Yöntem makalesi

Bleomycin ile fareler Airways önceden Merkezi Klima Orthotopic akciğer kanseri hücre Engraftment verimliliğini artırır

DOI:

10.3791/56650

⸱

28 Haziran 2018

 ,  , 
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz önceden airways yaralanma ile Klima tarafından fare ciğerlerine akciğer kanser hücrelerinin orthotopic engraftment önemli ölçüde geliştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım aynı zamanda akciğer microenvironment, metastatik yayılması, akciğer kanseri komorbiditeler içinde stromal etkileşimleri çalışmaya uygulanabilir ve daha verimli bir şekilde hasta oluşturmak için xenografts türetilmiş.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer kanseri biyolojik olarak heterojen bir ölümcül tedavi ateşe dayanıklı hastalıktır. Anlama ve etkili bir şekilde göğüs maligniteler tam klinik spektrumu için çeşitli insan akciğer kanseri alt türlerini ve aşamaları özetlemek ek hayvan modelleri ihtiyaç vardır. Homogreft veya xenograft modelleri çok yönlü ve tumorigenic kapasite vivo içindefare ya da insan kökenli malign hücreler kullanarak, miktar etkinleştirin. Ancak, önceden açıklanan yöntemleri akciğer kanseri hücre engraftment, farelerin orthotopic nakli hücrelerin ciğerlerine verimsizlik nedeniyle kanadı gibi fizyolojik olmayan sitelerdeki gerçekleştirilmiş. Bu çalışmada, orthotopic akciğer kanseri hücre engraftment fibrozis inducing Ajan bleomycin ile fareler airways önceden Klima tarafından geliştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bir prototip deney olarak, biz bu yaklaşım tümör hücreleri ya fare veya insan kaynakları, fareler çeşitli suşları aldığınız akciğer adenokarsinom alt türündeki engraft uygulanır. Biz airways bleomycin önce tümör hücre enjeksiyon ile ağır yaralı tümör hücreleri 0-17 engraftment artırır göstermek % 71-%100. Önemli ölçüde, bu yöntem Gelişmiş akciğer tümörü insidansı ve sonraki akıbet farklı modeller ve fare suşları kullanarak. Buna ek olarak, engrafted akciğer kanser hücrelerini akciğerlerden ilgili uzak organlara yaymak. Böylece, kurmak ve yeni orthotopic modelleri akciğer kanseri hücreleri veya biospecimen miktarda sınırlama ile korumak ve kantitatif akciğer kanser hücrelerini fizyolojik ilgili ayarları tumorigenic kapasitesini değerlendirmek için kullanılabilir bir protokol sağlar .

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer kanseri olduğu önde gelen kanser nedeni ile ilgili ölümlerin dünya çapında1. Akciğer kanseri olan hastalarda sonunda metastaz yenik uzak organlara, özellikle merkezi sinir sistemi, karaciğer, böbrek üstü bezleri ve kemikler2,3,4. Torasik maligniteler geleneksel olarak küçük hücreli akciğer kanseri (SCLC) veya küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC)5sınıflandırılmış. NSCLC en sık malignite tanısı ve akciğer adenokarsinom (LUAD) ve akciğer Skuamöz Hücre Karsinomu (LUSC)6dahil olmak üzere farklı histolojik alt alt olduğunu. Genomik analiz rezeke insan birincil akciğer kanserlerinin tümörler belirli bir histotype içinde de daha fazla onların farklı klinik ilerleme katkıda bulunmak ve hastanın prognozu semptomlarıdır çeşitli moleküler tedirginlikler hızlı ortaya koymuştur. Akciğer kanserleri olağanüstü heterojen rasyonel tasarım, önceden klinik test ve etkili tedavi stratejileri uygulanması için önemli bir sorun temsil eder. Sonuç olarak, uysal deneysel akciğer kanser modelleri çeşitli hücresel kökenleri, moleküler alt türlerini ve bu hastalık aşamalarında çalışmaya repertuarı genişletmek için bir ihtiyaç vardır.

