Yöntem makalesi

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

17.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56662

⸱

13 Aralık 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of East Anglia, 2Norwich Medical School, University of East Anglia

Bu makalede

Özet

Biz iletişim kuralları izolasyon-in vivo dokusundan bağırsak 3D yapılar için mevcut ve organoids ve detay farklı fiksasyon ve protokolleri IMMUNO-etiketleme için Mikrotubul, en iyi duruma getirilmiş boyama vitro Bodrum matris gömülü, centrosomal ve bileske proteinler de gibi hücre kök hücre proteini Lgr5 de dahil olmak üzere işaretler.

Özet

Vivo doku mimarisi ve morfogenetik taklit 3D vitro organoids gelişiyle hücre ve gelişim biyolojisi anahtar biyolojik sorular çalışma yeteneği büyük ölçüde ilerlemiştir. Buna ek olarak, organoids ile birlikte son teknik gelişmeler gen düzenleme ve viral gen teslim tıbbi araştırma ve geliştirme hastalıklarının tedavisi için yeni ilaçların ilerlemek vaat ediyor. Vitro Bodrum matris yetiştirilen Organoids çeşitli proteinlerin işlevini ve davranış eğitimi için güçlü model sistemleri sağlar ve canlı görüntüleme için floresan öğesini proteinlerin uygundur. Ancak, ifade ve yerelleştirme endojen proteinlerin kurulması ex vivo doku ve vitro organoids tagged proteinlerin davranışını doğrulamanız önemlidir. Bu amaçla biz geliştirdik ve doku yalıtım, fiksasyon ve immün etiketleme iletişim kurallarını mikrotübüller, centrosomal ve ilişkili proteinler ex vivo bağırsak dokusu ve vitro bağırsak organoids lokalizasyonu için değiştirildi. Ayrıca antikor antigenicity koruyarak ve iyi penetrasyon ve izni sabitleştirici ve antikorlar etkinleştirme sırasında organoids/doku 3D mimari korumak sabitleştirici amaç içindi. Tüm istikrarlı mikrotübüller soğuk maruz depolymerizes ve bu çeşitli protokoller değiştirirken önemli bir faktör oldu. Biz 3 mM EDTA kolon kriptalarının için yeterli iken ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) konsantrasyonu 3 mm 30 mM için artan villus ve ince bağırsak kriptalarının verimli dekolmanı verdi bulundu. Gelişmiş formaldehit/metanol fiksasyon protokolü de antigenicity etkili etiketleme mikrotübüller, aktin ve bitiş (EB) proteinler için koruma sırasında çok iyi Yapısal koruma verdi. Metanol Protokolü daha tutarlı bir şekilde çalıştı, ancak aynı zamanda centrosomal protein ninein için çalıştı. Daha fazla gelen izole veya Bodrum matris içinde kalan organoids ile fiksasyon ve IMMUNO-etiketleme mikrotübüller ve ilişkili proteinler elde edilebilir kurduk.

Giriş

Epiteli ile apico Bazal polarite oluşumu geliştirmede temel bir süreçtir ve mikrotübüller ve centrosomal proteinlerinin dramatik bir yeniden yapılanma içerir. Merkezi bir konumda bulunan bir centrosomal Mikrotubul Merkezi düzenleme yayılan (MTOC) birçok hayvan hücrelerinde belirgin ve bu nispeten düz hücreler için de uygun bir Radyal Mikrotubul dizi. Buna ek olarak, bu bağırsak gibi yassı epitel hücreleri daha iyi şekil ve bu hücrelerin özel işlevlerini destek olmayan Radyal transcellular Mikrotubul diziler topla. Bu dramatik yeniden düzenleme-in mikrotübüller transcellular mikrotübüller1,2 anchorage için sorumlu olur centrosome tepe ve şekillendirme, apikal centrosomal MTOCs (n-MTOCs) hareket elde edilir , 3 , 4 , 5.

Epitel farklılaşma ve ilişkili Mikrotubul yeniden yapılanma ile ilgili bilgilerimizi çoğunu yapmak değil göstermek içinde vivo doku mimari 2D vitro hücre katmanları araştırmalar geldi. Taklit ediyorlar vivo içinde mimari ve geliştirme gibi geliştirme Clevers ve iş arkadaşları6tarafından öncülük 3D vitro organoid kültürlerin büyük bir teknolojik ilerleme temsil eder. Epitel farklılaşma hiyerarşisini bağırsaklarda belirgindir; kök hücre alt kriptalarının olgunlaşmamış transit çoğalırlar ve nereye onlar tamamen önce ayrıştırılan haline crypt küçük bağırsak villus veya kolon yüzey üzerine kadar göç gibi yavaş yavaş ayırt hücreleri yükseltecek ortaya çıkmasına Lümen7dökmek. Önemlisi, bu bağırsak organoids nerede kök hücre niş hücrelerden daha sonra alt ve kist bölge doğru yavaş yavaş ilerliyor farklılaşma kök hücreleriyle crypt benzeri tomurcukları oluşturmak şekillendirme kistler prolifere olarak çoğaltılır, hangi villus benzeri8olur. Bağırsak organoid, bu nedenle sadece Mikrotubul ve epitel farklılaşma ama çok sayıda diğer proteinler yanı sıra ilaç ve gıda ile taranması için ideal bir platform sağlayan sırasında centrosomal yeniden yapılanma çalışması için güçlü bir modelini temsil bileşikler potansiyel terapötik yararları9,10.

Organoids canlı görüntüleme için floresan öğesini proteinlerin uygundur ve her ikisi de Tak- ve knock-out organoids CRISPR/Cas9 gen11,12düzenleme kullanarak oluşturulabilir. Ancak, ifade ve yerelleştirme belirlenmesi için endojen proteinlerin kurulması özellikle tagged proteinler davranışını doğrulamak önemlidir. 3D organoids IMMUNO-etiketleme Bodrum matris veya izole ex vivo yetiştirilen kültür yemekleri 2D yetiştirilen hücrelerin daha karmaşık dokudur. Fiksasyon iletişim kuralı hala antikor antigenicity (Yani, antikorlar bağlama epitopları) koruyarak organoids hassas 3D mimari korumak gerekiyor. Örneğin, % 4 paraformaldehyde (PFA) genellikle bir sabitleştirici kullanılır ama nispeten hızlı oyunculuk sabitleştirici ve iyi morfolojik koruma verir iken, bizim deneyim sık antigenicity kaybolmasına ve çoğu için uygun değildir centrosomal antikor. 3D yapılar ve doku nüfuz yeteneği sabitleştirici ve antikorlar da düşünülmelidir. Bu amaçla, biz değiştirdiniz ve doku yalıtım ve dolaylı IMMUNO-3D vitro organoids ve ex vivo etiketleme için gelişmiş protokoller bağırsak dokusu izole. Biz küçük bağırsak kriptalarının ve villus ve kolon doku izole etmek ve 3D organoids yalıtım sabitleme ve IMMUNO-etiketleme Bodrum matris içinde alternatif olarak için bir iletişim kuralı eklemek nasıl açıklar. Biz üç alternatif fiksasyon Protokolü IMMUNO mikrotübüller ve centrosomal proteinler, ninein gibi ve Mikrotubul artı uç izleme proteinler (+ ipuçları), (Ayrıca başvurular8, bkz: EB proteinler ve CLIP-170 gibi etiketleme için mevcut 13). Biz de artılarını ve eksilerini her iletişim kuralıyla ilişkili tartışıyorlar.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada East Anglia Üniversitesi'nın kurumsal lisans kurallarına göre yapıldı.

