafından photoreceptor dejeneratif hastalıklara neden geri dönüşü olmayan körlük tedavisinde umut verici bir alternatiftir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Biomimetic kimyasal Neuromodulation, sıçan retina nörotransmitter Glutamat Vitro ile için metodoloji
Bu makalede
Özet
Özet
Photoreceptor dejeneratif hastalıklar photoreceptor hücrelerinin ilerici kaybı yoluyla onarılamaz körlüğü retinada neden. Retina protezleri yapay olarak anlaşılır görsel algı hastalarda alabilme umuduyla hayatta kalan retina sinir hücreleri uyararak vizyon geri yüklemek için aramak photoreceptor dejeneratif hastalıklar için gelişmekte olan bir tedavi vardır. Geçerli retina protezleri görme zorluğu hastalara elektriksel olarak retina teşvik ama yüksek keskinlik, doğal vizyon hastalara yeniden önemli fiziksel engelleri yüz için bir dizi elektrot kullanarak geri yükleme başarısı göstermiştir. Kimyasal neurostimulation yerli nörotransmitter kullanarak biomimetic seçimli-e doğru elektrik stimülasyon ve elektrik neurostimulation kullanarak retina protezler ile ilişkili temel sınırlamaları bypass. Özellikle, kimyasal neurostimulation daha doğal vizyon ile karşılaştırılabilir veya daha iyisi visual acuities hastalara nörotransmiterler, retina tarafından kullanılan iletişim aynı doğal maddeleri çok az miktarda enjekte edilerek geri potansiyeline sahiptir Geçerli elektrik protezleri çok ince çözünürlükte kimyasal synapses. Ancak, nispeten keşfedilmemiş stimülasyon paradigma olarak retina vitrokimyasal uyarılması elde etmek için oluşturulmuş hiçbir protokol var. Bu çalışmanın amacı kimyasal retina retina kimyasal neuromodulation, potansiyel veya benzer eğitim almak isteyen araştırmacılar için uyarılması gerçekleştirmek için detaylı bir çerçeve sağlamaktır sinir doku içinde vitro. Bu çalışmada deneysel kurulum ve retina ganglion hücre (RGC) spike yanıt benzer görsel ışık yanıtlarında vahşi tipi almak için metodoloji açıklayan ve hacimleri enjekte edilerek photoreceptor dejenere wholemount sıçan retina kontrol nörotransmitter Glutamat cam MİKROPİPETLER ve özel birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal aygıt kullanarak subretinal boşluğa. Bu metodoloji ve iletişim kuralı diğer nörotransmitter veya hatta diğer nöral dokular kullanarak neuromodulation için adapte olmak için genel.
Giriş
Retinitis pigmentosa ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi photoreceptor dejeneratif hastalıkların devralınabilir görme kaybı nedenleri lider vardır ve şu anda tedavi edilemez1,2. Her ne kadar bu hastalıkların belirli Genetik mutasyonlar çeşitli ortaya, photoreceptor dejeneratif hastalıklar sonunda körlüğü neden retina photoreceptor hücrelerde ilerici kaybı bir grup olarak karakterizedir. Photoreceptors Tetikleyicileri retina remodeling ama iki kutuplu hücreler ve RGCs, dahil olmak üzere retina sinir hücreleri hayatta yaygın kaybı sağlam ve photoreceptor dejenerasyon3 , ileri evrelerinde bile nispeten durumda kalır ,4,5,6,7.
Mekanizmaları ve bu hastalıkların patolojiler de karakterize3,4,5,6,7 ama etkili bir tedavi zor kalır. Son üç yılda bu gen terapisi8, kök hücre tedavisi9dahil olmak üzere photoreceptor dejeneratif hastalıklar ile etkilenen için vizyon geri yükleme yüklemek için tedavi tedaviler çeşitli araştırmacılar dünya çapında araştırdık, Retina nakli10ve hayatta kalan retina nöronların yapay stimülasyon11,12 . Bunlar geleneksel olarak bir dizi elektrot elektrikle amacı ile belirli desen iki kutuplu hücreler veya RGCs uyarmak için kullanılan yapay neurostimulation aygıtları olan retina Protezler, en klinik olarak kullanılabilir. yapay görsel algıları hastalar11' oluşturma. Şimdiki nesil elektrik Protezler, Argus II13 ve alfa-IMS14 aygıtlar gibi klinik onay ulaşmış ve ön çalışmalar belirtilmiştir var onlar yaşam kalitesini hastalar için geri yükleyerek geliştirmek olabilir bir Vizyon epiretinal (retina önü) ve subretinal (retina arkasında) kullanarak ölçü aygıtları15,16implante. Araştırma grupları dünya çapında başarılar bu ilk nesil cihazlar17,18,19,20 ötesinde retina protezleri ilerleyen üzerinde çalışıyoruz ama karşı karşıya kalmışlardır bir elektrik protezler hastalara yüksek keskinliği vizyon yasal körlüğü seviyesinin altında geri yükleme ve yetenekli tasarımı zorluklar. Son yıllarda yapılan çalışmalarda elektrik tabanlı protezleri zorlu tahakkuk enjeksiyon sınırı nedeniyle daha yüksek Uzaysal çözünürlük şimdiki nesil tarafından etkin daha ulaşmak, hangi güvenli bir şekilde uyarmak için büyük elektrotlar kullanımını gerektiren göstermiştir Retina nöronlar Uzaysal çözünürlük, Yani görme keskinliği11,21pahasına. Ayrıca, elektrik stimülasyonu daha da büyük ölçüde çünkü bu bir doğal olarak doğal olmayan stimülasyon paradigma21sınırlı, çünkü genellikle tüm yakındaki hücreleri uyarır ve bu nedenle hastaların, doğal olmayan ve kafa karıştırıcı algılamaları ortaya çıkarır. Yine de, elektrik stimülasyonu erken başarıları bu yapay neurostimulation photoreceptor dejeneratif hastalıklar için etkili bir tedavi olabilir göstermiştir. Bu daha da etkili bir tedavi nörotransmitter kimyasal madde, kimyasal sinapslar, iletişimin doğal maddeleri ile retina uyararak ulaşılabilir olduğu konusunda broşürüne birine yol açar. Bu raporda sunulan yöntemin amacı biomimetic seçimli-e doğru elektrik stimülasyon olarak retina sinir hücreleri arasındaki sinaptik iletişimin doğal sistem taklit amaçlayan kimyasal stimülasyon, terapötik fizibilite keşfetmek etmektir Retina protezi için.