Hayvan modellerini kullanarak çeşitli yaklaşımlar akciğer kanseri vivo içindeher biri kendi avantajları ve dezavantajları biyolojik soru (lar) ilgi bağlı olarak çalışmaya istihdam edilmiştir. Genetiği fare modelleri (GEMMs) tümörleri içinde bu ilerleme bir immün konak7içinde kaynaklanan bir verilen progenitör hücre tipi belirli genetik değişiklikler hedefleyebilirsiniz. Son derece güçlü ve klinik, gecikme süresi, değişkenlik ve/veya akciğer tümörü morbidite GEMMs ile ilişkili belirli nicel ölçümler ve uzak organlara8geç sahne metastaz tespiti için engelleyici olabilir. Sayede akciğer kanser hücrelerini, ya doğrudan bir fare tümör elde edilen veya ilk kurulan hücre satırlar halinde kültür, türetilmiş syngeneic ana bilgisayarları yeniden kullanılmaya homogreft modellerinin kullanımı tamamlayıcı bir yaklaşımdır. Mahsum, akciğer kanseri xenografts insan hücre hatları veya hasta türetilmiş tümör örnekleri kurulur. İnsan hücre satır xenografts veya hasta türetilmiş xenografts (PDXs) immün fareler genellikle korunur ve bu nedenle tam bağışıklık-gözetim9engel. Bu dezavantajı rağmen tutarlar için et tümörler daha daha karmaşık genomik aberasyonları kodlamak insan kanser hücrelerinin insan biospecimens ve çalışma temel in vivo özelliklerinin sınırlama yaymak için bir cadde sağlarlar.

Bir yararlı özelliği, allogrefler ve xenografts onlar tümör hücreleri (tikler) bir malign hücre nüfus10içinde başlatma sıklığını ölçmek için kullanılan geleneksel sınırlayıcı hücre seyreltme deneyleri, mükellef olmasıdır. Bu deneylerde, tanımlı bir hücre sayısı subkutan hayvanlar kanat enjekte edilir ve tikler sıklığını tümörü almak oranı dayalı tahmin edilebilir. Subkutan tümörler ancak daha hipoksik11 olabilir ve fizyolojik kısıtları anahtar: akciğer tümörü microenvironment model değil. Ciğerlerine farelerin epitel kök veya progenitör hücrelerin boğaza teslimat Akciğer rejenerasyon ve hava yolu kök hücre biyolojisi12çalışmaya bir yöntemdir. Ancak, akciğerleri ilk yaralanma, viral enfeksiyon13,14gibi fizyolojik formlara tabi olan sürece bu teknik engraftment oranı nispeten düşük olabilir. Destek inflamatuar stromal hücrelerden ve/veya akciğer membran bozulma saklama transplante hücre içine ilgili kök hücre nişler distal havayolları15artırabilir. Ajanlar inducing fibrozis de önceden engraftment indüklenmiş pluripotent hücreler16 ve mezenkimal kök hücre17geliştirmek akciğerlerinin durumu. Hava yolu yaralanma benzer formları engraftment oranı etkileyebilir olsun, tümör Başlatan kapasite ve akciğer kanser hücrelerini akıbet henüz sistematik olarak değerlendirilmesi için.

Bu çalışmada, yaralanma ile fareler akciğerler önceden Klima tarafından orthotopic akciğer kanseri hücre engraftment, verimliliğini artırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. LUAD distal airways kez kötü prognoz19ile karşılıklı olarak ilişkilendirir fibrotik stroma18 geliştirme bu kanser, önemli bir alt ile doğar. Bleomycin, bir doğal nonribosomal hibrid peptid-polyketide, pulmoner fibrozis fareler20de ikna etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bleomycin hava yolu korumak ilk epitel yıpratma alveoller ve inflamatuar hücreler, makrofajlar, nötrofil ve monosit21dahil alımı teşvik etmektedir. Bu doku distal airways, membran yeniden yapılanma22,23 ve hücre dışı matriks (ECM) ifade24remodeling tarafından takip ediyor. Bir tek bleomycin enjeksiyon etkileri geçicidir, çoğu çalışmalar2530 gün sonra çözme fibrozis ile. Bleomycin ile fareler airways önceden Klima önemli ölçüde akciğer hücrelerinde LUAD almak oranı artış olabilir Eğer homogreft ve xenograft modelleri kullanarak, test ettik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Yale Üniversitesi'nde iletişim kuralları uyarınca gerçekleştirilmiştir.

1. set Up / reaktifleri hazırlanması.