1. yalıtım bağırsak dokusu

  1. IMMUNO-etiketleme için kolon kriptalarının yalıtım ( şekil 1, şematik bkz.)
    1. Ötenazi fare (CO2 boğulma kullanılarak) ve (caecum başlangıç ve caudally ayıklanması) iki nokta üst üste çıkarmak makas ve cımbız14diseksiyon ile.
    2. Cam pipet ile lastik ampul kullanarak fosfat tamponlu tuz (PBS) ile kolon içeriğini boşaltır. PBS: Sodyum Klorür (8.0 g/M), Potasyum klorür (0.2 g/M), disodyum hidrojen fosfat (1.15 g/L) ve potasyum dihydrogen fosfat (0.2 g/L), pH 7.3.
    3. Metal çubuk (2.4 mm çap) veya cam pipet sonuna kullanarak, kolon tüp bir ucunu yavaşça doku epitel şimdi dışarıda olması böylece kolon doku everting çubuk/pipet üzerinde Kayan süre tutun.
      Not: Bu mümkün değilse o zaman iki nokta üst üste makas ve dilim ile 5 mm parçalar halinde açın.
    4. Diplidir kolon veya parçaları bir 50 mL konik tüp PBS 40 mL içeren aktarın.
    5. Tüp birkaç kez daha kaldır bağırsak içeriği, mukus, vb ters çevir
    6. 15 dakika (RT) oda sıcaklığında kuluçkaya ve kolon/adet 3 mm EDTA PBS içinde 40 mL transfer.
      Not: PBS ile 0,5 M EDTA pH 8.0 stok sulandırmak.
    7. Balgam çıkarmak ve kolon/adet 3 mm EDTA PBS içinde taze 40 mL içeren bir 50 mL konik tüp transfer için sallayın. Dik, 35 dk. için kuluçkaya
    8. 30 için şiddetle çalkalanır ve kolon/adet PBS 10 mL 50 mL konik tüp içinde transfer s kriptalarının (crypt kesir) serbest bırakmak için.
    9. Kolon/adet tüp sizden çıkarın ve daha fazla yalıtım gerekli olması durumunda geri 3 mM EDTA yerleştirin. 300 x g 5 min için de kalan crypt kesir santrifüj kapasitesi.
    10. 5 mL süpernatant de kaldırın ve crypt Pelet kalan 5 mL hacminde resuspend.
    11. Kolon kriptalarının varlığını denetlemek için zoom (50-100 X büyütme) ile bir stereomicroscope altında gözlemlemek.
      Not: Eğer hiçbir kriptalarının mevcut kolon/adet 3 mm EDTA PBS içinde başka bir 30 dk için kuluçkaya ve adımları 1.1.8 - 1.1.11 yineleyin.
    12. 300 x g 5 min için de crypt kesir santrifüj kapasitesi.
    13. Crypt Pelet elde edilir ve hemen fiksasyon (Bölüm 3) devam tüm süpernatant kaldırın.
  2. Küçük bağırsak kriptalarının ve villus IMMUNO-etiketleme için yalıtım (Şekil 2)
    1. (CO2 boğulma kullanarak) fare ötenazi ve makas ve cımbız14diseksiyon ile ince bağırsak (terminal ileum için proksimal oniki parmak bağırsağı) kaldırın.
      Not: için görünümü farklı bölümler küçük bağırsak sonra bu aşamada ayırmak ve ayrı ayrı tedavi. Bkz: şekil 1 ve Tablo 1 için bir akış diyagramı ve zamanlara.
    2. Cam pipet ile lastik ampul kullanarak PBS ile ince bağırsak içeriğini floş.
    3. İnce bağırsak diseksiyon makasla kesip ve 15 mL PBS Petri kabına yerleştirin.
    4. Yavaşça bağırsak Mukozal yüzeyin zarar değil iken luminal içeriği kaldırmak için PBS yıkayın. Doku için taze Petri kabına aktarın ve PBS yıkama yineleyin.
    5. Bağırsak 3-5 mm parçalar halinde kesilmiş ve 100 mm 30 mM EDTA PBS içinde 15 mL içeren Petri kabına aktarın ve RT. alternatif olarak, 5 min kuluçkaya için PBS 3 mM EDTA içinde 30 dk için kuluçkaya.
    6. Kesir 1 (villus yalıtım): PBS 10 mL 50 mL konik tüp, shake şiddetle için 10 s ve 100 mm Petri kabına içine dökün içine bağırsak adet Transfer. Kesir bir stereomicroscope altında izole villus için kontrol edin. Bu aşamada, çoğunlukla villus bulunması gereken ama bu izolasyonların arasında değişebilir.
      Not: izole villus/kriptalarının önlemek için plastik, Petri yemekler ve koleksiyon tüpleri için yapışmasını Fetal sığır Serum (FBS) ile önceden kaplanmış olmalıdır. FBS yemekleri ve/veya tüpler dökün ve hemen çıkarın. Her kısmı için zamanlama rehberleri bkz. Tablo 1 .
    7. Bağırsak adet 30 mM EDTA PBS içinde içine geri aktarmak ve 5 min için kuluçkaya. Bu kuluçka sırasında kesir 1 15 mL konik tüp (FBS ile precoated) ve 5 min için 300 x g, santrifüj toplamak.
    8. Kesir 2: bağırsak adet 50 mL konik tüp PBS, shake şiddetle 20 s ve sonra dökmek için 10 mL içeren bir 100 mm Petri kabına aktarın. Kesir mikroskop altında kontrol edin. Genellikle, bu aşamada villus ve kriptalarının karışık bir kültür (şekil 2A) mevcut olan.
    9. Bağırsak adet 30 mM EDTA PBS içinde içine geri aktarmak ve bir daha da 5 min için kuluçkaya. 5 dk. süpernatant kesirler 1 ve 2 Pelet bozmadan kaldırmak ve hemen fiksasyon (Adım 3) devam etmek için bu kuluçka sırasında 300 x g kesir 2 (FBS ile precoated) 15 mL konik tüp içinde cips.
    10. Kesir 3 (Crypt yalıtım): PBS 10 mL 50 mL tüp, sallamak için 20 s ve 100 mm Petri kabına içine dökün içine bağırsak adet Transfer. Kesir mikroskop altında kontrol edin. Bu aşamada, kesir ağırlıklı olarak kriptalarının (şekil 2B) içerir.
    11. Kesir 4: bağırsak adet 10 mL PBS, sallamak için 20 s ve 100 mm Petri kabına içine dökün içine aktarın. Kesir mikroskop altında kontrol edin. Bu aşamada sadece kriptalarının bulunması gerekir.
    12. Kesir 5: bağırsak adet 10 mL PBS, sallamak için 20 s ve 100 mm Petri kabına içine dökün içine aktarın. Kesir mikroskop altında kontrol edin. Genellikle, bu aşamada çok az kriptalarının ayıklanır. Birkaç kriptalarının ayıkladıysanız, sonra 6inci kesir ile devam edin.
      Not: saf crypt nüfus (örneğin, organoid üretimi için) isterseniz, o zaman bir 70 µm hücre süzgeç olduğu gibi herhangi bir villus crypt zenginleştirilmiş kesir kaldırmak için kullanın.
    13. Kesirler 3-5 ayrı 15 mL konik boru ve 5 min için 300 x g, santrifüj toplamak.
    14. Kesirler 3 - 5 granül kontrol ve supernatants granül bozmadan kaldırmak ve hemen fiksasyon (Bölüm 3) devam edin.

