Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Özet

Asidik tümör microenvironment tümör ilerlemesinde önemli rol oynar. Kanser hücreleri in vitro olarak asidik ekstrasellüler pH etkilerini değerlendirmek için basit asidik kültür sistemleri kuruldu.

Özet

Hipoksi veya besin açlık gibi tümör microenvironment şartları kanser ilerlemesi ve malignite kritik rol oynarlar. Ancak, asidik ekstrasellüler pH tümör saldırganlık ve onun altında yatan mekanizma rol kapsamlı hipoksik veya besin açlık koşulları ile karşılaştırıldığında araştırılmamıştır. Buna ek olarak, asidik ekstraselüler tümör microenvironment taklit etmek için iyi tanımlanmış kültür yöntemi tam olarak bildirilmemiştir.

Burada asidik ekstrasellüler pH kullanarak bikarbonat ve artan laktat veya HCl konsantrasyonu kültür orta azaltılmış korumak için basit vitro kültür yöntemi mevcut. Orta pH en az 24 saat sürekli ve yavaş yavaş 72 kültür PANC-1 ve AsPC-1 pankreas kanseri hücrelerinin takip h tarafından azalmıştır. Bu çalışmada üç ayrı asidik ortam koşullarında son derece hipoksi ya da besin açlık. MSMO1, INSIG1ve IDI1 gibi upregulated pH-yanıt veren genler göre Bu genlerin upregulation asidik pH bir işareti olarak kullanılabilir. Bu basit teknikler asidik tümör microenvironment altında tümör malignite temel mekanizmaları aydınlatmak yararlıdır. Bu nedenle, hücre dışı asidik pH kültür sistemimiz hücresel asidik pH yanıt sadece kanser hücrelerinin zamanda kadar asidik diğer bozukluklar da dahil olmak üzere, Diyabetik ketoasidoz ile ilgili olarak renal tübüler hücreler gibi Primer hücre keşfi sağlar, Laktik asidoz, renal tübüler asidoz ve solunum asidozu.

Giriş

Tümör microenvironment tümör ilerleme ve kanser hücre metabolizması^1,2,3kritik rol oynar. Kanser hücreleri genellikle hipoksi, besin yoksunluğu ve asidik ekstrasellüler pH (pHe) gibi koşullara maruz kalır. Ancak, tümör ilerleme pHe rolü gibi kapsamlı açıklık olmuştur değil hipoksi veya besin açlık olduğu gibi. Tümör dokusunda pHe yaklaşık pH 6.8^4,5ulaşan asidik hale gelebilir. Asidik pH aerobik ve anaerobik glycolytic atılımı proton (H⁺) doğar ve laktat Proliferasyona kanser tarafından^5,6hücreler.

Son yıllarda yapılan çalışmalarda ortaya o asidik pHe kaynaklı Histon deasetilasyonu, yağ asidi oksidasyon ve ağır asidik ortamı^7,8,9,10adaptasyon için asidik organellerin ekzositozu. Ancak, mekanizmalar aracılığıyla hangi hücre dışı asitleştirme kanser davranış ve düzenleyiciler asidik pH tümör microenvironment içinde tam olarak tespit anahtar kimliğini etkiler. Ayrıca, çeşitli raporlar bikarbonat, Tris, borular ve HEPES tampon veya laktat ve HCl belirsiz konsantrasyonları kullanarak çeşitli asidik pH medya açıklanan, ancak kararlılığını ayarlanan orta ne de kapsamlı göstermek için birkaç rapor vardır: birkaç farklı asidik kültür media^7,8,9,10 karşılaştırılması