  1. Bleomycin
    Dikkat: genel olarak uyumlu sistem (GHS üzerinde) sınıflandırma ve etiketleme, kimyasal bağlı olarak, bleomycin bir GHS08 sa˜l ' sınıflandırılır.
    1. Bleomycin bir kimyasal başlıklı hazırlayın. 15 U 5 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) de resuspend.
    2. Aliquot 100-200 µL çözüm cam içine tüp ve bunları daha sonra kullanmak için-20 ° C'de dondurmak. Düzgün tüpleri resuspension tarihi ile etiketleyin. Bu tarihten itibaren 6 ay içinde kullanın.
      Not: Her fare zorlanma bleomycin26farklı bir duyarlılık vardır. Bleomycin her fare zorlanma için farklı dozlarda test tavsiye edilir. Fare suşları ve temsilcisi deneylerde kullanılan bleomycin karşılık gelen doz Tablo 1' de listelenmiştir.
  2. Fareler
    1. Deney için gerekli fare satın almak ve fareler 7 gün önce enjeksiyon alışmana izin. İnfüzyon Biyogüvenlik mahallede gerçekleştirin. Bleomycin infüzyon önce standart kurumsal yordamları kullanarak bir BSL2 Oda BSL2 sigara uyumlu odasına ev sahipliği hayvanların aktarın. Fareler 6-8 haftalık enjekte.
      Dikkat: tehlikeli ajanlar, Biyogüvenlik seviye 2 için kurumsal yönergeleri (BSL2) ve IACUC onay aşağıdaki fareler enjekte.
      Not: temsilcisi deneyler için satın fare Malzemeler tablolistelenir. Sadece erkek fareler kullanılmıştır.
  3. Akciğer kanseri hücre hatları
    1. Kültür kendi ortamlarına hücre hatlarında istenilen. Enjeksiyon önce kısa tandem tekrar DNA profillemesi veya uygun hücre satır kimlik sağlamak için genetik test gerçekleştirin. Vivo ve ex vivo Imaging kolaylaştırmak için hücre hatları timidin kinaz, yeşil flüoresan protein (GFP) ve luciferase füzyon muhabir27ifade bir lentivirus ile bulaştırmak ve muhabir pozitif hücrelerinin floresans tarafından sıralamak engraftment önce (FACS) sıralama hücre aktif. Hatları Mikoplazma için 6 ayda bir test.
      1. Fetal sığır Serum (FBS), Roswell Park Memorial Enstitüsü Orta (RPMI) % 10 ile kullanarak üretici tarafından önerilen gibi H2030 insan kanser hücre kültürünü kültür penisilin-streptomisin ve amfoterisin b
      2. Kültür 368T1 fare hücre kültürünü ( KrasG12D; p53- / - fare--dan türetilmiş) % 10 ile Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) kullanarak FBS, penisilin-streptomisin ve amfoterisin b
      3. RPMI % 10 ile kullanarak PC9 insan kanser hücre kültürünü kültür FBS, penisilin-streptomisin ve amfoterisin b

2. bleomycin tedavi

  1. Fareler intratracheally bleomycin ile 14 gün önce tümör hücre engraftment enjekte edeceğim.
  2. Bleomycin hisse senedi üzerinde buz enjeksiyon öncesinde 2 h çözülme.
  3. Bir kez çözdürülen, bleomycin istenen çalışma konsantrasyonu (0.02 U/50 µL veya 0.005 U/50 µL) sulandırmak ve buz üzerinde tutun.
    Not: (Tablo 1) deneyler için kullanılan fare zorlanma bleomycin konsantrasyon bağlıdır. Bleomycin farelerde titrasyon en uygun doz belirlemek için yapılmalıdır.
  4. Ketamin ve xylazine 10 mg/mL ve 1 mg/mL, son bir konsantrasyon için sırasıyla sulandrarak anestezi hazırlamak, 1 mL şırınga ve 27 G iğne kullanarak, her fare 100/10 mg/kg intraperitoneally ketamin/xylazine çözüm enjekte edilerek anestezi anılan sıraya göre.
  5. Fareler nefes izlemek ve bir ayak çimdik istihdam. Fare çimdik tırnağa vermezse uygun anesthetization doğrulayın. Veteriner merhem gözleri kuruluk anestezi iken altında önlemek için uygulayın.
  6. 1 fare bir entübasyon platformu üzerinde bir anda sırtını karşı platform ile ön dişlerinin asarak yerleştirin.
  7. Trakea görselleştirme ile yardımcı olmak için bir fiber optik ışığı kullanarak üst gögüs aydınlatmak. Farenin ağzı açık ve dil yavaşça steril düz forseps ile çekin.
  8. Bir damar içi kateter iğne olmadan nefes engelleme önlemek için kullanın. Pozisyon beyaz ışık üzerinde Kateter borusu açılışa yayılan.
  9. Kateter üst ön dişleri ulaşıncaya kadar Kateter borusu yerleştirin. Trakea kateterin uygun yerleştirme kateter açılış ağız ile parlayan beyaz ışık görselleştirme tarafından onaylayın.
  10. Bir pipet kullanarak, bleomycin veya araç (PBS) 50 µL birimin tümü inhale sağlamak için doğrudan kateter dağıtmak. Steril koşullarda bu adımı gerçekleştirin.
  11. Kateter doğru eklediyseniz, fare hemen kateter içeriğini nefes. Birimin tümü kateter geçecek kadar birkaç saniye bekleyin. Daha sonra kateter trakea kaldırmak ve % 10 çamaşır suyu çözümde atmayın.
    Not: 2.7-2,11 adımlardan fare başına ortalama saat yaklaşık 5 dk dır.
  12. Fare sıvı teneffüs edilmesi değil, dikkatli bir şekilde nefes izlemek ve kateter konumunu ayarla. Fare solunum durur, kateter hemen kaldırın ve normal kateter yeniden takmadan önce nefes devam etmek fareyi izin.
  13. Enjekte fareyi bir IACUC onaylı ısıtma yastığını onların geri kurtarma için düz bir yüzeye yerleştirin. Tüm prosedürü fare başına 10 dk sürer. Enjeksiyon tamamen iyileşti kadar diğer hayvanların şirkete uğramıştır bir hayvan döndürmüyor.
  14. 24 h için kafes "Tehlikeli kimyasal ın Use" kartı yerleştirin.