2.Bodrum matris kubbeler 24-şey tabak içinde gelen bağırsak Organoids izolasyonu

Not: Organoids Bodrum matris kubbe içinde oluşumu oldu başka bir bölümünde12.

  1. Wells ile Bodrum matris kubbe üreticinin talimatlarına göre kat.
  2. Bodrum matris kubbe ile PBS 500 µL içeren yıkama wells.
  3. Her şey için hücre kurtarma çözümü (4 ° C) soğuk 250 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).
    Not: Tüm ama istikrarlı mikrotübüller soğuk hücre kurtarma çözümü depolymerize.
  4. P1000 micropipette kullanarak Bodrum matris kubbeler raspa ve dikkatlice yukarı ve aşağı ayrılık kuyuya boyunca pipet ve Bodrum matris plastikten kaldırın.
  5. Süpernatant 1,5 mL düşük bağlama microcentrifuge tüpler toplamak.
  6. 1.5 mL düşük bağlama tüp birkaç kez ters çevir ve mikroskop altında olup organoids izole edilmiştir ve taşıma ücretsizdir ve kümeleri içinde değil kontrol edin. Bir stereomicroscope altında tüp ve görünüm düşük (50 X) büyütme altında tutun.
  7. Santrifüjü RT., 5 min için 1000 x g de tarafından organoids cips
  8. Kurtarma reaktif kaldırmak ve hemen fiksasyon (Adım 3) devam edin.

3. izole bağırsak dokusu ve Organoids fiksasyonu

  1. Metanol fiksasyon
    1. İzole bağırsak crypt/villus kesir 10 ml ve 1 ml metanol organoids-20 ° C'de resuspend
    2. Kriptalarının/villus/organoids-20 ° C'de 15 dakika bir dondurucuda kuluçkaya ve tüpler her 5 dk tersine çevirin.
    3. Santrifüjü 1000 x g 5 min için de tarafından kriptalarının/villus/organoids cips.
    4. Metanol kaldırın ve yıkama çözüm (1 mL organoids ve izole crypt/villus kesirler için 10 mL) ekleyin. Yıkama çözüm de PBS % 1 serum veya PBS ile % 0,1 deterjan ve % 1 serum ile oluşabilir.
      Not: serum aynı türlerden Bu ikincil antikor olarak kullanın. Örneğin, ikincil antikorlar keçi oluşturursa keçi serum kullanın.
    5. Hemen, kriptalarının/villus/organoids cips 5 min için 1000 x g, santrifüj kapasitesi.
    6. Yıkama çözüm kaldırın ve temiz çamaşır çözümde kriptalarının/villus/organoids resuspend.
    7. Bir tüp rotator 20 rpm için ayarlanan hızıyla birlikte koyun. Hücreleri her 15 dk aralıklarla (5 min için 1000 x g) tarafından kriptalarının/villus/organoids peletleme ve yıkama çözüm yerine 1s, toplam yıkayın.
      Not: bir tüp rotator kullanılamıyorsa, sonra tüpler el ile her 5 dk izole kültürlerin resuspend için tersine çevirin.
  2. Formaldehit/metanol fiksasyon
    Not: Fiksajlar ve duman başlıklı formaldehit kullanın.
    1. İzole kriptalarının/villus 10 ml veya 1 mL-20 ° C sabitleştirici çözeltisi (formaldehit çözüm 800 µL ile metanol 9.2 mL) içinde organoids resuspend.
    2. -20 ° C'de 15 dakika bir dondurucuda kriptalarının/villus/organoids düzeltmek ve tüp her 5 dk tersine çevirin.
    3. Santrifüjü 1000 x g 5 min için de tarafından kriptalarının/villus/organoids cips.
    4. Formaldehit/metanol kaldırın ve yıkama çözüm (1 mL organoids için ya da izole kriptalarının/villus kesirler için 10 mL) ekleyin. Yıkama çözüm de PBS % 1 keçi serum veya PBS ile % 0,1 deterjan ve % 1 serum ile oluşabilir.
    5. 1000 x g kriptalarının/villus/organoids cips 5 min için de santrifüj kapasitesi.
    6. Yıkama çözüm kaldırın ve temiz çamaşır çözümde resuspend.
    7. Bir tüp rotator 20 rpm için ayarlanan hızıyla birlikte koyun. Hücreleri her 15 dk aralıklarla (5 min için 1000 x g) tarafından kriptalarının/villus/organoids peletleme ve yıkama çözüm yerine 1s, toplam yıkayın.
  3. İngiltere'de yılın fiksasyon
    Dikkat: PFA toz ve çözümleri bir duman mahallede ele alınmalıdır.
    Not: çoğu durumlarda %4 oranında PBS PFA kullanılır ancak antikor antigenicity korunması bağlı olarak, düşük konsantrasyonlarda kullanılabilir.
    1. İzole pelleted kriptalarının/villus 10 mL %4 oranında resuspend İngiltere'de yılın RT 1 h için kuluçkaya ve izole organoids 1 ml % 4 pelleted PFA ve 30 dk için kuluçkaya. Her iki durumda da her 10 min tüpler tersine çevirin.
    2. Santrifüjü 1000 x g 5 min için de tarafından kriptalarının/villus/organoids cips.
    3. PFA kaldırın ve yıkama çözüm (1 mL organoids ve izole kriptalarının/villus için 10 mL) ekleyin. Yıkama çözüm PBS % 0,1 deterjan ve % 1 serum ile oluşur.
    4. 1000 x g kriptalarının/villus/organoids cips 5 min için de santrifüj kapasitesi.
    5. Yıkama çözüm kaldırın ve temiz çamaşır çözümde resuspend.
    6. Bir tüp rotator hız 20 rpm ayarla yerleştirin. Hücreleri her 15 dk aralıklarla (5 min için 1000 x g) tarafından kriptalarının/villus/organoids peletleme ve yıkama çözüm yerine 1s, toplam yıkayın.
      Not: bir tüp rotator kullanılamıyorsa, sonra tüpler el ile her 5 dk izole kültürlerin resuspend için tersine çevirin.
    7. Antijen alma (isteğe bağlı adım PFA fiksasyon için önerilir)
      1. Santrifüjü 1000 x g 5 min için de tarafından kriptalarının/villus/organoids cips ve süpernatant kaldırın.
      2. 1-10 mL 10 mM sodyum sitrat pH (80 ° C için önceden ısındı) 6.0 ekleyin ve 20 dk 80 ° C'de kuluçkaya.
      3. Santrifüjü 1000 x g 5 min için de tarafından kriptalarının/villus/organoids cips ve süpernatant kaldırın.
      4. 1-10 mL taze 10 mM sodyum sitrat pH 6.0 (80 ° C için önceden ısındı) ekleyin ve RT 20 dk için kuluçkaya.
      5. Santrifüjü 1000 x g 5 min için de tarafından kriptalarının/villus/organoids cips ve süpernatant kaldırın.
      6. 1-10 mL PBS % 1 serum ile yıkayın ve bir daha da 3 kez kriptalarının/villus/organoids aralıklarla (5 min için 1000 x g) tarafından taze yıkama çözüm eklemeden önce peletleme tekrarlayın.