Kimyasal olarak hedef retina nöronlar bir mikrosıvısal serbest Glutamat gibi yerel nörotransmitter küçük miktarlarda ile üstünde harekete geçirmek için kimyasal bir retina protez tedavi edici kimyasal uyarımı kavramının çeviri dayanır microports görsel stimülasyon yanıt olarak büyük bir dizi oluşan aygıt. Bu şekilde, kimyasal bir retina protez aslında doğal kimyasal sinyalleri retina ulaşan fotonların çeviren bir biomimetic yapay photoreceptor katman olur. Beri bu kimyasal sinyaller normal retina sinyal kullanılan aynı nörotransmitter kullanın ve hayatta kalan retina sinir hücreleri dejenere retinanın normal görme yolları, ortaya çıkan görsel tarafından kullanılan aynı Sinaptik yolları aracılığıyla teşvik kimyasal bir retina protez elde algı bir elektrik bir protez ile uyarılmış kıyasla daha doğal ve anlaşılır olabilir. Hangi aracılığıyla nörotransmitter are serbest bırakmak microports son derece küçük ve elektrotlar, aksine yüksek yoğunluklu olarak dizilmiş yapılabilir beri Ayrıca, potansiyel bir kimyasal protez daha fazla odak stimülasyon elde edebilecektir ve daha yüksek olabilir kayma çözünürlük daha elektrik bir protez. Böylece, bu potansiyel avantajları üzerinde bağlı olarak, kimyasal bir retina protez elektrik protezleri için çok umut verici bir alternatif sunuyor.
Retina, kimyasal uyarılması ancak, nispeten küçük yakın zamana kadar keşfedilmeyi. Retina elektriksel stimülasyon de işin içinde vitro22,23, in vivo23,24ve klinik çalışmalar13 yılda karakterize iken ,14, kimyasal stimülasyon üzerinde çalışmalar sadece birkaç vitro çalışmalar25,26,27,28için sınırlı olmuştur. Iezzi ve Finlayson26 ve Inayat vd. 27 tek bir elektrot ve bir multielectrode dizisi (MEA), sırasıyla, retina nöronların uyarılmış Glutamat yanıt-e doğru kaydetmek için kullanılarak retina vitro epiretinal kimyasal uyarılması gösterdi. Daha yakın zamanlarda, Rountree vd. 28 Glutamat subretinal yan ve bir MEA retina birden fazla sitede nöronal yanıtlarını kaydetmek için kullanma ve retina yolları fark uyarılması gösterdi.Bu eserleri birime kimyasal uyarımı fizibilite kurduk, daha fazla çalışmaları birçok araştırmak için gerekli olmakla birlikte, bu yaklaşım o ötesinde yönlerini ele defa25,26,27 , 28, yukarıda da açıklandığı gibi kimyasal bir retina protez bu kavramı tercüme önce tedavi edici stimülasyon parametreleri vitro ve in vivo hayvan modellerinde ince ayar. Ancak, şu anda edebiyat retinada kimyasal uyarılması yerine getirmeye için kurulan hiçbir metodoloji ve ikileştirici çalışmaları için gerekli olacaktır gibi önceki işlerde kullanılan yöntemleri böyle ayrıntılı olarak tarif edilmiştir değil. Bu nedenle, bu müfettişler ya bizim önceki çalışmalar27çoğaltılıyor baktılar için retina vitro kimyasal uyarılması yürütmek için iyi tanımlanmış bir çerçeve sağlamak için bu yöntemleri kağıt mantığı olduğunu, 28 ya da daha fazla kimyasal neurostimulation doğmakta olan bu kavramı ilerleyen.
Burada biz vahşi tipi fareler ve yakından photoreceptor dejeneratif ilerlemesini taklit eden bir photoreceptor dejenere fare modeli wholemount retina retina nöronlarda vitro kimyasal uyarılması yürütmek için bir yöntem göstermek hastalıkların insanlarda. Tedavi aralıkları çeşitli stimülasyon parametreleri değerlendirmek ve imkansız veya içinde içinde gözlemlemek zor olurdu nöral yanıt özellikleri çalışma için bu stimülasyon yöntemi vitro modelleri geliştirmek arkasındaki mantığı olduğunu vivo modelleri, özellikle ilk çalışmalar sırasında odaklı bu yaklaşımın fizibilite değerlendirme. Bu yordam, biz 1 mM Glutamat hedef yolu ile piyasada bulunan tek bağlantı noktalı cam MİKROPİPETLER ve özel bir retina nöronlar yakınındaki küçük miktarlarda sunarak hem tek siteler ve eşzamanlı multi-yer kimyasal elektrodlar, retina göstermek micromachined çok bağlantı noktalı mikrosıvısal aygıt, anılan sıraya göre. Tek-site ve Multi-yer elektrodlar kimyasal neuromodulation tedavi edici fizibilite araştıran temel hedefi başarmak iken, her benzersiz bir avantaj ile farklı bir amaca hizmet eder. Piyasada bulunan önceden çekti cam MİKROPİPETLER ile başarılı, tek-site stimülasyon doğrudan içine tek bir site, retinanın yeraltı Kimyasalları enjekte için kullanılan ve gözlemlenebilir RGC oranı spike araştırmak için hizmet vermektedir görsel olarak uyarılmış ışık yanıt benzer yanıt focally enjeksiyon yeri altında elde edildi. Öte yandan, özel fabrikasyon birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal baðlantýsýnýn, multi-yer stimülasyon, retina yüzey üzerinde birden çok sitelerde dağınık şekilde kimyasal enjekte için kullanılan ve ne kadar iyi Glutamat uyarılmış RCG araştırmak için hizmet vermektedir Yanıt desen desen stimülasyon çalışmalarında Glutamat enjeksiyon kalıpları karşılık gelir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için Ulusal Araştırma Konseyi Kılavuzu tarafından özetlenen yönergelere uygun olarak yapılmıştır. Hayvan işleme ve ötenazi protokolleri gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Chicago, Illinois Üniversitesi tarafından onaylanmış.
