Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Özet

Asidik tümör microenvironment tümör ilerlemesinde önemli rol oynar. Kanser hücreleri in vitro olarak asidik ekstrasellüler pH etkilerini değerlendirmek için basit asidik kültür sistemleri kuruldu.

Özet

Hipoksi veya besin açlık gibi tümör microenvironment şartları kanser ilerlemesi ve malignite kritik rol oynarlar. Ancak, asidik ekstrasellüler pH tümör saldırganlık ve onun altında yatan mekanizma rol kapsamlı hipoksik veya besin açlık koşulları ile karşılaştırıldığında araştırılmamıştır. Buna ek olarak, asidik ekstraselüler tümör microenvironment taklit etmek için iyi tanımlanmış kültür yöntemi tam olarak bildirilmemiştir.

Burada asidik ekstrasellüler pH kullanarak bikarbonat ve artan laktat veya HCl konsantrasyonu kültür orta azaltılmış korumak için basit vitro kültür yöntemi mevcut. Orta pH en az 24 saat sürekli ve yavaş yavaş 72 kültür PANC-1 ve AsPC-1 pankreas kanseri hücrelerinin takip h tarafından azalmıştır. Bu çalışmada üç ayrı asidik ortam koşullarında son derece hipoksi ya da besin açlık. MSMO1, INSIG1ve IDI1 gibi upregulated pH-yanıt veren genler göre Bu genlerin upregulation asidik pH bir işareti olarak kullanılabilir. Bu basit teknikler asidik tümör microenvironment altında tümör malignite temel mekanizmaları aydınlatmak yararlıdır. Bu nedenle, hücre dışı asidik pH kültür sistemimiz hücresel asidik pH yanıt sadece kanser hücrelerinin zamanda kadar asidik diğer bozukluklar da dahil olmak üzere, Diyabetik ketoasidoz ile ilgili olarak renal tübüler hücreler gibi Primer hücre keşfi sağlar, Laktik asidoz, renal tübüler asidoz ve solunum asidozu.

Giriş

Tümör microenvironment tümör ilerleme ve kanser hücre metabolizması^1,2,3kritik rol oynar. Kanser hücreleri genellikle hipoksi, besin yoksunluğu ve asidik ekstrasellüler pH (pHe) gibi koşullara maruz kalır. Ancak, tümör ilerleme pHe rolü gibi kapsamlı açıklık olmuştur değil hipoksi veya besin açlık olduğu gibi. Tümör dokusunda pHe yaklaşık pH 6.8^4,5ulaşan asidik hale gelebilir. Asidik pH aerobik ve anaerobik glycolytic atılımı proton (H⁺) doğar ve laktat Proliferasyona kanser tarafından⁵

Protokol

1. asidik kültür orta hazırlanması

1. Denetim (pH 7,4) hazırlanması ve düşük-pH (pH 6.8) kültür orta
   1. 4.75 g L-glutamin olmadan DMEM tozu 500 mL su içinde çözülür.
   2. 0,33 M NaHCO₃ çözüm basınç sıkı bir şişe hazırlayın.
      Dikkat: NaHCO₃ ısıtmalı ve termal olarak çürümüş CO₂ gaz yayar bu yana bir basınç sıkı şişe kullanmak önemlidir.
   3. Otoklav orta ve çözüm. Bu arabellekleri 25 ° C'ye soğutmak izin
   4. 200 mM L-glutamin, penisilin-streptomisin, 5 mL 5 mL ekleyin ve 50 mL fetal sığır serum DMEM 500 ml bikarbonat olmadan.
   5. Denetim (pH 7,4) orta için 0,33 M NaHCO₃

Sonuçlar

Uygun bikarbonat konsantrasyonu belirlemek için DMEM aralığı 0 - 8 mM NaHCO₃ (kültür orta son konsantrasyonu) hazırlanmış ve 6.4-7.4 (şekil 1) arasında değişen pH ile Kültür medya hazırlanmasında başarılı oldu. DMEM ile 8 mM NaHCO₃ (pH 7,4) olarak bir denetim orta ve asidik pH ile 2 mM NaHCO₃ (pH 6.8) bir ortam olarak ekstrasellüler pH pH 6.8 solid tümör^4,5için ulaşır .......

Tartışma

Burada, bir basit asidik pH kültür sistemi ve değerlendirme sürecinin açıklanan. Orta asitleştirme, Yani, düşük bikarbonat konsantrasyonu, laktat ek ve HCl ek olarak, üç yöntemlerin bileşimini pH-yanıtlama mekanizması iyice araştırmak ve hücresel yanıt diğer tümör olarak karşılaştırmak için bize etkin hipoksi veya besin açlık gibi microenvironmental koşulları.

Bu yöntem, kültür orta uygun konsantrasyonlarda bikarbonat, laktat ve HCl belirlemek için anahtardır. Bu yöntem ilk kez gerçek.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktifler
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı" Nissui" 2	Nissui	05919
Fetal Sığır Serumu	Thermo Fisher	10438
NaHCO3	Wako	191-01305
L-glutamin çözeltisi	Thermo Fisher	25030-081
Penisilin-Streptomisin Karışık Çözelti (Stabilize)	Nacalai	09367-34
0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Çözeltisi, Fenol Kırmızısı ile	Nacalai	32778-05
%0.5-Tripan Mavi Leke Çözeltisi	Nacalai	29853-34
Laktik asit çözeltisi	Sigma-Aldrich	252476
Hidroklorik asit çözeltisi	Sigma-Aldrich	H9892
RNeasy Plus Mini Kit	QIAGEN	74134
SuperScript IV Birinci İplikli Sentez Sistemi	Thermo Fisher	18091
Güç SYBR Yeşil PCR Master Karışımı	Uygulamalı Biyosistemler	4368702
Adı< / strong>	Company< / strong>	Katalog Numarası< / strong>	Comments< / strong>
Hücre hatları< / strong>
PANC-1	ATCC	CRL-1469
ASPC-1	ATCC	CRL-1682
KMS-6	JCRB Hücre Bankası
TIG	JCRB Hücre Bankası
MRC9	ATCC	CCL-212
HUVEC	ATCC	CRL-1730
Name<	strong>Company	Katalog Numarası	Yorumlar
Equipment Thermo Fisher ND-ONE-W QuantStudio 5 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi Thermo Fisher CRL-1682 ile güçlü >
NanoDrop Bir Mikro Hacimli UV-Vis Spektrofotometresi

JCRB0432