4. adım engelleme

  1. Engelleme çözüm olun: PBS içinde % 10 ikincil antikor türler serum Ekle (isteğe bağlı: % 0,1 deterjan ekleyin).
  2. Santrifüjü (5 min için 1000 x g) tarafından kriptalarının/villus/organoids cips ve süpernatant kaldırın.
  3. Engelleme çözüm gerekli örnek sayısına bağlı olarak 5-10 mL ekleyin (aşağıdaki nota bakın). Bu aşamada kriptalarının/villus/organoids çözüm bireysel tüpler (1,5 mL düşük bağlama microcentrifuge tüpler 0,2 - 1 mL içeren her tüp ile) ile farklı antikor boyama için ayrılmıştır.
    Not: Her izole kriptalarının/villus kesir farklı etiketleme kombinasyonları Pelet için boyutuna bağlı olarak kullanılan 5-10 örnekler arasındaki verecektir. İdeal olarak, 2-4 mm arasında bir Pelet boyutu her örnek için gereklidir.
Farklı kesirler kriptalarının bu aşamada kombine edilebilir ve villus olabilir kolayca tespit (Şekil 2).
  • RT bir çözüm üzerinde bir tüp rotator 1 h için engelleme kuluçkaya.

    • 5. birincil antikor kuluçka

    1. (Bkz: Malzemeler tablo) birincil antikorlar % 10 serum ve % 0.1 deterjan içeren PBS içinde sulandırmak. 100-200 µL arasında birincil antikor çözüm microcentrifuge tüp örnek gereklidir.
    2. Engelleme çözüm Santrifüjü (1000 x g 5 min için) çıkarın.
    3. Birincil antikor çözümde kriptalarının/villus/organoid Pelet resuspend ve gecede kriptalarının/villus/organoids süspansiyon tutmak için bir tüp rotator (20 devir/dakika) kullanarak 4 ° C'de kuluçkaya.
    4. Ertesi gün: örnekleri tüp rotator (20 devir/dakika) 1 h için RT geri getir.
    5. Santrifüjü (5 min için 1000 x g) tarafından örnek cips ve birincil antikor çözüm kaldırın.
    6. Çözüm yıkama 1 mL ekleyin ve yeraltı türbesi/villus/organoid granül resuspend.
    7. Hemen çözüm Santrifüjü (1000 x g 5 min için) çıkarın.
    8. 1 mL taze yıkama çözüm ekleyin ve bir tüp rotator (20 devir/dakika) hücrelerdeyse 2 saat boyunca spin. Santrifüjü adım 5.7 olduğu gibi her 30 dakikada yıkama çözüm değiştirmek.

    6. ikincil antikor kuluçka

    1. (Bkz. Tablo reçetesi) ikincil antikor PBS % 10 arasında olan deterjan serum ve % 0.1 oranında seyreltin. Microcentrifuge tüp örnek yaklaşık 200 µL ikincil antikor çözümün gereklidir.
      Not: Son derece çapraz absorbe antikorlar reaktivite fare crypt/villus/organoid ikincil antikorların azaltmak için kullanılır.
    2. 1000 x g kriptalarının/villus/organoids cips ve granül ikincil antikor çözüm 200 µL içinde resuspend 5 min için de santrifüj kapasitesi.
    3. Bir tüp rotator (20 devir/dakika) RT 1 h için üzerine boruları spin.
    4. 1000 x g kriptalarının/villus/organoids cips ve supernatants (olmayan bağlı ikincil antikorlar) kaldırmak 5 min için de santrifüj kapasitesi.
    5. Pelet yıkama çözüm resuspend ve hemen 1000 x g kriptalarının/villus/organoids cips 5 min için de santrifüj kapasitesi.
    6. Süpernatant kaldırmak ve Pelet 1 mL taze yıkama çözeltisi resuspend.
    7. Bir tüp rotator (20 devir/dakika) RT 1.5-2 h, yıkama çözüm her 20-30 dk daha önce 6.3-6,6 adımlarda açıklandığı gibi değiştirme için spin.

    7. nükleer leke

    1. Nükleer leke yıkama çözüm (başı olarak üreticinin iletişim kuralı), DAPI veya Höchst gibi sulandırmak. Örneğin: DAPI hisse senedi (20 mg/mL) çözümdür seyreltilmiş 1:10, 000. Hisse senedi çözüm aliquots-20 ° C'de muhafaza
    2. 1000 x g kriptalarının/villus/organoids cips ve yıkama çözüm kaldırmak 5 min için de santrifüj kapasitesi.
    3. Pelet nükleer counterstain çözüm resuspend.
    4. Bir tüp rotator (20 devir/dakika) RT 10 min için spin.
    5. 1000 x g kriptalarının/villus/organoids cips, nükleer leke çözümü kaldırmak ve Pelet yıkama çözümde resuspend 5 min için de santrifüj kapasitesi.
    6. Bir tüp rotator (20 devir/dakika) RT 30-60 dk, yıkama çözüm her 10 min değiştirme için spin.

    8. montaj kriptalarının, villus ve Organoids izole

    1. 1000 x g kriptalarının/villus/organoids cips ve yıkama çözüm kaldırmak 5 min için de santrifüj kapasitesi.
      Not: Eğer Pelet çekilmesini, sonra tekrar santrifüj kapasitesi.
    2. Antifade Pelet aracıya ile ortam takma zor ayarı 2 damla ekleyin.
    3. P200 micropipette sonunda kesti ve dikkatle Pelet montaj medyada resuspend. Kabarcıklar oluşturulmasını engellemek.
      Not: İzole organoid kültürler yapış yapış; tam olarak resuspend emin olun.
    4. Micropipette kriptalarının/villus/organoids montaj medya çözüm karışımı aktarmak ve mikroskop slayt merkezi boyunca bir çizgi içinde dağıtmak için kullanın.
      Not: Çizgi-kullanılacak olan cam uzun olmamalıdır. Bir stereomicroscope kullanarak kriptalarının/villus/organoids de slayt üzerinde yayılmış ve değil clumped olup olmadığını kontrol edin.
    5. Dikkatle kapak cam üst üzerinde yer; kabarcıklar oluşturulmasını engellemek.
    6. Cam slayt slayt kitap ve mağaza buzdolabı confocal mikroskobunun analiz daha önce ayarlamak gecede montaj medya yerleştirin.
      Not: fare antikor için ticari ayirt kullanın fare dokusunda boyama ( Tablo malzemelerigörmek) kit. Engelleme adım (Bölüm 4) bir 10 min blok 1 h kuluçka engelleme reaktif kiti ile gelir ile engelleme çözüm ardından protein ile değiştirin. O zaman adım 5.8 (ortasında çamaşır) 1 h kuluçka Floresans sinyal arttırıcı reaktif ile ekleyin. Sonra Kit'in reaktif floresan (diğer ikincil antikorlar da bu reaktif ile birlikte kullanılabilir) dilutant kullanýn. Yukarıdaki gibi kuluçkaya ve adım 6 protokolünün geri kalanı ile devam edin.

    9. fiksasyon ve immün Organoids Bodrum matris içinde etiketleme

    Not: Organoids yazgılı fiksasyon için ve IMMUNO-Bodrum matris içinde kalarak etiketleme oluşturulan Bodrum matris kubbeler üzerine yuvarlak cam coverslips bir 24-şey plaka (iyi başına bir kubbe) içinde. Organoid Bodrum matris kubbe içinde 24-şey plaka eklendiğini ve kaldırıldığını çeşitli çözümler tarafından işlendi.