Anahtar düzenleyiciler ve kanser hücrelerinin hücre dışı asitleştirme bağlamında metabolik değişiklikler aydınlatmak için kurulan bir asidik pHe korumak için basit vitro kültür manken ve pHe kanser hücreleri¹¹' deki rolü inceledi. Bu yöntemi kullanarak, biz tutulan 37 ° c altında %5 6,8 pHe ile asidik bir kültür orta düşük bikarbonat konsantrasyonu kültür ortamı kullanarak CO₂. pH 7.4 normal olarak kullanılan ve orta kontrol. Orta pH en az 24 saat sürekli ve 72 h PANC-1 ve AsPC-1 pankreas kanseri hücre kültür sırasında yavaş yavaş azaldı. Gelişmiş Glikoliz sadece da laktat^7,8,9proton atılımı hızlandırır çünkü aynı zamanda asidoz laktat kaynaklı yerine laktat ekleme azaltarak tarafından taklit eden bir kültür yöntemi kurdu bikarbonat konsantrasyonu. Ayrıca, HCl kaynaklı asidik pHe orta asidik pH kültür ortamına hücresel yanıt bikarbonat azaltılmış bir konsantrasyon nedeniyle değildir olasılığını dışlamak için bize izin verir. Ayrıca, 6.4-7,4 farklı bikarbonat konsantrasyonu ile pH ile çeşitli medya kullanarak, biz ölçüde hücresel yanıt pHe efektleri değerlendirebilir.

Protokol

1. asidik kültür orta hazırlanması

1. Denetim (pH 7,4) hazırlanması ve düşük-pH (pH 6.8) kültür orta
   1. 4.75 g L-glutamin olmadan DMEM tozu 500 mL su içinde çözülür.
   2. 0,33 M NaHCO₃ çözüm basınç sıkı bir şişe hazırlayın.
      Dikkat: NaHCO₃ ısıtmalı ve termal olarak çürümüş CO₂ gaz yayar bu yana bir basınç sıkı şişe kullanmak önemlidir.
   3. Otoklav orta ve çözüm. Bu arabellekleri 25 ° C'ye soğutmak izin
   4. 200 mM L-glutamin, penisilin-streptomisin, 5 mL 5 mL ekleyin ve 50 mL fetal sığır serum DMEM 500 ml bikarbonat olmadan.
   5. Denetim (pH 7,4) orta için 0,33 M NaHCO₃ çözüm DMEM 100 mL bikarbonat olmadan başına 2,4 mL ekleyin. Düşük-pH (pH 6.8) orta için 0,33 M NaHCO₃ çözüm DMEM 100 mL bikarbonat olmadan başına 0.6 mL ekleyin.
   6. Altında %5, kuluçka 37 ° C'de 24 saat sonra orta pH kontrol CO₂.
      Not: NaHCO₃ çözüm miktarı kuluçka ve hava basıncı CO₂ içeriğe bağlı olarak farklı olabilir orta pH bağlı olarak ayarlanması gerekir. İdeal olarak, ilk kez, NaHCO₃ çözüm için DMEM eklemek için uygun miktarını belirlemek için çeşitli bikarbonat konsantrasyonu ile orta pH ölçmek daha iyi.
      1. Hemen CO₂ kuluçka kültür çanak çıkardıktan sonra kültür orta toplamak ve pH metre kullanarak pH ölçmek. Orta sıcaklık bir su banyosu kullanarak 37 ° C'de tutun. Orta pH bağımsız olarak üç kez ölçmek.
         Not: NaHCO₃ çözüm 4 ° C'de muhafaza edilmelidir ve her ortamın taze hazırlanmalıdır. Bu çalışmada kullanılan piyasada bulunan ürünler Malzemeler tabloiçinde listelenir.
2. Laktat kaynaklı veya HCl kaynaklı asidik kültür ortamı hazırlama
   1. 74 µL laktat çözüm veya 1 M HCL 125 µL denetim orta (1.1.5 adımda hazırlanan) 100 mL ekleyin.
   2. Altında %5, kuluçka 37 ° C'de 24 saat sonra orta pH kontrol CO₂.
      Not: Laktat veya HCl bir çözüm de kuluçka ve hava basınç CO₂ içeriğe bağlı olarak farklı olabilir orta pH göre ayarlanması gerekir. İdeal olarak, seri laktat veya HCl konsantrasyonu için ortamın pH istenen ayarlamak için uygun miktarını belirlemek ile orta pH ölçmek iyidir.