1. hayvan modelleri
- Vahşi tipi uzun-Evans fareler
- 24-32 gün eski vahşi tipi uzun Evans kukuletalı sıçan bir standart 12 h gündüz/gece ritmi ile harekete geçirilen her iki cinsiyetten temin etmek.
- Karanlık uyum sıçan deney başlamadan önce 1 h için tamamen karanlık bir odada yerleştirerek.
- S334ter-3 fareler
- Mutant rhodopsin gen photoreceptor dejenerasyon sergi Pigmentli heterozigoz S334ter-3 fareler üretmek için Pigmente vahşi tipi uzun-Evans fare ile iki kopyasını ifade transgenik albino homozigoz S334ter-3 fare (her iki cinsiyetten), çizgiyi ilerleme insan retinitis pigmentosa29,30benzer.
- Standart 12 h gündüz/gece ritim ile heterozigoz çoluk çocuk yetiştirmek ve deneyler aşağıdaki photoreceptor dejenerasyon aşamaları için karşılık gelen aşağıdaki yaş için fareler her iki cinsiyetten kullanın: erken sahne dejenerasyon: 14-20 gün eski; Orta sahne dejenerasyon: 21-27 gün eski; Geç sahne dejenerasyon: 28-35 gün eski; Tamamen kör: > 50 gün eski.
- Karanlık uyum sıçan deney başlamadan önce 1 h için tamamen karanlık bir odada yerleştirerek.
2. Ames'in orta çözüm ve perfüzyon sistemi hazırlanması
Şekil 1: deneysel kurulumunun şematik. Bir cam micropipette (A) ve (B)özel birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal aygıt kullanarak kimyasal uyarılması için deneysel kurulumunun şematik. Retina üzerinde pMEA yerleştirilir ve sürekli taze, oksijenli Ames orta solüsyonu pMEA delikler aracılığıyla alt ve üst üzerinden periosteum. PMEA elektrotlar tarafından aldı nöral yanıt sinyalleri MEA amplifikatör veri toplama bilgisayarın içine beslenir. Görsel ve kimyasal uyarımı başarılı bir yeşil LED ve 8-kanal basınç enjektörü sırasıyla kullanarak ve her iki çekim gücü de pipet ile hassas 3 eksenli konumlandırmak için kullanılan bir özel uyarıcı bilgisayar tarafından tetiklenen micromanipulator. Ters bir mikroskop retina bir deney sırasında gözlemlemek için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: deneysel Kur. (A)tüm bileşenleri göreli konumları gösteren deneysel Kurulumu tamamlamak fotoğrafı. MEA amplifikatör sistem retina kontrol edin ve dijital olarak aygıt-retina arabirimi yoluyla bağlı yüksek hızlı kamera deneme sırasında görüntü için kullanılan bir ters mikroskobu üstüne yerleştirilir. Üst ve alt perfüzyon bağımsız olarak bir solenoid kumandalı perfüzyon sistemi kullanılarak denetlenir. Başarılı bir basınç enjektörü, micromanipulator ve yama kelepçe amplifikatör kullanarak enjeksiyon, pozisyon kontrolü ve empedans ölçümleri (turuncu kutu; daha ayrıntılı B olarak gösterilen), anılan sıraya göre. Micropipette veya aygıt bir yama kelepçe headstage empedans ölçümleri için eklenen ve bir makas köprüsü üzerinde monte edilmiş (yeşil kutusu tarafından belirtilen; daha ayrıntılı C olarak gösterilen) bir micromanipulator kullanarak konumlandırma kolaylaştırmak için. (B) bir close-up deneyde kullanılan ölçü ve kontrol aletleri: 8-kanal basınç enjektörü, micromanipulator kontrol sistemi, empedans ölçümü için yama kelepçe amplifikatör ve perfüzyon ortadan kaldırılması için emme gemi. (C) birden çok bağlantı noktası bir aygıt gösterilen enjeksiyon sistemi Portal bir close-up pipet tutucu, yama kelepçe headstage ve micromanipulator sızdı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: perfüzyon Kur. (A)üst perfüzyon ve emme gibi görsel ışık stimülasyon için kullanılan yeşil LED yerini gösteren MEA amplifikatör üst fotoğrafı. (B) üst perfüzyon ve emme, pMEA ve empedans ölçüm için kullanılan referans elektrot kesin yerlerini gösteren pMEA perfüzyon odası yakın çekim. (C) alt perfüzyon plaka bir photomicrograph. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Not: Bkz: Resim 1, Resim 2ve şekil 3
- 900 mL de-iyonize su oda sıcaklığında (~ 21 ° C) dışarı ölçmek ve 1 L kapsayıcısına getirin.
- Su ile 0 CO2 kabarcıklanma mekanizmasını kullanarak sıvı.
- 8,8 g toz Ames orta 1 L kap içerisinde su ekleyin.
- Ames'in orta kapsayıcı bir kaç mL çıkarmak tüm izini sürmek-toz Ames orta ve 1 L kapsayıcıya Ekle için de-iyonize su ile durulayın.
- 25.3 mL sodyum bikarbonat çözeltisi (% 7,5 w/v31) 1 L kapsayıcıya ekle.
- 1 L. son bir hacim için çözüm getirmek için ek su ekle
- Ventriküler su yaklaşık 5 min için CO2 ile devam edin.
- CO2 perfüzyon durdurmak ve çözüm % 95'i O2 ve %5 CO2 en az 30 dk ya kadar pH 7.4 stabilize Medikal gaz karışımı ile Ventriküler başlar.
