Method Article

T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü

DOI:

10.3791/56655

⸱

April 25th, 2018

 , 
1Immunology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Weill-Cornell Graduate School of Medical Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı T lenfosit photoactivatable peptid-MHC, T hücre aktivasyonu hassas kronolojik zamanmekansal kontrol etkinleştirme kullanarak etkinleştirmek için bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T lenfositler TCR etkinleştirme aşağıdaki birkaç dakika içinde meydana gelen hızlı, polarize işaret içinde meşgul. Bu oluşumu immünolojik sinaps, T hücre aktivasyonu düzenleyen ve directionally efektör yanıt hedefleyen bir sterotiplenmiş hücre-hücre kavşak neden olmaktadır. Bu süreçlerin etkin bir şekilde çalışmak için hızlı, polarize yanıt-e doğru esir alma için uyarlanmış bir düşsel yaklaşımı gereklidir. Bu iletişim kuralı ultraviyole ışığa maruz kadar yani uyarıcı olmayan bir photoactivatable peptid-Binbaşı MHC kompleksi (pMHC) dayalı böyle bir sistem açıklar. Hedeflenen Bu reaktif videomicroscopy deneyler sırasında decaging TCR etkinleştirme kesin kronolojik zamanmekansal kontrol ve yüksek çözünürlüklü Imaging sonraki hücresel yanıtları toplam iç yansıma (TIRF) tarafından izleme sağlar. Bu yaklaşım da genetik ve farmakolojik pertürbasyon stratejileri ile uyumludur. Bu TCR sinyal immünolojik synapse altında yatan polarize hücre iskeleti yapıların oluşumu için bağlantı iyi tanımlanmış moleküler yolları Meclisi sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T lenfositler (T hücreleri) hücresel bağışıklık hücre yüzeyine MHC bağlamında görüntülenen antijenik peptidler tanıyarak merkezi bir rol oynamaktadır. TCR tarafından aracılık ettiği, Antijen tanıma saf T hücre farklılaşma sürücüler ve cytolytic ve iletişimsel tepkileri efektör nüfus tarafından teslim teşvik etmektedir. TCR nişan da hücresel mimarisi dramatik değişiklikler neden olmaktadır. Birkaç dakika içinde T hücreleri taktımı immünolojik synapse (IS)1,2olarak bilinen bir polarize arayüz şekillendirme (APC), antijen sunan hücrenin kenarını üzerine. Is yönlü yayın sitokinler veya sitotoksik T lenfositler (CT....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. uyarıcı cam yüzeylerin hazırlanması

  1. Kat 8-şey odalı coverglass biotinylated Poli-L-lizin (Bio-PLL) ile 1:500 distile, deiyonize su (GKD2O) seyreltilmiş. (RT) oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
  2. H2ile O. yıkama
  3. Kuru RT. 2 h için
  4. Blok biyo-PLL yüzeyler RT., 30 dk için engelleme arabellek (HEPES arabelleğe alınmış serum [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], %2 BSA) ile kaplı
    1. Poli-L-lizin hydrobromide 10 mM NaPO4, pH 8,5 1 ml 5 mg geçiyoruz.
    2. 125 μmol (0.55 mg) NHS-biotin (DMSO 100 mg/mL stokta) ekleyin ve reaksiyon pH kontrol edin. PH 8,5 altında ise 4 N NaOH pH 8,5 ve 9.5 arası....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Photoactivation ve düşsel yaklaşımı gözlem ve hızlı, polarize sinyal yanıtlar facile miktar sağlar. Çoğaltılamaz yeteneklerini göstermek için işte TCR kaynaklı DAG birikimi ve centrosome hale gelmesini arasında kronolojik zamanmekansal korelasyon inceleyerek bir deney. 5C. C7 T hücre patlamaların retrovirally ile 2 floresan gazetecilere transduced: GFP (C1-GFP) ve RFP tübülin centrosome izlemek için tandem C1 etki alanlarından protein kinaz C-θ içeren bir DAG Biyoalgılayıcı bağlantılı. T .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, ışık spatiotemporally kontrollü harekete geçirmek-in hücresel süreçler için mükemmel bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, her ilişkili avantajları ve dezavantajları. İmmobilize, hücre dışı ligandlar decaging üzerinde dayanır, burada açıklanan sistem hızlı, hücre altı, polarize sinyal yanıt analiz için idealdir. Bu yaklaşım yukarıda açıklandığı gibi T hücrelerinin oluşumunda IS incelemek için uygulanmıştır. Ayrıca, diğer reseptörleri için Kafesli ligandlar, inhibitör doğal öl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz üye Huse laboratuarının tavsiye ve yardım için teşekkür ederim. ABD Ulusal Sağlık (M.H. için R01-AI087644) ve P30-CA008748 Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi için Enstitüleri tarafından desteklenen.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nunc Lab-Tek Odacıklı CoverglassThermofischer Scientific155361
Poli-L-lizin hidrobromürSigma-AldrichP2636Biyotinile Poli-L-Lizin
EZ-Link NHS-BiotinThermofischer Scientific20217yapması gerekecek Biyotinillenmiş Poli-L-Lizin
StreptavidinThermofischer Scientific434301
BirA-500: BirA biotin-protein ligaz standart reaksiyon kitiAvidityBirA500Proteinleri biyotinillemek için kullanılacak
Biyotinillenmiş Hb I-EK  Protein katlanması için referans 6'ya bakın. Biyotinilasyon için BirA kiti
Biyotinillenmiş NPE-MCC I-EK  kullanın AnaspecÖzel NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K (Nvoc) -QATK-OH), Anaspec
Biotinylated & alpha'dan satın alınabilir; H2-Kk antikoruBD Biosciences553591
Biyotinillenmiş NPE-OVA H2-KbAnaspecÖzel NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) Anaspec
Biotinilated KAVY H2-Db AnaspecÖzel sentezlenmiş protein (KAVYDFATL), Anaspec
Biotinylated ICAM1 Protein katlanması için protokoldeki referansa bakın. Biyotinilasyon için BirA kiti kullanın
El tipi UV lambasıUVPUVGL-25Lamba numuneden < 1 cm uzakta tutulur.  Algılanabilir ölçüm için 30 sn 365 ışık, kantitatif ölçüm için 20 dakika yeterlidir.
Olympus IX-81 OMAC TIRF sistemi.OlympusGörüntüleme sistemi hakkında daha fazla bilgi Şekil 6
Mosaic dijital diyaframAndor
Slidebook yazılımındaGörüntüleme Yenilikleri
bulunabilir. Akıllı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311(2010).
  2. Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
  3. Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Photoactivatable Peptide MHCT Cell ActivationTotal Internal Reflection FluorescenceImmunological Synapse FormationPolarized SignalingTCR StimulationDAG AccumulationCentrosome ReorientationUV Light ActivationLive Cell Imaging

Related Articles