    1. Orta kuyulardan kaldırın ve sabitleştirici ekleyin; 1s için bırakın.
    2. Sabitleştirici kaldırmak ve 2 h için % 1 serum ve % 0.1 deterjan içeren, her 30 dakikada değiştirme PBS yıkayın.
    3. Yıkama çözüm kaldırın ve % 10 için 1 h serum ve % 0.1 arasında olan deterjan PBS içinde kapatın.
    4. PBS ile % 1 serum veya PBS % 1 serum ve % 0.1 deterjan ile antikor sulandırmak.
    5. Engelleme çözüm kaldırın ve 100-200 μL birincil antikor ekleyin (bakınız Tablo reçetesi) çözüm her şey için.
      Not: daha fazla antikorlar seyreltik olarak değil tüm engelleme çözümü kaldırmak önemlidir.
    6. Buzdolabında tabak yerleştirin ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya
    7. O zaman RT 1-2 h için bırakın.
    8. Antikor çözüm ve 2-3 h yıkama çözüm her 20 dk değiştirme için yıkama kaldırın.
    9. Tüm yıkama çözüm kaldırın ve 100-200 μL ikincil antikorlar seyreltilmiş (bakınız Tablo reçetesi) PBS içinde % 1 serum ile ekleyin; RT, 1 h için kuluçkaya
    10. İkincil antikor çözüm ve 2 h, her 20 dk değiştirme için yıkama kaldırın.
    11. Yıkama çözüm kaldırın ve DAPI çözüm ekleyin; 10 dk RT. kullanım DAPI hisse senedi çözüm (20 mg/mL), 1:10, 000 seyreltilmiş için bırakın.
    Hisse senedi çözüm aliquots-20 ° C'de muhafaza
  • DAPI çözüm ve yıkama 40dakika her 10 min değiştirme için kaldırın.
  • Forseps kullanarak, Bodrum matris kubbe ile cam coverslip çıkarın ve bir slayt üzerinde Bodrum matris kubbe yukarı bakacak şekilde yerleştirin; ortam takma birkaç damla ekleyin ve sonra bir cam coverslip üste koydum.
  • Cam slayt slayt kitapta yer ve ayarlamak gecede montaj medya için buzdolabında bırakın.

    • Sonuçlar

    IMMUNO-etiketleme için bağırsak dokusu yalıtım
    Kolon ve ince bağırsak açıklanan doku yalıtım protokollerde korunması ve mikrotübüller ve ilişkili proteinler IMMUNO etiketleme için ancak kök hücre canlılığı ve organoid üretimi (Resim 1 ve Tablo 1 için optimize ). Crypt oluşturmak için amacı olduğunu ve gibi villus hizip (mukus ve diğer doku yoksun) temiz mümkün olduğunca EDTA ve soğuk yapısını korumak ve mikrotübüller neden buz soğuk çözümleri ile bozulumu önlemek maruz en aza indirerek tüm ama istikrarlı mikrotübüller bozulumu. Şekil 2 kesirler 2 ve 3 görüntüleri örneklerden izole küçük bağırsak dokusu, gösterir kesir villus ve kriptalarının (şekil 2A, B), kesir 3 sırasında karışımı içeren 2 esas olarak kriptalarının (şekil 2C içerir D).

    Fiksasyon ve izole bağırsak dokusu IMMUNO etiketleme
    Tek tek veya kombine kesirler sonra fiksasyon için işlenmiş olan ve immün etiketli fiksasyon da dahil olmak üzere bir dizi aracılığıyla, deterjan, engelleme, antikor, çözümler, son villus/kriptalarının yeniden askıya almadan önce yıkama cips montaj medyada, slaytlara aktarma ve cam coverslips ile kapsayan. Kriptalarının ve villus üzerinde confocal mikroskop görüntüsü.

    İyi korunması ve mikrotübüller ve aktin villus ve kriptalarının etiketlerine göre aşağıdaki tarafından elde:-20 ° C'de tekrarlanan % 0,1 deterjan ve % 1 serum içeren ve PBS içinde %0,1 ile engelleme PBS yıkama, formaldehit/metanol fiksasyon bir arada deterjan ve % 10 serum, birincil antikorlar 4 ° C'de ve oda sıcaklığında (şekil 3) ikincil antikorlar 2 h, gecede kuluçka izledi. Formaldehit/metanol fiksasyon da iyi etiketleme için çalıştı + EBs ve CLIP-170 izole kriptalarının ve villus (şekil 4) gibi ipuçları. Kafes boyunca Derneği istikrarlı mikrotübüller villus örnekleri (şekil 4 c) görülebilir mikrotübüller (kuyruklu da bilinir) artı sonunda EB3 birikimleri kriptalarının (şekil 4A), belirgin önemli katkılarda bulunmuştur. Farklı yerelleştirme klip-170 ve p150Tutkalla yapıştırılmış (dynactin birimi) apikal n MTOCs izole villus (şekil 4B) içinde açıkça belli. Fiksasyon formaldehit/metanol protokolü ile tutarlı bir şekilde izole bağırsak dokusunda bizim Pep3 antikor fare ninein karşı kullanarak ninein yerelleştirme için işe yaramadı. Ancak, metanol fiksasyon-20 ° C'de aynı yıkama tarafından takip ve formaldehit/metanol gelince çözümleri engelleme ninein izole kriptalarının ve villus (şekil 5; başvuru8) içinde çok iyi yerelleştirme verdi. Ninein apikal centrosomes konsantre olmakla ilginçtir, bazı birikimi hücre Bankası, izole kriptalarının (şekil 5) bazı hücrelerde belirgin oldu. Bu belirsiz etiketleme veya yalıtım yordamı geciktirmek bir sonucu nedeniyle olup fiksasyon (ve böylece koruma etkileyen) daha fazla araştırma gerekir. Ancak, metanol-sabit (-20 ° C) cryostat ( şekil 3bi 8' bakınız) villus bölümlerini de ninein o ninein düşündüren bazı hücrelerde temel hücre, mikrotübüller Bazal nüfusu ile de ilişkilendirebiliriz ortaya koydu.

    Fiksasyon ve IMMUNO-Bodrum matris izole organoids, etiketleme
    Küçük bağırsak organoids oluşturulan ve Bodrum matrix üç hafta veya daha uzun (şekil 6A; başvuru6,15) büyüdü. Nezle (4 ° C) hücre kurtarma çözümü organoids Bodrum matris yalıtmak için kullanıldı. Depolymerized Bodrum matris çözüm organoids ile tüpler için transfer ve fiksasyon ve immün etiketleme önce centrifuged. Bu çok temiz hazırlıklar üretilen ve organoids iyi bir ulaşım çeşitli çözümler için izin verdi. Organoid i. etki alanları içinde farklılaşmış hücre istikrarlı apico Bazal mikrotübüller içeriyor; Bunlar etiketli çoğu durumda (şekil 6B, C) iyi ve EB1 Mikrotubul kafes (şekil 6E; başvuru13) da görülebilir. Ancak, soğuk hücre kurtarma çözümü hangi belirgin bazı örnekleri (ki büyüyen mikrotübüller artı sonuna bağlamak) EB1 kuyruklu yıldızlar Bazal crypt etki alanlarındaki (şekil 6F eksikliği ile dinamik mikrotübüller bozulumu içinde neden olabilir ). Diğer örnekleri, astral (dinamik) mikrotübüller (şekil 6D) korunduğu görülmüştür. Organoid yalıtım fiksasyon önce ve immün etiketleme de bileske proteinler, ninein, klip-170 ve müsin goblet hücreleri ve chromogranin A enteroendocrine hücreler için gibi hücre işaretçileri için çalıştı.

    Fiksasyon ve immün organoids Bodrum matris içinde etiketleme
    Şekil 7     kist aşamada (A-C) ve yeraltı türbesi geliştirme (D), formaldehit/metanol içinde sabit ve immün etiketli mikrotübüller ve ninein için erken bir aşamada bir organoid gösterir. İyi Mikrotubul korunması ve etiketleme gibi apikal n-MTOCs, ninein için etiketleme belirgin idi. Şekil 8A, B 6 organoid metanol protokolü ile sabit ve etiketli bir gün mikrotübüller ve EB1 içinde crypt etki alanını gösterir. Mikrotübüller ve EB1 kuyruklu yıldızlar iyi korunması dinamik mikrotübüller korunması düşündüren açıktı.