3. izleme fareler sonrası entübasyon

  1. Anesteziden fareler uyanıncaya kadar fareler solunum için hemen entübasyon ve sonra her 15 dk sonra izlemek. Onlar sternal recumbency korumak için yeterli bilinci yerine kadar fareler sahipsiz bırakmayın.
  2. İntraperitoneally ağrı hafifletmek için ketoprofen (5 mg/kg) enjekte.
  3. Fareler 24 saat mesaj entübasyon ve haftada 3 kez hastalık belirtisi için inceleyin.
  4. Yordam, hayvan kimlik, yordam türünü, anestezi ve ameliyat sonrası izleme gözlemler kez tür tarihi bir kaydını tutmak.
  5. Fareler için kilo kaybı, solunum güçlüğü, davranış bozuklukları ve vücut durumu puanı izlemek < 2 (vertebral sütunun belirgin/dorsal pelvik kemik segmentasyon aşikar) iki haftada bleomycin enjeksiyonu takiben.
  6. Solunum zorluğu altında fare veya vücut kitle CO2 veya ketamin/xylazine servikal çıkığı tarafından takip kaybı % 15 yaşamış fareler ötenazi. Ötenazi palpasyonla solunum aktivitesi için yaparak onaylayın.

4. akciğer adenokarsinom hücre hatları engraftment.

Not: engraftment hücre bleomycin (adım 2.1) enjeksiyon sonra 14 gün gerçekleştirmek.