Not: Bu protokol amacı gereği, Ames orta oda sıcaklığında hangi hava kabarcıkları perfüzyon çizgilerle tıkamanın (~ 21 ° C) CO2 veya O2 fışkırması gelen önlemek için deney boyunca tutulur. - % 70 etanol ile doldurarak alt ve üst perfüzyon tüpler temiz ve sonra her iki hat 3 kez de-iyonize su ile yıkayın. Alt satırda de-iyonize su ve hava ile üst satırında ile doldurun.
3. Wholemount retina hazırlık
Şekil 4: retina diseksiyon ve wholemount hazırlanması. (A) sağlam bir kadeh photoreceptor dejenere bir hayvandan alınan fotoğrafı. Bu düzleştirmek için (B) Photomicrograph boyuna kesim ile retina. (C) retina düzleştirme sonra bir kafes ızgara mesh irtibata photoreceptor yanında yer alıyor ve orada emin olmak için (dışında perfüzyon orta) havada basık hiçbir kıvrımlar veya kıvrılmış kenarlar vardır. (D) mesh ve retina ganglion hücre yan elektrotlar irtibata pMEA için hızlı bir şekilde transfer ve hemen periosteum ile oksijenli Ames orta. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: delikli multielectrode dizi. (A) protokolünde kullanılan delikli multielectrode dizi fotoğrafı. Retina (daha ayrıntılı B olarak gösterilen kırmızı dikdörtgen gösterilir) elektrot dizi üzerinde oksijenli Ames orta ile sürekli perfüzyon izin vermek için pMEA odası içinde yer alıyor. (B) elektrot dizinin kendisi elektrot arasındaki delikler yerleşimi gösteren bir photomicrograph. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Not: Şekil 4 ve şekil 5 bakın
- El bir kırmızı LED el feneri loş kırmızı aydınlatma sağlar, hayvan ardından servikal yerinden çıkması veya seçtiğiniz başka bir yöntem, karbon dioksit Havasızlıktan Boğulma yoluyla IACUC protokolleri göre ötenazi için kullanarak.
- Bir kuyumcu 's #5 forseps kullanarak her iki gözde enucleate ve 60 mm çap petri kabına yaklaşık 3-4 mL taze, oksijenli Ames orta çözeltisi ile enucleated gözleri yer.
- Üst ve alt aydınlatıcılar ile bir diseksiyon stereomicroscope gözünden gözlemleyerek kırmızı filtre perde ile örtülü yaparken küçük bir insizyon attım bir neşter ya da keskin makas kullanarak kornea yüzüne.
- Bu küçük kesi kornea kenarına kesebilir ve daha sonra tüm kenar çevresinde çevresel bir bölümü olan kornea kesme genişletmek. Şimdi müstakil kornea ile birlikte objektif, yarı saydam sulu ve vitreus anlayışımızı kaldırın.
- Yavaşça tutarken forseps, bir çift ile kadeh, kadeh, ters tarafında iki küçük kesikler dikkatle olun. Sonra iki çift forseps yavaşça kadeh her kesi de ayır ve retina sklera ayırmak için kullanın. Yavaş yavaş tüm retina sklera ve kadeh kaldır. Hala bağlıysa Optik siniri kes.
- Yarım veya çeyrek makas kullanma bölümlerine elde etmek için retina boyuna kesim yapmak ve sonra yavaşça ganglion hücreleri (retina içbükey tarafı) bakan mesh uzak bir retina bölümü bir naylon mesh (100 µm iplik çapı 350 µm açılış ile) üzerine yayılmış.
- Mesh ve retina ganglion hücrelerinin pMEA yüzeyi ile temas ile delikli multielectrode dizi (pMEA) üzerine yerleştirin. Sonra yavaşça ağırlıklı dilim ızgara retina tutmak için kafes üstüne yerleştirin.
4. MEA ve veri toplama Kur
Şekil 6: gürültü düzeyleri pMEA. (A) temsilcisi kayıt bir alt pMEA elektrot yüksek kalıcı gürültü sergilenmesi. Bu gürültü genellikle pMEA kişi yastıkları ve ince delikli polimid katmanının normal aşınma sonucu olarak MEA amplifikatör pinler arasında uygun iletişim eksikliği nedeniyle özellikle kişi yastıkları, pMEA bitti. Gürültü diğer olası kaynağı genellikle pMEA amplifikatör kişi yastıkları sızdırılmış çözümdür. Sürekli gürültü zavallı PIN nedeniyle iletişim ve/veya çözüm yastıkları genellikle daha iyi temas ve temizleme ve kurutma yastıkları, sırasıyla elde etmek için belgili tanımlık amplifikatör içinde pMEA konumunu ilerletmeniz düzeltilebilir temas sızdırılmış. Gürültü temizleme veya pMEA konumu değişen ortadan olamaz, pMEA tamamen değiştirilmesi gerekebilir. (B) alt kümesindeki pMEA elektrotlar temiz pMEA pMEA ve amplifikatör arasında iyi temas ile gelen gürültü seviyeleri temsilcisi kaydı. Genellikle, ortalama gürültü seviyesi ±16 µV. içinde olduğunu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Not: Şekil 6 :
- Loş kırmızı aydınlatma altında MEA amplifikatör içinde pMEA yerleştirin ve amplifikatör sürgüler kapatın.
- Başvuru işaretleri pMEA odası halkada mevcut değilse iki 'X' etch-şekilli işaretleri aralıklı yaklaşık 5 mm ayrı bir alanda yukarıdan kolayca görünür boom-stand takılan mikroskopla.
- En iyi perfüzyon çıkış içinde pMEA odası getirin ve yaklaşık 3 mL / dakika bir perfüzyon oranı elde etmek için en iyi perfüzyon Vana açın. En iyi emme giriş istenen perfusate düzeyinde (~ 5 mm derin) konumlandırın ve çalıştığından emin olun.
- Veri toplama yazılımı veri toplama bilgisayarda açın ve veri almaya başlamak için 'play' butonuna tıklayın. Tüm pMEA Kanallar noise etkisinden uzak ve kayıt sinir sinyalleri olduğundan emin olun.
- Ters mikroskop görüş alanı bir canlı dijital görüntü bir monitörde bakarak, pMEA çözüm alt perfüzyon plaka akan bir kanıt için alt yüzeyine gözlemlemek.