    Organoids Ayrıca Bodrum matris içinde kalan süre sabit ve immün etiketli edildi. Bu yordamı dezavantajları olmasına rağmen her iki durumda da daha az sık sık ne zaman % 0,1 deterjan sabitleştirici eklenmiştir sabitleştirici zavallı penetrasyonu ve bindirme antikor (şekil 8B), Bodrum matris içinde olmak ve/veya çözümleri yıkayın. Buna ek olarak, % 4 İngiltere'de yılın vermedi koru Bodrum matris iyi ama neden bu çözülmeye, bu yüzde 1'daha az çok olmasına rağmen İngiltere'de yılın.Metanol fiksasyon, öte yandan, bazen organoid çöküşü indüklenen.

    Gibi bazı antikorlar karşı kök hücre işaretçisi Lgr5 ve Paneth hücre işaretleyici ile etiketleme CD24% 4 İngiltere'de yılın, metanol veya formaldehit/metanol iletişim kuralları ile başarısız oldu. Ancak, organoids Bodrum matris içinde yüzde 1'sabitleme PFA PBS ile % 0,1 deterjan oda sıcaklığında, Lgr5 ve CD24 için etiketleme neden (Şekil 9).

    İnce bağırsak kript izolasyon süreci diyagramı; PBS yıkama, EDTA tedavisi, fraksiyon analizi.
    Şekil 1: yalıtım küçük bağırsak villus ve kriptalarının. Küçük bağırsak villus ve crypt yalıtım fiksasyon ve immün etiketleme önce anahtar adımları akış diyagramı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Fraksiyonasyon deneyinde bağırsak villus ve kriptlerinin mikroskobik görüntüleri; doku yapısı detayı.
    Şekil 2: izole villus ve fare bağırsağı üzerinden kriptalarının. Bağırsak kesirler villus (büyük oklar) ve kriptalarının (küçük oklar) gösterilen aydınlık alan mikroskop görüntüleri. (A, B) Kesir 2 villus ve kriptalarının karışımı içeren ve morfolojisi villus ve mezar odası korunması Bbelirgindir. (C, D) Kesir 3 yalıtım kriptalarının ve yokluğu villus ve bozulmamış kriptalarının çatallanmış bir crypt içinde Cdahil gösterir. Ölçek çubukları = 500 mikron (A, C); 100 mikron (B, D). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    villus, kript farklılaşması ve epitel hücrelerini gösteren ince bağırsak diyagramı; mikroskopi sonuçları.
    Şekil 3: izole küçük bağırsak villus ve crypt formaldehit/metanol içinde sabit ve immün etiketli mikrotübüller ve aktin. Belirtilen farklı hücre tipleri ile villus ve crypt epitel(a)şeması. Vurgulanan kutuları B ve Cyansıma temsilcisi bölgeleri gösterir. (B, C) İ. (B) ve 30 mM EDTA kullanarak ve formaldehit/metanol içinde sabit, % 1 keçi serum ve % 0.1 deterjan içeren PBS yıkanmış, PBS içinde bloke ince bağırsak dan izole Bazal yeraltı türbesi (C) bir parçası üzerinden confocal optik bölümleri % 10 keçi serum ve %0,1 deterjan ve etiketli mikrotübüller ile fare monoklonal Anti-tübülin antikor (yeşil) ve aktin ile tavşan poliklonal anti-β-aktin antikor (kırmızı) içeren. İyi apico Bazal korunmuş Mikrotubul demetleri villus ve crypt hücrelerinde belirgin ve aktin konsantre Lümen (ok) karşı karşıya apikal bölgede görülebilir. Ölçek çubukları 5 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Mikrotübüller, CLIP-170, EB3 ve DAPI boyaması ile bağırsak kript ve villusun konfokal mikroskobu.
    Şekil 4: İzole küçük bağırsak crypt ve villus formaldehit/metanol içinde sabit ve immün etiketli mikrotübüller, EB3, p150Tutkalla yapıştırılmışve CLIP-170. Confocal optik bölümleri crypt ve villus bölgelerin 30 mM EDTA kullanarak ince bağırsak izole ve formaldehit/metanol, % 10 keçi serum ve % 0.1 deterjan, içeren PBS yıkanmış sabit % 10 keçi serum ve % 0.1 deterjan, içeren PBS bloke ve IMMUNO-etiketli. (A)Crypt tavşan poliklonal α-tübülin antikor (kırmızı) ve fare monoklonal EB3KT36 antikor (yeşil) ile etiketli ve DNA'ın apico Bazal mikrotübüller ve EB3 kuyrukluyıldızlar gösterilen DAPI (mavi) ile lekeli. Ters tek kanal görüntü EB3 kuyruklu yıldızlar iyi istikrarlı mikrotübüller yanı sıra dinamik korunması düşündüren Bazal crypt hücreler boyunca açıkça gösteriyor. Epitel hücreleri etiketli tavşan poliklonal klip-170 antikor ile (B) Villus (kırmızı, bkz: Ayrıca16başvuru) ve fare monoklonal p150Tutkalla yapıştırılmış antikor (yeşil) apikal gösterilen eş yerelleştirme. Ters tek kanal görüntüleri aşağıda gösterilmektedir. (C) Villus hücreleri tavşan poliklonal α-tübülin antikor (kırmızı) ve fare monoklonal EB3-KT36 antikor (yeşil) ile etiketli ve DNA'ın EB3 ile apico Bazal mikrotübüller kafes boyunca gösterilen DAPI (mavi) ile lekeli. Ters tek kanal görüntü EB3 kuyruklu yıldızlar ve kafes dernek öneriyor iken EB3 kafes Derneği büyütülmüş görüntü vurgulanır. Ölçek çubukları 5 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    İmmünofloresan hücre görüntüleme, Ninein/E-kaderin/DAPI belirteçleri, protein lokalizasyon analizi.
    Şekil 5: izole kolon crypt metanol, ninein ve E-cadherin, immün etiketli sabit ve DAPI ile lekeli. Bazal confocal optik bölümü ve bir crypt transit yükseltecek bölgesinin 3 mM EDTA kullanarak kolon izole ve metanol içinde sabit, % 1 keçi serum ve % 0.1 deterjan içeren PBS yıkanmış ve % 10 keçi serum ve % 0.1 deterjan içeren PBS engellendi. Crypt tavşan poliklonal ninein antikorlar ile etiketli oldu (Pep3, Ayrıca bkz: başvuru8, kırmızı) ve fare monoklonal E-cadherin antikor (yeşil) ve DAPI (mavi) ile lekeli. Ters tek kanal görüntü sadece ninein gösterir. Görüntü iyi korunmuş bir lahitte E-cadherin ile tek tek hücreleri ve ninein apikal centrosomes konsantre ana hatlarını ortaya gösterir. Sabitleştirici ve antikorlar iyi penetrasyon ve antigenicity korunması önerir. Ölçek çubuğu 5 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Organoid gelişim diyagramı; mikroskopi görüntüleri büyüme aşamalarını, B-katenin boyamasını ve yapılarını gösterir.
    Şekil 6: Organoid geliştirme, fiksasyon ve IMMUNO-etiketleme, izole organoids. (A)faz kontrast görüntüler gösteren farklı gelişimin organoid hücre toplamları üzerinden kist bud başlatma ve tamamen için kurulan crypt ve villus etki alanları ile organoids.(B-F) 4 ° C'de % 10 keçi serum ve % 0.1 deterjan, içeren PBS % 10 keçi içeren PBS engelleme yıkama formaldehit/metanol fiksasyon ardından (10 dakika) hücre kurtarma çözümü kullanarak Bodrum matris izole organoids aracılığıyla confocal optik bölümleri Serum ve %0,1 deterjan ve mikrotübüller, β-catenin ve EB1 IMMUNO etiketleme. (B) Organoid kist mikrotübüller (mavi) ve β-iyi Mikrotubul koruma açığa ve en hücreler etiketleme catenin (kırmızı) için etiketli. (C) ayrı apico Bazal mikrotübüller bir organoid kist genişlemiş bu epitel hücrelerinden belirgindir. (D) astral (dinamik) mikrotübüller (ok) dahil olmak üzere iğ gösterilen mikrotübüller için etiketli hücre bölünmesi. (E, F) İ. etki alanı (E) ve çok az EB1 kuyruklu yıldızlar bile Bazal crypt içinde bu dinamik düşündüren görülür iken bazı EB1 villus, özellikle de istikrarlı mikrotübüller kafes boyunca etiketleme gösterilen crypt etki alanı (F) organoid bölgeler mikrotübüller korunmuştur değil. Ölçek çubukları = 20 mikron (A); 2 mikron (D); 5 mikron (B, C, E-F). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Organoid kist mikroskobu; Ninein, MT, DAPI ile lekeli; kist yapısının gelişmesi; floresan analizi.
    Şekil 7: Organoids formaldehit/metanol Bodrum matris içinde sabit ve immün etiketli mikrotübüller ve ninein. Organoids confocal optik bölümleri formaldehit/metanol içinde sabit, yıkanmış ve % 10 keçi serum ve % 0.1 deterjan içeren PBS bloke ve Bodrum matris içinde kalan süre etiketli. (A-C) Organoid kist Mikrotubul (yeşil) ve ninein (Pep3; başvuru8, kırmızı) için etiketli ve DAPI ile (Birleştirilen görüntüyü A gösterilen mavi) lekeli ve mikrotübüller (B) ve ninein (C) için tek kanallı görüntüler ters. Görüntüler apico Bazal mikrotübüller ve apikal ninein yerelleştirme, telkin organoid çok iyi yapısal korunması ve penetrasyon antikorların yanı sıra ilişkisiz antikorları temizlemek göstermektedir. (D, E) Sabit ve yukarıdaki gibi etiketli crypt ve tekrar gösteren mükemmel Yapısal koruma geliştirme, etiketleme ve sıra takas Organoid. Farklı apico Bazal mikrotübüller ve apikal n-MTOC ninein yerelleştirme belirgin ve Dkutulu bölgede büyütülmüş görüntü (E) vurgulanmış. Ölçek çubukları = 10 mikron (A-D); 5 mikron (E). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Organoid kript diyagramı; floresan mikroskobu; EB1, MT, DAPI boyama; yapısal detay.
    Şekil 8: metanol Bodrum matris içinde sabit ve mikrotübüller ve EB1 IMMUNO etiketli Organoids. Organoids confocal optik bölümleri metanol içinde sabit, yıkanmış ve % 10 keçi serum ve % 0.1 deterjan içeren PBS bloke ve etiketli, Bodrum matris içinde kalan süre. (A)kist etki alanından bir tam gelişmiş organoid etiketli ile tavşan poliklonal α-tübülin (kırmızı) ve fare monoklonal EB1 (yeşil) antikorları apico Bazal mikrotübüller, gösterilen Miller (ok) iki sayesinde bunun bölünen hücreler ve farklı EB1 kuyruklu yıldızlar. Bazı bindirme ilişkisiz EB1 antikorların belirgindir. Ancak, iyi yapısal korunması ve etiketleme mikrotübüller ve EB1 görülmektedir. EB1 kuyruklu yıldızlar varlığı dinamik mikrotübüller korunur olduğunu göstermektedir (A, ters çevir). (B) ters görüntü α-tübülin antikor önemli antikorlar ile etiketleme tuzağa çevredeki Bodrum matris içinde (ok) gösterilen organoid kist bölgesinin. Ölçek çubukları 5 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Organoid boyama; CD24, Lgr5 belirteçleri; mikroskopi görüntüsü; Hücre farklılaşma analizi.
    Şekil 9: %1 Bodrum matris içinde sabit Organoids İngiltere'de yılın ve immün etiketli Lgr5 ve CD24. % 1 Bodrum matris içinde sabit organoids confocal optik bölümleri % 0,1 deterjan, içeren PBS PFA PBS içinde % 1 keçi serum ve % 0.1 deterjan ile yıkanmış ve Lgr5 ve CD24 karşı antikor taşır. (A, B) Paneth hücreleri CD24 için (kırmızı) pozitif gösterilen bir mezar odası etki alanı içinde kök hücre niş. Confocal ve faz kontrast görüntüler Aiçinde birleştirilmiş. B CD24 tek kanal etiketleme gösterir. (C) kök hücre bölge Lrg5 olumlu kök hücre gösterilen bir mezar odası etki alanı içinde. Ölçek çubukları 10 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Hücre fraksiyonlama süreci şeması; EDTA, PBS tedavileri, santrifüj adımları için zaman çizelgesi.
    Tablo 1: zaman çizelgesi küçük bağırsak crypt ve villus tecrit ve fiksasyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Tartışma