  1. Hücreleri 75 cm2 şişeler içinde karşılık gelen medya ile enjeksiyon gün önce 3 gün boyunca adım 1.3 belirtildiği gibi rahatsız edilmeden büyümeye izin.
    Not: Onlar enjeksiyon gününde % 80 birleşmesi olmalıdır (hangi karşılık gelen 2-3 x 10 için6 hücre bağlı olarak her şişesi ').
  2. 75 cm2 şişeler ile Oda sıcaklığında 5 mL de PBS üzerinde büyüyen hücreler yıkayın.
  3. PBS Aspire edin ve tripsin 1,5 mL hücrelere ekleme ve hücreleri (tipik olarak 2-5 dk) ayırmak kadar 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    Not: Her 2 min için hücre dekolmanı plastik şişeye veya hafif bir mikroskop altında alt basit görselleştirme tarafından kontrol önerilir. 5 dk, kuluçka tripsin ile fazla olamaz.
  4. 4 mL % 10 içeren medya ekleyerek tripsin nötralize FBS (adım 4.1 olarak aynı medya). 15 mL tüp içine hücreleri toplamak ve vasıl 200 x g oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.
  5. Medya Aspire edin ve hücre Pelet hücreleri yıkamak için PBS 5 mL resuspend. Hücreleri 200 x g hücreleri cips için oda sıcaklığında 3 dk de santrifüj kapasitesi. Bu 1 kez tekrarlayın.
  6. PBS Aspire edin ve Pelet PBS 1,5 ml şişe başına resuspend.
  7. Hücre karışımdan 50 µL trypan mavi 50 µL ile karıştırın ve bir hücre sayaç/hemasitometre odası28kullanarak hücreleri saymak.
  8. Hücre süspansiyon 1 x 105 hücreleri (veya belirtilen diğer tutar) enjekte etmek için PBS hücrelerde sulandrarak fare başına 50 µL hazırlayın. Hücreler buz enjeksiyon önce tutmak.
    Not: enjeksiyon hücre süspansiyon azalmasını önlemek en az iki kat daha fazla hücreleri hazırlayın.
  9. Ketamin ve xylazine 10 mg/mL ve 1 mg/mL, son bir konsantrasyon için sırasıyla sulandrarak anestezi hazırlamak, 1 mL şırınga ve 27 G iğne kullanarak, her fare 100/10 mg/kg intraperitoneally ketamin/xylazine çözüm enjekte edilerek anestezi anılan sıraya göre.
  10. Fareler nefes izlemek ve bir ayak çimdik istihdam. Fare çimdik tırnağa vermezse uygun anesthetization doğrulayın. Veteriner merhem gözleri kuruluk anestezi iken altında önlemek için uygulayın.
  11. 1 fare bir entübasyon platformu üzerinde bir anda sırtını karşı platform ile ön dişlerinin asarak yerleştirin.
  12. Trakea görselleştirme ile yardımcı olmak için bir fiber optik ışığı kullanarak üst gögüs aydınlatmak.
  13. Yavaşça kümeleri oluşturmak değil emin olmak için bir p200 pipet kullanarak hücreleri resuspend. Farenin ağzı açık ve dil yavaşça steril düz forseps ile çekin.
  14. Bir damar içi kateter nefes engelleme önlemek için kaldırıldı iğne ile kullanın. Pozisyon beyaz ışık üzerinde Kateter borusu açılışa yayılan.
  15. Kateter üst ön dişleri ulaşıncaya kadar Kateter borusu yerleştirin. Trakea kateterin uygun yerleştirme kateter açılış ağız ile parlayan beyaz ışık görselleştirme tarafından onaylayın.
  16. Bir pipet kullanarak, hücre 50 µL birimin tümü inhale sağlamak için doğrudan kateter dağıtmak. Steril koşullarda bu adımı gerçekleştirin.
    Not: kateter doğru eklediyseniz, fare hemen kateter içeriğini nefes.
  17. Birimin tümü kateter geçecek kadar birkaç saniye bekleyin ve sonra kateter trakea kaldırmak ve % 10 çamaşır suyu çözümde atmayın.
  18. Fare sıvı teneffüs edilmesi değil, dikkatli bir şekilde nefes izlemek ve kateter konumunu ayarla. Fare solunum durur, kateter hemen kaldırın ve normal kateter yeniden takmadan önce nefes devam etmek fareyi izin.
    Not: Fare adımlardan 4.11-4,18 başına ortalama saat yaklaşık 5 dk dır.
  19. Enjekte fareyi bir IACUC onaylı ısıtma yastığını onların geri kurtarma için düz bir yüzeye yerleştirin.
    Not: Tüm prosedürü fare başına 10 dk sürer. Enjeksiyon tamamen iyileşti kadar diğer hayvanların şirkete uğramıştır bir hayvan döndürmüyor.
  20. Tüm kaburga alan her iki ventrally tıraş ve dorsally B6129SF1/J ve diğer fare suşları koyu saçlı bir elektrikli tıraş makinesi görüntüleme önce kullanarak.
  21. 2-3 dakika sonra hücre enjeksiyon, enjekte biyoluminesans 100 µL retro-orbitally (15 mg/mL) bir insülin iğne kullanarak. Enjeksiyon görüntüleme her oturum için kullanılan göz alternatif.
  22. En az 2 dakika sonra 5 fareler bir hayvan bioluminescence Imager dorsal recumbency pozisyonda yerleştirin ve ventral resmi ışıldama ayarları29kullanarak elde.
  23. Kontrol panelinin altında belli bir hücre satır ışıldama ölçmek için çözünürlük ve hassasiyet ayarları yapın. Çoğu uygulama için 3 dk (veya "Auto" doymuş varsa), binning başlatın Orta (4), F/Durdur = 1, görüş alanı = D, konu yükseklik = 1,50 =.
    Not: enjeksiyon başarılı olursa, üst gögüs alanında bir akciğer veya her iki akciğer ışıldama sinyal algılanır.
  24. Fiske vurmak fareler sternal recumbency üzerine getirin ve yukarıdaki gibi dorsal bir resim elde etmek.
    Not: Eğer hücre enjeksiyon düzgün yapılır değil, hücre girişinde trakea veya boyun küme.
  25. Ketoprofen iğne intraperitoneally ağrı hafifletmek için 5 mg/kg.
  26. Fareler için onların kafes dönebilir ve kafes üzerinde bir "BSL-2 ajan ın Use" kartı yerleştirin.
  27. Anesteziden fareler uyanıncaya kadar fareler için solunum entübasyon ve hemen sonra her 15 dk sonra izlemek. Onlar sternal recumbency korumak için yeterli bilinci yerine kadar fareler sahipsiz bırakmayın.
  28. Fareler 24 saat mesaj entübasyon ve hastalık belirtisi için haftada üç kez inceleyin.
  29. Yordam, hayvan kimlik, yordam türünü, türü anestezik ve ameliyat sonrası izleme gözlemler ve kez tarihi seyir defteri kaydını tutun.
  30. İzlemek fareler kilo kaybı, solunum güçlüğü, davranış bozuklukları ve vücut durumu puanı için < 2 (vertebral sütunun belirgin/dorsal pelvik kemik segmentasyon aşikar) iki haftada bleomycin aşılama sonrasında.
    Not: Akciğer tümörleri ile fareler solunum tahriş, kilo kaybı, kaşeksi ve/veya Ölüm sergileyebilirler.
  31. Solunum zorluğu altında fare veya vücut kitle CO2 veya ketamin/xylazine doku toplama servikal çıkığı tarafından takip kaybı % 15 yaşamış fareler ötenazi. Ötenazi palpasyonla solunum aktivitesi için yaparak onaylayın.

