Bu iletişim kuralı T lenfosit photoactivatable peptid-MHC, T hücre aktivasyonu hassas kronolojik zamanmekansal kontrol etkinleştirme kullanarak etkinleştirmek için bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü
Bu makalede
Özet
Özet
T lenfositler TCR etkinleştirme aşağıdaki birkaç dakika içinde meydana gelen hızlı, polarize işaret içinde meşgul. Bu oluşumu immünolojik sinaps, T hücre aktivasyonu düzenleyen ve directionally efektör yanıt hedefleyen bir sterotiplenmiş hücre-hücre kavşak neden olmaktadır. Bu süreçlerin etkin bir şekilde çalışmak için hızlı, polarize yanıt-e doğru esir alma için uyarlanmış bir düşsel yaklaşımı gereklidir. Bu iletişim kuralı ultraviyole ışığa maruz kadar yani uyarıcı olmayan bir photoactivatable peptid-Binbaşı MHC kompleksi (pMHC) dayalı böyle bir sistem açıklar. Hedeflenen Bu reaktif videomicroscopy deneyler sırasında decaging TCR etkinleştirme kesin kronolojik zamanmekansal kontrol ve yüksek çözünürlüklü Imaging sonraki hücresel yanıtları toplam iç yansıma (TIRF) tarafından izleme sağlar. Bu yaklaşım da genetik ve farmakolojik pertürbasyon stratejileri ile uyumludur. Bu TCR sinyal immünolojik synapse altında yatan polarize hücre iskeleti yapıların oluşumu için bağlantı iyi tanımlanmış moleküler yolları Meclisi sağlar.
Giriş
T lenfositler (T hücreleri) hücresel bağışıklık hücre yüzeyine MHC bağlamında görüntülenen antijenik peptidler tanıyarak merkezi bir rol oynamaktadır. TCR tarafından aracılık ettiği, Antijen tanıma saf T hücre farklılaşma sürücüler ve cytolytic ve iletişimsel tepkileri efektör nüfus tarafından teslim teşvik etmektedir. TCR nişan da hücresel mimarisi dramatik değişiklikler neden olmaktadır. Birkaç dakika içinde T hücreleri taktımı immünolojik synapse (IS)1,2olarak bilinen bir polarize arayüz şekillendirme (APC), antijen sunan hücrenin kenarını üzerine. Is yönlü yayın sitokinler veya sitotoksik T lenfositler (CT....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. uyarıcı cam yüzeylerin hazırlanması
- Kat 8-şey odalı coverglass biotinylated Poli-L-lizin (Bio-PLL) ile 1:500 distile, deiyonize su (GKD2O) seyreltilmiş. (RT) oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
- H2ile O. yıkama
- Kuru RT. 2 h için
- Blok biyo-PLL yüzeyler RT., 30 dk için engelleme arabellek (HEPES arabelleğe alınmış serum [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], %2 BSA) ile kaplı
- Poli-L-lizin hydrobromide 10 mM NaPO4, pH 8,5 1 ml 5 mg geçiyoruz.
- 125 μmol (0.55 mg) NHS-biotin (DMSO 100 mg/mL stokta) ekleyin ve reaksiyon pH kontrol edin. PH 8,5 altında ise 4 N NaOH pH 8,5 ve 9.5 arası....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Photoactivation ve düşsel yaklaşımı gözlem ve hızlı, polarize sinyal yanıtlar facile miktar sağlar. Çoğaltılamaz yeteneklerini göstermek için işte TCR kaynaklı DAG birikimi ve centrosome hale gelmesini arasında kronolojik zamanmekansal korelasyon inceleyerek bir deney. 5C. C7 T hücre patlamaların retrovirally ile 2 floresan gazetecilere transduced: GFP (C1-GFP) ve RFP tübülin centrosome izlemek için tandem C1 etki alanlarından protein kinaz C-θ içeren bir DAG Biyoalgılayıcı bağlantılı. T .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Son yıllarda, ışık spatiotemporally kontrollü harekete geçirmek-in hücresel süreçler için mükemmel bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, her ilişkili avantajları ve dezavantajları. İmmobilize, hücre dışı ligandlar decaging üzerinde dayanır, burada açıklanan sistem hızlı, hücre altı, polarize sinyal yanıt analiz için idealdir. Bu yaklaşım yukarıda açıklandığı gibi T hücrelerinin oluşumunda IS incelemek için uygulanmıştır. Ayrıca, diğer reseptörleri için Kafesli ligandlar, inhibitör doğal öl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Biz üye Huse laboratuarının tavsiye ve yardım için teşekkür ederim. ABD Ulusal Sağlık (M.H. için R01-AI087644) ve P30-CA008748 Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi için Enstitüleri tarafından desteklenen.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Nunc Lab-Tek Odacıklı Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poli-L-lizin hidrobromür | Sigma-Aldrich | P2636 | Biyotinile Poli-L-Lizin |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | yapması gerekecek Biyotinillenmiş Poli-L-Lizin |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligaz standart reaksiyon kiti | Avidity | BirA500 | Proteinleri biyotinillemek için kullanılacak |
| Biyotinillenmiş Hb I-EK | Protein katlanması için referans 6'ya bakın. Biyotinilasyon için BirA kiti | ||
| Biyotinillenmiş NPE-MCC I-EK kullanın | Anaspec | Özel NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K (Nvoc) -QATK-OH), Anaspec | |
| Biotinylated & alpha'dan satın alınabilir; H2-Kk antikoru | BD Biosciences | 553591 | |
| Biyotinillenmiş NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Özel NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) Anaspec | |
| Biotinilated KAVY H2-Db | Anaspec | Özel sentezlenmiş protein (KAVYDFATL), Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | Protein katlanması için protokoldeki referansa bakın. Biyotinilasyon için BirA kiti kullanın | ||
| El tipi UV lambası | UVP | UVGL-25 | Lamba numuneden < 1 cm uzakta tutulur. Algılanabilir ölçüm için 30 sn 365 ışık, kantitatif ölçüm için 20 dakika yeterlidir. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF sistemi. | Olympus | Görüntüleme sistemi hakkında daha fazla bilgi Şekil 6 | |
| Mosaic dijital diyafram | Andor | ||
| Slidebook yazılımında | Görüntüleme Yenilikleri |
Kaynaklar
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311(2010).
- Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