    Yalıtım bağırsak dokusu
    Yalıtım küçük bağırsak kriptalarının ve villus ve kolon kriptalarının Mukozal yüzeyin hücre kişiler, (sallama) ayırma ve Santrifüjü gevşetmek için EDTA çözüm ile tedavi maruz içerir. Sunulan bağırsak villus/crypt yalıtım Protokolü Belshaw vd ve Whitehead ve ark. değiştirildi. 17 , 18

    Mukozal yüzey açığa
    Bu yordamı gelişiminde bağırsak mukozal yüzeyinde ortaya çıkarmak için yaklaşımlar bir dizi ile tecrübe var. (Ters dönüş) çıkar için klasik bir yaklaşımdır tüpte kesimleri 100 mm uzunluğunda, genelde doku katlayin bir ucunu ve sonra kalan tüp yakalanmış bir metal çubuk kullanarak üzerinde tüp19kaydırdı. Yuvarlatılmış uçları ile metal bir çubuk (2.4 mm çap) fare doku için idealdir. Bu yaklaşım PBS ve EDTA daha iyi erişim sağlayan Mukozal yüzeyin genişleyen yararı vardır. Başlangıçta bu yaklaşım kullanılan ama tüp kesme kısa uzunlukta parçalara (yaklaşık 5 cm) ve bu daha kolay ispat olarak makas diseksiyon ile her bölümünde açmak için taşındı. Eğer sadece birkaç bağırsak gereklidir bu uygun bir yaklaşımdır; Ama eğer daha fazla hayvan were to be bir denemede sonra amaca uygun yapılmış bir aygıt kesme için tüp boyuna, Yoneda ve ark. tarafından açıklandığı gibi kullanılan aç 14 daha verimli olacaktır.