5. tümör büyüme Bioluminescence görüntüleme tarafından izlenmesi

  1. Bundan sonra görüntüleme 3 gün sonrası engraftment ve haftalık farelerin yineleyin.
  2. Fareler (2.4-2,5 adımlarda açıklandığı gibi) ketamin/xylazine enjekte veya inhale isoflurane (% 2) anestezi. Nefes farelerin izlemek ve uygun anesthetization onaylamak için bir ayak çimdik istihdam. Veteriner merhem gözleri kuruluk anestezi iken altında önlemek için uygulayın.
  3. Tüm kaburga alan her iki ventrally tıraş ve dorsally B6129SF1/J ve diğer fare suşları koyu saçlı bir elektrikli tıraş makinesi görüntüleme önce kullanarak.
  4. Fareler anestezi altında olduğunda, biyoluminesans 100 µL retro-orbitally enjekte (15 mg/mL) bir insülin iğne kullanarak. 2 dk. alternatif enjeksiyon görüntüleme her oturum için kullanılan göz bekleyin.
  5. Fareler içinde Imager yerleştirin ve 4.22 4.24 adımlarda açıklandığı dorsal ve ventral görüntüleri elde etmek.
  6. Fareler kafesin içine sonra görüntüleme, onların geri kurtarma için düz bir yüzeye yerleştirin.
    Not: Tüm prosedürü 5 farelerin grup başına 5 dk sürer. Onlar sternal recumbency korumak için yeterli bilinci yerine kadar fareler sahipsiz bırakmayın.
  7. Imager/bioluminescence analiz yazılımı kullanarak görüntüleri analiz.
    1. Uygun görüntü seçin ve bir grup olarak bioluminescence analiz yazılımı yükleyin.
    2. ' I tıklatın yatırım getirisi aracı | Meydanı faiz (ROI) kare bir bölgesine eklemek için. ROI tüm akciğer görüntü kapsayan üst göğüs üzerinde yerleştirin. Bunu her fare görüntü için tekrarlayın.
    3. Doğru tıkırtı ve seçme grubundaki tüm görüntüleri aynı YG uygulamak ve fareler, ventral ve dorsal sayısı üst göğüs pozisyon için işlev Tüm ROI kopyalayın .
    4. Görüntü penceresinin üst sol köşesindeki fotonlar işlevini seçin. ROIs ölçmek için ölçü birimi Denetim Masası işlevi tıklatın. Kopyalayın ve toplam akı (fotonlar/s) içeren çıkış tablo verilerinizi daha fazla çözümlemek için seçim bir yazılım yapıştırın.
    5. Her fare gün 0 ölçülür ROI değeri günlük ROI değerini normalleştirmek.

6. doku yalıtım ve işleme.