5. Glutamat stimülasyon hazırlık
Şekil 7: cam micropipette ve birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal cihaz. (A) bir micropipette veya aygıtı takmadan önce bir pipet sahibi. Gümüş/gümüş klorür elektrot (50 µm çapı) elektrikle sonuna kadar arabirimi bağdaştırıcısında için yama kelepçe headstage ile birleştiğinde. (B) pnömatik enjeksiyonları başlatmak için kullanılan basınç noktası konumunu gösteren pipet sahibi ile cam micropipette fotoğrafı sızdı. (C) bir özel birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal aygıtı (1 cm 1 cm 0,134 cm) bir özel 3D baskılı fikstür için bağlı ve paslanmaz çelik tüpünden pipet sahibi ile sızdı. İki kat fabrikasyon, cihazın alt tabaka (340 µm kalınlığında) ve sekiz üstünde-küçük parça rezervuarlar sekiz microports (çapı 14 µm) vardır (çapı 1,6 mm) Glutamat üst tabaka (1 mm kalınlığında) depolamak için. Her biri sekiz microports cihazın alt katmandaki bağımsız olarak bir uçak-microchannel ile üst tabaka bir üstünde-küçük parça rezervuar bağlıysa ve her üstünde-küçük parça rezervuar sırayla 8-kanal basınç enjektörü, bir basınç bağlantı noktasına bağlı bir esnek tüp microports desenli birden fazla site enjeksiyonlar için bağımsız çalıştırma izin vermek için. (D) sekiz bağımsız olarak adreslenebilir üstünde-küçük parça rezervuarlar ve boru giriş düzenini gösterilen boru arabirimi fikstür eklemeden önce cımbız tarafından düzenlenen birden çok bağlantı noktası aygıtı yakın çekim. (E) 3 x 3 yapılandırma pMEA elektrotlar ile hizalamak için 200 µm Aralık ile düzenlenmiş sekiz 14 µm-çapı microports gösterilen cihazın alt yüzeyi bir photomicrograph. Merkezi bağlantı noktası kesinlikle hizalama sırasında cihazın imalatı için kullanılan süre sekiz microports dışında birden fazla site enjeksiyonlar için kullanılmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Not: Bkz. Şekil 7.
- Glutamat çözüm hisse senedi Glutamat 0.5 mL örnek bir çalışma konsantrasyonu 1 mM Glutamat, Ames orta çözüm oksijenli seruma karıştırarak hazırlayın.
- Dikkatli bir şekilde önceden çekti 10 µm çapı micropipette veya birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal aygıta 50 µm-çapı gümüş/gümüş klorür tel elektrot içeren bir çift pipet yuvasına bağlı paslanmaz çelik çubuk yerleştirin.
Not: Gümüş/gümüş klorür tel elektrot empedans algılama yoksa, atlanabilir. - Yama-kelepçe headstage ile pipet sahibi arabirim ve basınç bağlantı noktası radarı bağlantısı pipet sahibinin Kanal 1 basınç enjeksiyon sisteminin bir cam micropipette kullanan varsa bağlanmak veya basınç bağlantı noktası radarı bağlantıları her bağlantı 8 Silindir bağlantı noktaları kanal birden çok bağlantı noktası aygıtı kullanıyorsanız basınç enjeksiyon sistemi 1-8.
- El ile basınç enjeksiyon sisteminde ve Kanal 1 (veya kanal 1-8, uygulanabilir olduğunda) açın. Sistem Bacalı atmosfere ve enjeksiyon basınç ayarlı 0.1 psi için emin olun.
- Micromanipulator üzerinde açmak ve manipülatör denetleyicisinde 'Kalibre' düğmesine basarak kalibre. Micropipette ipucu (veya cihazın alt tarafına, uygulanabilir olduğunda) yaklaşık 30 mm MEA amplifikatör yukarıda olan micromanipulator konumlandırın.
- Glutamat çözüm (1 mM Glutamat standart Ames orta) ile küçük bir petri doldurun ve micromanipulator yerleştirin. Düşük micropipette ipucu (ya da aygıt) çözüm ve dolgu (emme baskısı -13 H2O) basınç enjeksiyon sisteminde 'Doldurma' düğmesine basarak kadar çözüm yaklaşık 20 mm cam micropipette görünür veya birden çok bağlantı noktası aygıtı boru.
- Birden çok bağlantı noktası aygıtı kullanıyorsanız, kapalı basınç enjektörü 1 kanal ve protokol kanalları 2-8 için tekrarlayın. Micropipette ipucu veya çözüm cihazınızdan kaldırmak, petri kabına kaldırmak ve micromanipulator pMEA odası üzerinde konumlandırın.
- Boom-stand-monte stereomicroscope kullanarak, pMEA odası halka içine kazınmış başvuru işaretleri ile micropipette ipucu veya cihazın köşelerini hizalayın. Manipülatör pozisyonlar 'Mağaza başvuru A' ve 'Mağaza başvuru B' düğmelerini kullanarak kontrol yazılımı içine depolamak (ya da sade bir şekilde manipülatör koordinatları el ile Not) manipülatör pMEA elektrotlar ile koordinat sistemi eşleştirmek için.
- Manipülatör kontrol yazılımı kullanarak bir hedef pMEA elektrot sağlam spontan aktivite ile seçin ve cam micropipettewith hedef elektrot hizalamak için 'Kanal Taşı' düğmesini tıklatın.
6. Retina ile arayüz
- Empedans ölçüm varsa, yama kelepçe amplifikatör üzerinde açmak ve empedans görselleştirme yazılımları pipet tutucu içinde gümüş/gümüş klorür elektrot empedans görselleştirmek için 'Başlat' düğmesini tıklatarak başlatın. Kesilmediğini gözleyerek gerçek zamanlı empedans sinyalleri yavaş yavaş düşük micropipette ya da aygıt empedans hızlı bir artış gösterildiği gibi retina yüzeyine kişiler kadar (bkz. şekil 8) sinyal. Kaydedebilir veya retina yüzeyine konumunu not alın.