2. hasat ve hücreleri tedavi

1. Altında %5 CO₂ gerçekleştirmeden önce en az 1 hafta deneyler 37 ° C'de hücreler yetiştirilmesi başlatın.
   Not: Bu çalışmada kullanılan hücre hatları Malzemeler tabloiçinde listelenir.
2. % 70-90 confluency ulaştığınızda geçiş hücreleri. Hücreleri Konfluent olmak izin vermez. Orta 2-3 günde günlük ekimi sırasında değiştirin.
3. Hücreleri 5 mL PBS ekleyerek yıkayın. PBS Aspire edin ve 1 mL tripsin gibi ayırmayı enzim ekleyin.
4. Hücreleri yuvarlanır ve ayırmak başlamak kadar 37 ° C'de kuluçkaya.
5. 5 mL kültür orta de müstakil hücrelere ekleme ve enzim devre dışı bırakın. 15 mL tüp ve 300 x g. aspiratı süpernatant adlı 3 dk santrifüj hücre süspansiyon aktarmak ve kültür orta hücrelerle yeniden askıya alma.
6. Bir hemasitometre ve Trypan-mavi kullanarak canlı hücreleri saymak.
7. Tohum 5.0 x 10⁵ hücreleri/iyi bir 10 cm tabak orta 10 ml. 37 ° c altında %5 24 h için hücreleri kuluçkaya CO₂.
8. Kültür orta Aspire edin, 5 mL PBS hücrelerle yıkama ve 10 mL asidik kültür orta bölüm 1'de hazırlanan ekleyin. 37 ° c altında %5 24 h için hücreleri kuluçkaya CO₂.

3. RNA izolasyon

1. Kültür orta Aspire edin ve hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın. Hücrelerin RNA ayıklama reaktif ekleyerek bozabilir ( Malzemeleri tablolarıgörmek).
2. Çanak kısaca kazımak, RNA ayıklama reaktif bir pipet ile kaldırın ve RNA ayıklama reaktif/hücre 1,5 mL tüp lysate mevduat. 5 min için oda sıcaklığında bırakın.
3. 250 µL kloroform ekleyin ve 5 min için oda sıcaklığında yaklaşık 15 s. bırak ve ≥8, 000 x g 5 min için santrifüj tüpü şiddetle çalkalanır.
4. Bir pipet kullanarak sulu faz dikkatli bir şekilde çıkarın. Sulu faz bırak. Başka bir 1,5 mL tüp içinde yerleştirin.
5. Sulu faz 550 µL isopropanol ekleyin ve karışımı yavaşça. 5 dakika santrifüj (≥20, 000 x g) maksimum hızda süreyle oda sıcaklığında 4 ° C'de 20 dk için bırakın
6. İsopropanol dökün ve 1 mL % 75 etanol DEPC su tedavi ekleyin. Hafifçe karıştırın. 8000 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.
7. Etanol ve granül kurumasına izin pipet.
8. DEPC yaklaşık µL 15-25 (verim) bağlı olarak su RNA Pelet tedavi ekleyin. İyice karıştırın.
9. 260 OD ölçerek izole RNA konsantrasyonu ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak nm.

4. cDNA sentezi

1. PCR reaksiyon tüp içinde aşağıdaki parçaları birleştirmek: 5 µg toplam RNA, 1 µL Oligo dT (50 µM) veya astar karışımlarda (60 µM), 1 µL 10 mM dNTP ve 14 µL toplam hacmiyle nükleaz ücretsiz su.
2. Mix ve kısaca bir küçük benchtop santrifüj kullanarak bileşenlerini santrifüj kapasitesi (~ 5 s). 65 ° C'de 5 min için örnek RNA/astar denatüre Kısaca spin (~ 5 s) küçük bir benchtop kullanarak santrifüj kapasitesi ve örnek derhal en az 1 dk. için buz koymak.
3. Aşağıdaki bileşenleri ekleyin: 4 µL 5 ters transkripsiyon arabellek x, 1 µL transkriptaz (200 U/µL), 1 µL RNase inhibitörü (40 U/µL).
   Not: Piyasada kitleri örnekleri Malzemeler tablo gösterilir
4. Tüp, kap mix ve kısaca belirtilen içeriğini bir küçük benchtop santrifüj santrifüj kapasitesi (~ 5 s). 10 dk 50-55 ° C kombine tepki karisimin kuluçkaya.
5. Reaksiyon 10 dk 80 ° C'de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.