  1. Fareler (adımları 2.4-2,5 veya inhale isoflurane (% 2) tarafından açıklandığı gibi. ketamin/xylazine enjekte edilerek anestezi Nefes farelerin izlemek ve bir ayak çimdik istihdam. Fare çimdik tırnağa vermezse uygun anesthetization doğrulayın. Veteriner merhem gözleri kuruluk anestezi iken altında önlemek için uygulayın.
  2. Biyoluminesans 100 µL retro-orbitally enjekte (15 mg/mL) bir insülin iğne kullanarak. 2 dakika bekleyin.
  3. Adımları 4.22-4.24 bu protokol sonrası görüntü fareler.
  4. Adım 6.2 diğer göz içine biyoluminesans retro-orbitally önce ötenazi bir insülin iğne kullanarak başka bir 100 µL enjekte.
  5. Ketamin/xylazine mayi enjeksiyonu ile fareler ötenazi fareler IACUC tarafından sağlanan yönergelere uygun olarak derin anestezi altında iseniz (bkz. Adım 2.4 Ayrıntılar için) servikal çıkığı tarafından takip etti. Ötenazi palpasyonla solunum aktivitesi için yaparak onaylayın.
  6. Steril Cerrahi makas yapmak bir cilt kesi göğüs kemiğinin altında kullanarak. Forseps ve cerrahi makas kullanarak diyafram boyunca kas katmanı açın ve göğüs boşluğuna ya iç torasik arter kaçınarak yanal iki tarafın üzerinde göğüs kafesi ile kesme tarafından ortaya çıkarmak.
  7. Kalbin sağ atriyum içerisinde küçük bir kesi yaparak fare sıvı ve PBS 5 mL sol ventrikül yoluyla enjekte. Kan perfüzyon düzgün yapılırsa akciğer dokusu rengi kırmızıdan soluk pembe-beyaz için gidecek.
  8. Göğüs boşluğuna akciğerlerden dikkatle tarafından kapma forseps ile yemek borusu veya kalp tüketim. Yavaşça doku çekin ve cerrahi makas dikkatle ponksiyon akciğer dokusunun kaçınarak bağlama doku kesmek için kullanın. Trakea akciğer solunum yolları daha sonraki bir aşamada enflasyon için mümkün olduğunca korumak.
  9. Akciğer batış ve doku aşırı kan kaldırmak için PBS 3 mL ile dolu bir 6 iyi tabak içinde 3 kez dönen yıkayın.
  10. Akciğer 6 iyi plaka kapak üzerine yerleştirin ve kollarındaki Imager dokusunda içeren kapak yerleştirin ve ışıklı resim30elde etmek.
    Not: Aşağıdaki ayarları "edinme Denetim Masası'ndan" seçme öneririz "görüş alanı = A" ve "konu Yükseklik = 0,75 cm" ve sonra "otomatik pozlama" doymuş görüntüleri almamak için.
  11. Tüketim ve diğer organlar, adım 6,9-6.10, nerede metastaz tespit edilmiştir ışıldama, beyin, karaciğer, böbrek üstü, kemik, lenf düğümleri, böbrek veya dalak31gibi tarafından yapılan gibi görüntü.
  12. Akciğer 1 mL % 4 paraformaldehyde ile fare nefes borusu iğne ekleyerek sıvı. Akciğerleri iyi perfused izin verirseniz şişirmek.
    Dikkat: %4 paraformaldehyde bir toksik, bir sağlık olduğunu GHS07 ve GHS08 tehlike.
  13. Akciğerler ile % 4 paraformaldehyde 5 mL konik bir 15 mL içine aktarın.
  14. Akciğer veya diğer dokularda dokuya %4 paraformaldehyde gecede 4 ° C'de 30-50 RPM titreyen bir cihaz ile kuluçka tarafından tamir.
  15. Akciğerler (veya diğer dokularda) parafin veya optimum kesim sıcaklık bağlı olarak uygulama32bileşik katıştırın.
    Not: Parafin akciğer yapısı korumak için tercih edilen yöntemdir ve Masson Trichrome ve hematoksilen-eozin boyama için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LUAD kanser hücre engraftment ciğerlerine farelerin verimliliğini artırmak için ilk orthotopic tümör hücre enjeksiyon (Şekil 1) tarafından takip bleomycin kullanarak airways ön koşulları bir protokol geliştirdi. Biz bile immün korele fareler yönetilen zaman bleomycin geçici fibrozis gün kaybı hava yolu mimarisi ve artmış kollajen birikimi (Şekil 2) tarafından kanıtlanan 14 tarafından indüklenen doğruladı. Bu farelerde brüt fibroz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer kanseri ve diğer kronik hastalıklar akciğer36arasında çarpıcı klinik paralellikler belgelenmiştir. Özellikle, idiyopatik pulmoner fibrozis (IPF) olan hastalarda gelişen akciğer kanseri için artan bir tercih var ve bu ilişki geçmiş37,38sigara bağımsızdır. IPF ilerici imha akciğer mimarisi ve bozulmuş solunum işlevini, ECM39birikimi ile karakterizedir. Ayrıca, cerrahi rezeksiyon bir zavallı sonucu