- Empedans ölçüm kullanılabilir durumda değilse, bu daha az hassas olsa görsel gözlem yoluyla retina yüzeyi ile temas algılamak. Gözle görülür Ames orta çözüm MEA odasında üst yüzeyi rehber dek pipet veya aygıt indirin.
- Retina üst yüzeyinde gözle görülür, retina yüzeyle temas yapıldığı yeri gösteren görüntü çok bozuksa kadar sonra üst kısmındaki retina ters bir mikroskopla kesilmediğini gözleyerek, yavaş yavaş pipet veya aygıt daha düşük. Kaydedebilir veya retina yüzeyine konumunu not alın.
- Yeraltı uyarılması için pipet daha düşük 40 µm (için S334ter-3 retina) veya 70 µm (için vahşi tipi retina).
- Bir kaç kısa süreli (10-30 ms) enjeksiyonları hücreleri micropipette ipucu yakınındaki veya aygıt microports sinir sinyalleri ile veri toplama gözlemleyerek Glutamat uyarmaya yeni fikirlere açık mı belirlemek için basınç enjeksiyon (0,1 PSI) sistemi kullanarak gerçekleştirmek yazılım.
Not: Başarılı enjeksiyonları açıkça görünür spike oranı veri bloğu veya spike inhibisyon temin (bkz. Şekil 9). Yanıt gözlem yapılırsa farklı bir elektrot micropipette veya aygıt yeniden konumlandırın.
Şekil 8: empedans ölçümü. (A) empedans ölçüm tekniği haritası açılıyor. Yavaş yavaş retina yüzeye indirilir gibi yama kelepçe amplifikatör kullanarak, micropipette empedans sürekli olarak izlenir. Micropipette retina olduğunda, nispeten yüksek iyonik iletkenlik Ames orta düşük empedansı gönüllülük içinde oluşur. Micropipette yapar gibi retina yüzeyi ile temas, gümüş/gümüş klorür telden iyonik iletkenlik ölçüm empedans hızlı bir artışa neden azalır. (B) empedans değişiklik gösteren bir arsa hemen önce ve pipet ucu retina yüzeyle temastan sonra kaydedilmiş. Micropipette ipucu çözümde ölçülen empedans nispeten düşük olduğunda yalnızca (soldaki turuncu bölge gösterilir) kişiyi önce. İletişim (kırmızı ok ucu ve sağdaki yeşil bölge tarafından gösterilen) yapıldıktan sonra empedans retina doku ile temas üzerine azaltılmış iyonik iletkenlik nedeniyle hızla artar. Uygulamada, retina yüzeyinde ölçülen empedans (kırmızı ok ucu konumunu) dik yükselişi başlangıcı için karşılık gelen yükseklik olarak kaydedilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: sinirsel aktivite sırasında görsel, spontan, elektrot kayıtları ve Glutamat enjeksiyon kayıtları. Yüksek geçiren gösterilen dokuz pMEA elektrotlar (A) temsilci kayıtları her dikdörtgen benzersiz bir elektrot nöral verilerden gösterir nerede yeşil LED ışık görsel stimülasyon sırasında elektrot verilere filtre. Her elektrot kayıt açık yeşil ışığı (zamanlama her arsa turuncu ok uçları ile gösterildiği) sol Axes gösterilen ortak gerilim ölçekli açtıktan sonra ilk ikinci toplanan verileri gösterir. Sivri bir eşik gerilim-18 µV (her elektrot arsa yatay kırmızı çizgi) kullanarak tespit edilmiştir ve yeşil elektrot verilerin üzerine siyah izlemeler tarafından temsil edilir. Görsel stimülasyon üst orta bir inhibitör yanıt-e doğru ışık sahip biri dışında tüm elektrotlar sivri (uyarma) bir patlamaya neden oldu. (B) görsel veya enjeksiyon uyarılma olmadan kendiliğinden sinirsel aktivite gösterilen aynı elektrotlar için benzer bir komplo. Daha küçük patlamaları mevcut olmasına rağmen sivri şekillerinin çok farklı görsel stimülasyon karşılık olarak kaydedildi. (C) elektrotlar aynı alt küme temsilci kayıtları hemen sonra merkez elektrot (zamanlama her arsa turuncu ok uçları ile gösterilen), Glutamat enjeksiyon kaydetti. Enjekte Glutamat görsel olarak uyarılmış spike patlamaları çok benzer Merkezi elektrot sivri bir patlama elde edildi. Diğer elektrotlar iyi Uzaysal çözünürlük kimyasal stimülasyon tekniği gösterir Glutamat enjeksiyon tarafından etkilenmemiş idi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
7. retina kayıt ve uyarıcı Program başlatmak
- Yeşil LED retina üst yüzeyine doğru gelecek şekilde yönlendirin. Veri toplama yazılımı kullanarak özel kayıt bilgisayarda dosya adını yazarak ve "kayıt" düğmesini tıklatarak kaydı başlar.
- Kayıt başladıktan sonra uyarıcı denetim programı açın ve "Uyarıcı dosyayı oku" düğmesini tıklatarak varsayılan uyarıcı dosyasını yükleyin. Ardından, aşağıdaki notta açıklandığı bir çekim gücü ve veri Alım Protokolü oluşan varsayılan uyarıcı dosyasını başlatmak için "Run uyarıcı dosya" düğmesini tıklayın.
Not: (i) 30 deneme 2 s ON ve yeşil LED kullanarak 2 s OFF tam alan flash (5 lm/m2 yoğunluğu). (II) 120 s veri benzer bir zaman ölçeği üzerinde retina spontan etkinliklerini kaydetmek için yeşil LED kullanmadan. (III) Glutamat enjeksiyonları (yaklaşık 100-300 pL enjeksiyon başına) kez 10-30 ms enjeksiyonlu 0,1 PSI ve 3 s interpulse süreleri 30 denemelerin oluşan Glutamat enjeksiyonları 1 veya daha fazla ayarlar. Multi-yer enjeksiyon söz konusu olduğunda, aynı anda enjekte etmek için 2 veya daha fazla bağlantı noktalarını seçin.