5. gerçek zamanlı PCR kullanarak asit duyarlı gen ekspresyonu ölçümü

1. Aşağıdaki bileşenler, 384-iyi tepki plaka birleştirmek: 1 µL şablon cDNA, 0,75 µL 10 N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine X 0.3 µL 50 µM ileri astar, 0.3 µL 50 µM ters astar, 1 µL Taq polimeraz, 2.5 µL 10 x Taq polimeraz arabellek, 2.5 µL 20 mM dNTP, 16.65 µL su.
   Not: Piyasada kitleri örneği Malzemeler tablogösterilmiştir. Astar listesi Tablo 1' de gösterilen. 96-iyi tepki plaka da bu adımda kullanılabilir. Diğer probları (örneğin, Taqman sonda) de kullanılabilir.
2. Deneme ve gerçek zamanlı PCR sistemi aşağıdaki PCR programa ayarlayın: 50 ° C için 2 dk, 1 döngüsü; 10 dk, 1 döngüsü için 95 ° C; 95 ° C 15 s ve 60 ° C için 1 dakika, 40 döngüleri; 95 ° C 15 s, 1 döngüsü; 60 ° C 15 s, 1 döngüsü; 95 ° C 15 s, 1 döngüsü.
3. Yer plaka qPCR alet. Programı başlatın.
   Not: pH duyarlı genlerin MSMO1Upregulation, INSIG1ve IDI1 tarafından protein düzeyleri ölçülebilir.

Sonuçlar

Uygun bikarbonat konsantrasyonu belirlemek için DMEM aralığı 0 - 8 mM NaHCO₃ (kültür orta son konsantrasyonu) hazırlanmış ve 6.4-7.4 (şekil 1) arasında değişen pH ile Kültür medya hazırlanmasında başarılı oldu. DMEM ile 8 mM NaHCO₃ (pH 7,4) olarak bir denetim orta ve asidik pH ile 2 mM NaHCO₃ (pH 6.8) bir ortam olarak ekstrasellüler pH pH 6.8 solid tümör^4,5için ulaşır ...

Tartışma

Burada, bir basit asidik pH kültür sistemi ve değerlendirme sürecinin açıklanan. Orta asitleştirme, Yani, düşük bikarbonat konsantrasyonu, laktat ek ve HCl ek olarak, üç yöntemlerin bileşimini pH-yanıtlama mekanizması iyice araştırmak ve hücresel yanıt diğer tümör olarak karşılaştırmak için bize etkin hipoksi veya besin açlık gibi microenvironmental koşulları.

Bu yöntem, kültür orta uygun konsantrasyonlarda bikarbonat, laktat ve HCl belirlemek için anahtardır. Bu yöntem ilk kez gerçek...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktifler
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı" Nissui" 2	Nissui	05919
Fetal Sığır Serumu	Thermo Fisher	10438
NaHCO3	Wako	191-01305
L-glutamin çözeltisi	Thermo Fisher	25030-081
Penisilin-Streptomisin Karışık Çözelti (Stabilize)	Nacalai	09367-34
0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Çözeltisi, Fenol Kırmızısı ile	Nacalai	32778-05
%0.5-Tripan Mavi Leke Çözeltisi	Nacalai	29853-34
Laktik asit çözeltisi	Sigma-Aldrich	252476
Hidroklorik asit çözeltisi	Sigma-Aldrich	H9892
RNeasy Plus Mini Kit	QIAGEN	74134
SuperScript IV Birinci İplikli Sentez Sistemi	Thermo Fisher	18091
Güç SYBR Yeşil PCR Master Karışımı	Uygulamalı Biyosistemler	4368702
Adı< / strong>	Company< / strong>	Katalog Numarası< / strong>	Comments< / strong>
Hücre hatları< / strong>
PANC-1	ATCC	CRL-1469
ASPC-1	ATCC	CRL-1682
KMS-6	JCRB Hücre Bankası
TIG	JCRB Hücre Bankası
MRC9	ATCC	CCL-212
HUVEC	ATCC	CRL-1730
Name<	strong>Company	Katalog Numarası	Yorumlar
Equipment Thermo Fisher ND-ONE-W QuantStudio 5 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi Thermo Fisher CRL-1682 ile güçlü >
NanoDrop Bir Mikro Hacimli UV-Vis Spektrofotometresi

JCRB0432