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada Ulusal Kanser Enstitüsü (R01CA166376 ve R01CA191489 D.X. Nguyen için) ve Savunma Bakanlığı (W81XWH-16-1-0227 D.X. Nguyen için) gelen hibe tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BleomisinSigmaB5507-15UNDİKKAT Sağlık tehlikesi GHS08
Exel Kateter 24GFisher1484121İğneyi çıkarın. İntratrakeal enjeksiyon için
Ketamin (Ketaset inl 100 mg / mL C3N 10 mL)Butler Schein56344Fareleri uyuşturmak için
XylazineButler Schein33198Fareleri uyuşturmak için
Ketoprofen, 5.000 mgCayman Chemical10006661Analjezik
Puralube Veteriner Oftalmik MerhemBUTLER HAYVAN SAĞLIĞI ŞİRKETİ LLC8897Anestezi altındayken göz kuruluğunu önlemek için
D-Luciferin tozuPerkin Elmer Sağlık Bilimleri A.Ş.122799Lüminesan görüntüleme için. 15 mg / mL'lik bir çalışma konsantrasyonu için tozu PBS ile sulandırın. Işıktan Koruyun
Kemirgen Entübasyon standıBraintree ScientificRIS-100İntratrakeal enjeksiyon için önerilen stand
MI-150 AYDINLATICI 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823MSoluk borusunu aydınlatmak ve görselleştirmek için
Graefe Forseps, 2.75 (7 cm) uzunluğunda serratRobozRS-5111İntratrakeal enjeksiyon için
Şırınga Luer-Lok Steril 5mlBD / Fisher309646
Saten Pürüzsüz by Conair Çift Folyo Islak/Kuru Şarj Edilebilir Tıraş MakinesiConair-Fareleritıraş etmek için
Bonn Makas, 3,5" düz 15 mm keskin/keskin kesin kesim bıçaklarıRobozRS-5840SC
15 mL konik tüpBD / Fisher352097
1.5 mL santrifüj tüpleriABD SCIENTIFIC INC1615-5500
Flakon Sintilasyonu 7 mL Borosilikat Cam GPIFisher701350
Filtre pipet uçları (200 μ L)ABD SCIENTIFIC INC1120-8710
Fosfat Tamponlu Tuzlu Yaşam Teknolojileri14190-144
%0.25 Tripsin-EDTAYaşam Teknolojileri25200-056
DMEM yüksek glikozYaşam Teknolojileri11965-092
RPMI Orta 1640Yaşam Teknolojileri11875-093
Fetal sığır serumu USDAYaşam Teknolojileri10437-028
Penisilin-StreptomisinYaşam Teknolojileri15140-122
Amfoterisin BSigmaA2942-20ML
Tripan Mavi Leke %0.4YaşamTeknolojileri15250-061
Kontes Otomatik Hücre SayacıYaşam TeknolojileriAMQAX1000
Şişesi T/C 75cm sq eğimli boyun, mavi şapkaFisher / Corning 353135
IVIS Spektrumu Ksenojen BiyolüminesansPerkin Elmer Sağlık Bilimleri A.Ş. 124262 in vivo biyolüminesans görüntüleme için
Canlı görüntü yazılımıPerkin Elmer Sağlık Bilimleri A.Ş. 128113 in vivo biyolüminesans analizi
XGI-8 Gaz Anestezi SistemiPerkin Elmer Sağlık Bilimleri A.Ş118918İzofluran anestezisi için
BD Ultra-Fine II Kısa İğne İnsülin Şırıngası 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 inç)BD / FisherBD328418Retro-orbital lusiferin enjeksiyonu için
Şırınga 1mlBD / Fisher14-823-434İntraperitoneal enjeksiyonlar için
26 G x 1/2 inç iğneBD / Fisher305111İntraperitoneal enjeksiyonlar için
%4 ParaformaldehitVWR43368-9MDİKKAT Sağlık tehlikesi GHS07, GHS08. Dokuyu sabitlemek için
Pipet-Lite Pipet, Unv. SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL
Mayer's HematoksilenELEKTRON MİKROSKOPİSİ BİLİMLERİ517-28-2
Eozin Y lekesi %57'de %0,25 (a/h)Fisher67-63-0
Masson Trikrom Leke KitiIMEB IncK7228Kollajeni görselleştirmek için masson trikrom lekesi için
Superfrost plus cam slaytlarFisher
6 oyuklu plakaCorningC3516
Evrensel Mikoplazma Tespit KitiATCC30-1012K
OCT Gömme bileşiğiELEKTRON MİKROSKOPİSİ BİLİMLERİ62550-12Donmuş bölümler için doku gömmek için
Leica CM3050 S Araştırma KriyostatıLeicaCM3050 SBoyama analizi
için dokuyu kesit almakKeyence Hepsi Bir Arada Floresan MikroskobuKeyenceBZ-X700
ImageJABD Ulusal Sağlık EnstitüleriIJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Mac OS X için Prism 7.0GraphPad Software, Inc.-
Atimik (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) farelerCharles RiverNIH-553
NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) farelerJackson Laboratories5557
B6129SF1/J farelerJackson Laboratories101043
NIH-H2030 hücreleriATCCCRL-5914
368T1Monte Winslow (Standford Üniversitesi)-
PC9 hücreleriNguyen DX et al. Cell. 2009; 138:51;
BrM3 hücreleriNguyen DX ve ark. Hücre. 2009; 138:51; 62-
, . 17014411 1255015 tarafından cömertçe sağlanır 62-H2030

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  4. Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
  5. Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
  6. Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
  7. Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
  8. Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
  9. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  10. Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
  11. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
  12. Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
  13. Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
  14. Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
  15. Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
  16. Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
  17. Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
  18. Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
  19. Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
  20. Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
  21. Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
  22. Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
  23. Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
  24. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
  25. Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
  26. Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
  27. Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
  28. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
  29. Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , pdb prot078261 (2015).
  30. Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
  31. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
  32. Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
  33. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
  34. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
  35. Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
  36. Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, Suppl 2. S3-S10 (2004).
  37. Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
  38. Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
  39. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
  40. Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
  41. Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
  42. Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
  43. Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
  44. Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
  45. Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
  46. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
  47. Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bleomycin Pre ConditioningTumor Cell EngraftmentLung Adenocarcinoma ModelIntratracheal InjectionBioluminescence ImagingMouse Strain VariabilityMetastasis DetectionFibrosis InductionXenograft Tumor Models

İlgili makaleler