Şekil 10: Peristimulus çubuk grafikler görsel, spontan, ve Glutamat yanıt. (A) temsilcisi peristimulus çubuk grafikler (30 ms binwidth) Þekil 9A, elektrotlar alt kümesindeki spike verilerin görsel ışık stimülasyon 20 denemeler arasında ortalama. Ortak bir spike oranı ölçeği için tüm elektrotlar uygulandı ve sol Axes üzerinde gösterilir. Siyah satır her elektrot arsa, tüm sivri yeşil LED açtıktan sonra ilk ikinci sırasında kaydedilen ortalama spike oranı temsil eder. Görüldüğü gibi görsel stimülasyon geçici eksitatör spike oranı yanıtı bir geçici inhibitör yanıt-e doğru ışık vardı üst orta elektrot hariç tüm elektrotlar, neden oldu. (B) herhangi bir görüntü veya kimyasal uyarımı olmadan aynı elektrotlar, ortalama spontan spike oranı yanıt kaydedildi. Dürtme elektroda spike oranları nispeten sabittir. (C) ortalama spike oranı yanıt-e doğru yanıt Merkezi elektrot yukarıda bir yerde Glutamat enjeksiyon olarak aynı elektrotlar, kaydetti. Yalnızca geçici yanıt belirgin elektrot doğrudan enjeksiyon yeri altında eksitatör yanıttır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol kimyasal olarak hem normal, vahşi tipi retina hem de photoreceptor uyarmak için kullanılan önemli hücresel photoreceptors kaybına neden remodeling rağmen retina, dejenere. Her iki photoreceptor ile deneyler başlayan dejenere veya vahşi tipi retina kayıt ve stimülasyon ekipman (Resim 1 ve Şekil 2) gerek hazırlandılar için temizlenmiş ve pMEA (şekil 5) en aza indirmek için önce gürültü her ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan yöntem neyin retina nöronlar kimyasal olarak yerli nörotransmitter kimyasallar retina içinde vitroyeraltı enjekte edilerek uyarılır bir benzersiz sinir stimülasyonu paradigma gösterir. Bu kimyasal stimülasyon tekniği seçicilik ve odak özgüllüğü yüksek hedef nöronlar dahil olmak üzere geleneksel elektriksel stimülasyon tekniği üzerinde çeşitli yararlar sunar. İletişim kuralı yukarıda ayrıntıları nörotransmitter Glutamat birim pnömatik enjeksiyonlari kullanarak hedef retina sinir hücreleri bir tek b...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Gazetede sunulan çalışma ortaya çıkan sınırlar araştırma Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen ve yenilik (NSF-EFRI) program numarası 0938072 verin. Bu yazının içeriği sadece yazarların sorumluluğunda ve mutlaka NSF resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Yazarlar ayrıca tasarlama ve kimyasal uyarılması için ilk deneysel kurulum ve Bay Ashwin Raghunathan tasarımı, imalatı ve kullanılan birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal aygıt değerlendirme çalışmaları için test çalışmaları için Dr Samsoon Inayat teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Mikroelektrot dizisi, delikli yerleşimli | Çok Kanallı Sistemler, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifikatör | Çok Kanallı Sistemler, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Çok Kanallı Sistemler, GmbH | için alt perfüzyon zemin plakası | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3 eksenli Motorlu Mikromanipülatör | Sutter Aletleri, Novato, CA | MP-285 | |
| https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html Mikromanipülatör Kontrol Sistemi | Sutter Aletleri, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Portal stili Doğrusal kızaklı mikromanipülatör standı | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | |
| https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html 8 kanallı Programlanabilir Çok Kanallı Basınç Enjektörü | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Satıcı: Harvard Apparatus UK | PM-8000 veya PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Satıcı: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Entegre Yama Kelepçesi Amplifikatör | Moleküler Cihazları, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A, daha yeni bir model olan Axopatch 200B ile değiştirildi: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Yama kelepçesi headstage | Moleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vakumlu atık kiti | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | |
| http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ Pipet tutucu | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Önceden çekilmiş 10 & mu; M uç çaplı cam mikropipetler | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | |
| https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ Zoom stereomikroskop | Nikon, Tokyo, Japonya | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Çift lineer bilyalı mikroskop bom standı rulman kolu | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| C-LED'li Zoom Stereo Mikroskop Hibrit LED Standı | Nikon, Tokyo, Japonya | SMZ-445 | |
| https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 Ters mikroskop sistemi | Nikon, Tokyo, Japonya | Tutulma Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames orta | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamik Asit (Glutamat) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Sodyum bikarbonat | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm Petri kabı (10 mm boyunda) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm şeffaf petri kabı; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Kuyumcular #5 Forseps | Dünyası Hassas Aletler, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standart Neşter Blad #24 | Dünya Hassas Aletleri, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Neşter Sapı #4 | Dünya Hassas Aletleri, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tübingen Diseksiyon Makas | Dünyası Hassas Aletler, Sarasota, FL | 503378 | |
| https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ Naylon örgü kiti | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Arp dilim ızgarası | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl referans elektrot pelet | Çok Kanallı Sistemler, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 Kanallı Vana Kontrollü Yerçekimi Perfüzyon Sistemi | ALA Bilimsel Aletler, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS mikroskop kamera | Andor Teknolojisi, Belfast, İngiltere | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Gümüş tel (50 μ m çap) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 | |
| Tygon mikro delikli boru (1,6 mm çap) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-06419-01 | |
| https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 Çelik Kanüllü | Devirme Takım TutucusuALA Bilimsel Aletler, Farmingdale, NY | TILTPORT | Bunlardan biri üst perfüzyon ve aspirasyon için kullanıldı; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Açık Kırmızı Filtre Levhası | Rosco Laboratories Inc., 52 Liman Görünümü, Stamford, CT | R2611 | Üretici: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Satıcı: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Wesson Galaxy Kırmızı El Feneri | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Bulvarı, Springfield, MA | 4588 | Üretici: https://www.smith-wesson.com/ Satıcı: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Temel Araştırma Yazılımı | Nikon, Tokyo, Japonya | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
Kaynaklar
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. , (2011).
- Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together. Annu Rev Genomics Hum Genet. 15, 151-171 (2014).
- Marc, R. E., et al. Neural reprogramming in retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 3364-3371 (2007).
- Jones, B. W., Kondo, M., Terasaki, H., Lin, Y., McCall, M., Marc, R. E. Retinal remodeling. Jpn J Ophthalmol. 56, 289-306 (2012).
- Soto, F., Kerschensteiner, D. Synaptic remodeling of neuronal circuits in early retinal degeneration. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Euler, T., Schubert, T. Multiple Independent Oscillatory Networks in the Degenerating Retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Boye, S. E., Boye, S. L., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. A Comprehensive Review of Retinal Gene Therapy. Mol Ther. 21, 509-519 (2013).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. The Lancet. 385, 509-516 (2015).
- Reh, T. A. Photoreceptor Transplantation in Late Stage Retinal Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (2016).
- Zrenner, E. Fighting blindness with microelectronics. Sci Transl Med. 5, (2013).
- Humayun, M. S., de Juan, E. Jr, Dagnelie, G. The Bionic Eye: A Quarter Century of Retinal Prosthesis Research and Development. Ophthalmol. 123, S89-S97 (2016).
- Cruz, L., et al. The Argus II epiretinal prosthesis system allows letter and word reading and long-term function in patients with profound vision loss. Br J Ophthalmol. 97, 632-636 (2013).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. P R Soc B. 278, 1489-1497 (2011).
- Stronks, H. C., Dagnelie, G. The functional performance of the Argus II retinal prosthesis. Expert Rev Med Devices. 11, 23-30 (2014).
- Stingl, K., et al. Artificial vision with wirelessly powered subretinal electronic implant alpha-IMS. P R Soc B. 280, (2013).
- Rizzo, J. F. Update on retinal prosthetic research: the Boston Retinal Implant Project. J Neuroophthalmol. 31, 160-168 (2011).
- Ayton, L. N., et al. First-in-Human Trial of a Novel Suprachoroidal Retinal Prosthesis. PLoS ONE. 9, e115239(2014).
- Chuang, A. T., Margo, C. E., Greenberg, P. B. Retinal implants: a systematic review. Br J Ophthalmol. 98, 852-856 (2014).
- Cai, C., Twyford, P., Fried, S. The response of retinal neurons to high-frequency stimulation. J Neural Eng. 10, 036009(2013).
- Eiber, C. D., Lovell, N. H., Suaning, G. J. Attaining higher resolution visual prosthetics: a review of the factors and limitations. J Neural Eng. 10, 011002(2013).
- Humayun, M., Propst, R., de Juan, E., McCormick, K., Hickingbotham, D. Bipolar surface electrical stimulation of the vertebrate retina. Arch Ophthalmol. 112, 110-116 (1994).
- Zrenner, E., et al. Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors? Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).
- Majji, A. B., Humayun, M. S., Weiland, J. D., Suzuki, S., D'Anna, S. A., de Juan, E. Long-Term Histological and Electrophysiological Results of an Inactive Epiretinal Electrode Array Implantation in Dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Peterman, M. C., Noolandi, J., Blumenkranz, M. S., Fishman, H. A. Localized chemical release from an artificial synapse chip. PNAS. 101, 9951-9954 (2004).
- Finlayson, P. G., Iezzi, R. Glutamate stimulation of retinal ganglion cells in normal and s334ter-4 rat retinas: a candidate for a neurotransmitter-based retinal prosthesis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 3619-3628 (2010).
- Inayat, S., Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. Chemical stimulation of rat retinal neurons: feasibility of an epiretinal neurotransmitter-based prosthesis. J Neural Eng. 12, 016010(2015).
- Rountree, C. M., Inayat, S., Troy, J. B., Saggere, L. Differential stimulation of the retina with subretinally injected exogenous neurotransmitter: A biomimetic alternative to electrical stimulation. Sci Rep. 6, 38505(2016).
- Ray, A., Sun, G. J., Chan, L., Grzywacz, N. M., Weiland, J., Lee, E. -J. Morphological alterations in retinal neurons in the S334ter-line3 transgenic rat. Cell Tissue Res. 339, 481-491 (2010).
- Martinez-Navarrete, G., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Fernandez-Sanchez, L., Pinilla, I., Cuenca, N. Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats. Exp Eye Res. 92, 227-237 (2011).
- Sigma Aldrich. Sigma Aldrich Ames Medium Product Information Sheet. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf (2017).
- Reinhard, K., et al. Step-By-Step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays. PLoS ONE. 9, e106148(2014).
- Izumi, Y., Kirby, C. O., Benz, A. M., Olney, J. W., Zorumski, C. F. Müller cell swelling, glutamate uptake, and excitotoxic neurodegeneration in the isolated rat retina. Glia. 25, 379-389 (1999).
- Tunnicliff, G. Glutamate uptake by chick retina. Biochem J. 150, 297-299 (1975).
- Schwartz, E. A., Tachibana, M. Electrophysiology of glutamate and sodium co-transport in a glial cell of the salamander retina. J Physiol (Lond). 426, 43-80 (1990).
- Muller, A., Maurin, L., Bonne, C. Free radicals and glutamate uptake in the retina. Gen Pharmacol- Vasc S. 30, 315-318 (1998).
- Dhingra, N. K., Kao, Y. -H., Sterling, P., Smith, R. G. Contrast threshold of a brisk-transient ganglion cell in vitro. J of Neurophysiol. 89, 2360-2369 (2003).
- Ahlers, M. T., Ammermüller, J. A system for precise temperature control of isolated nervous tissue under optical access: Application to multi-electrode recordings. J of Neurosci Methods. 219, 83-91 (2013).
- Feke, G. T., Tagawa, H., Deupree, D. M., Goger, D. G., Sebag, J., Weiter, J. J. Blood flow in the normal human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30, 58-65 (1989).
- The Retina. Neuroscience. Purves, D., et al. , 2nd edition, Sinauer Associates. (2001).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