    Dekolmanı villus ve kas katmanından kriptalarının
    Başlangıçta 3 mM EDTA PBS ve nispeten uzun bir kuluçka zamanlarında 60 dakikaya kadar temel doku17,18Mukozal yüzeyden gevşetmek için kullanılır. Bu konsantrasyon EDTA bir kuluçka süresi 30 dk kriptalarının fare iki nokta üstüste gelen gevşetmek yeterli buldum. Ancak, ince bağırsak crypt/villus yalıtım için verimli bir yaklaşım olduğunu kanıtladı daha kısa bir süre daha yoğun EDTA kullanarak çalıştı. Tüm sonraki çalışma ile ilgili bölümler için villus veya kriptalarının üreten 30 mM EDTA tekniği kullanarak çıkarılan doku yapılmıştır. Kriptalarının, biz normalde havuza alınmış kesirler 3-5 düzeltmeden önce ama zamanlamaları bağlı olacaktır gibi bir dizi faktöre bağırsak boyunca konum gibi fare, iltihap, önceki diyet yaş üzerinde bu uygun kesirler vardır olup olmadığını kontrol etmek önemlidir , vb benzer şekilde, farklı koşullar altında doku etkili olabilmesi için EDTA tedavi sarsılmış gereken süreyi değişebilir. İzole doku kesirler villus kriptalarının veya özellikle de villus veya kriptalarının (Şekil 2) bir karışımı içeren sonucudur. 30 için tüp doku sallayarak, üst üste hiçbir villus olarak crypt ayıklama tek adımda ulaşılabilir olabilir s. Bu kesirler sabit ve immün etiketleme için işlenir.

    Bağırsak organoids Bodrum matris işlemleri olan
    Organoids Bodrum matris kubbeler üzerinden işlemleri olan hücre kurtarma çözümü kullanarak elde edilebilir. Genellikle bodrum matris ama sıcaklık 2-8 ° c olması gereken depolymerizing tarafından çözüm çalışır Dikkatli bir not dinamik mikrotübüller korunmuş olduğunu. Böylece, dinamik mikrotübüller, immün etiketleme için ve + EBs hücre gibi ipuçları, Bodrum matris fiksasyon önce kurtarma önerilmez. Ancak, mikrotübüller ayırt organoid hücrelerdeki çoğu nispeten istikrarlı ve bunlar (şekil 6) korunduğu görülmüştür. Aynı zamanda iyi IMMUNO-etiketleme için centrosomal ve bileske proteinler hem de hücre işaretleri çalıştı.

    Fiksasyon protokolleri
    Formaldehit (PFA taze yapılmış) tersinir oluşturur bir nispeten hızlı etkili sabitleştirici çapraz bağlantılar ve % 4 İngiltere'de yılın örnekte mikrotübüller IMMUNO-etiketleme ve gama-tübülin ve Phalloidin ile boyama aktin filamentleri için iyi çalışıyor. Daha İngiltere'de yılın çözümleri gibi İngiltere'de yılın daha yüksek konsantrasyonlarda işe yaramadı iken IMMUNO-Örneğin, etiketleme için iyi ile crypt kök hücre niş içinde kök hücre işaretçileri Lgr5 ve Paneth hücre işaretleyici CD24 çalıştı % 1 oranında seyreltin.

    Oxazolidin ilavesi mikrotübüller ve %3.7 PFA, %0.05 oxazolidin ve % 0,5 deterjan PHEMO arabellek (68 mM borular, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA ve 3 mM MgCl2)2 karışımından oluşan sözde PHEMO fiksasyon daha iyi korunması verir mükemmel mikrotübüller korunması antigenicity ödün verir. Bu da IMMUNO-etiketleme gama-tübülin, β-catenin ve E-cadherin ve phalloidin ile boyama aktin filamentleri için iyi çalışıyor. Ancak, 3D doku ve organoid kültürleri, PHEMO fiksasyon tutarsız sonuçlar üretti ve bu nedenle kullanılmamıştır.

    Metanol nispeten iyi penetrasyon verir ve antigenicity korumak eğilimi bir koagulant sabitleştirici var. Fiksasyon % 100 metanol (-20 ° C) ile bazı büzülme tanıtır, ılımlı Morfoloji koruma sağlayan ve mikrotübüller, + ipuçları ve ninein 2D hücre kültürlerinde dahil olmak üzere birçok centrosomal antikorlar için çalışır. Ancak, bazı organoids bu fiksasyon yöntemi kullanarak zaman çöktü. Buna ek olarak, tüm kriptalarının, villus veya organoids antikorların penetrasyon başlangıçta bir sorun olduğunu biliyorum ama % 0,1 deterjan yıkama çözüm ve uzun süreli çamaşır ilavesi daha iyi sonuçlar elde.

    Formaldehit ve metanol bir kombinasyonu daha önce Rogers ve ark. tarafından kullanılmaya başlanmış 20 IMMUNO-etiket EB1 için Drosophila. Formaldehit bir karışımı bir fiksasyon protokolüne dayalı ve metanol bu nedenle bağırsak dokusu-20 ° C soğuk ama 5 mM Sodyum karbonat Rogers tarafından kullanılan karışım üzerinden atlama % 3 formaldehit ve % 97'si metanol dayalı organoids için geliştirilmiş ve ark. 20 -20 ° C'de dondurucuda Ayrıca, örnekleri düzeltildi Bu amele özellikle immün etiketleme için iyi + ipuçları, küçük-170 ve EBs gibi ama aynı zamanda sabitleme ve immün etiketleme mikrotübüller ve aktin içinde doku ve 3D organoids için mükemmel oldu. Çok iyi Yapısal koruma belirgin ve ninein için etiketleme daha tutarlı bir şekilde metanol ile çalışabiliyordu antigenicity gama-tübülin ve ninein, gibi centrosomal proteinler yanı sıra birkaç hücre iskeleti ve ilişkili proteinler için korundu fiksasyon.

    Açıklamalar

    Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

    Teşekkürler

    Yazarlar Paul Thomas mikroskop tavsiye ve yardım için teşekkür ederiz. Bu eser burada yer BBSRC tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. M.M.M. ve tw bb/J009040/1).

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)SigmaD8537-500MLyıkama ve PFA
    Hücre Geri Kazanım ÇözeltisiCorning354253organoidleri izole
    lobind mikrosantrifüj tüpleriEppendorf30108116hücrelerin yapışmasını önler
    0.5 M EDTA çözeltisi, pH 8.0Sigma03690-100MLKript izolasyonu
    70 μ m hücreli süzgeçFisher Scientific11517532Villuslardan kriptleri izole
    Triton X-100SigmaT8787deterjan
    keçi serumuSigmaG6767bloke edici ajan
    Fetal Sığır Serumu (FBS)Yapışmaz ajan olarak kullanılanSigma
    Paraformaldehit, PBSAlfa AesarJ61899fiksatifinde
    %4Formaldehit çözeltisi (36.5– Fiksatif Metanol olarak kullanılan H2O)SigmaF8775'te
    %38 Fiksatif olarak kullanılan %99,9 Analitik sınıfFisherM/4000/17fiksatif
    MaxFluor Mouse olarakMaxvision
    Biosciences    		MF01-Sticari immünofloresan kiti; spesifik olmayan etiketlemeyi azaltmak için
    Rotator SB2 veya SB3Stuartmikrosantrifüj tüp döndürücü
    Sodyum sitratantijen alımı
    HydromountUlusal TeşhisHS-106mountant
    DABCO - 1,4-diazabisiklo [2.2.2] oktanSigmaD27802solma önleyici ajan
    Kalıcı pozitif şarjlı, önceden yıkanmış, 90 derece zemin kenarlarınetlikN / C366slaytlar
    Cam lamel - Kalınlık No. 1, 22 x 50 mmClarityNQS13/2250lameller
    MatrigelCorning3562313D organoid kültür için temel matris
    50 mL konik tüplerDoku/organoidleri işlemek içinSarstedt62.547.254
    15 mL konik tüplerDoku/organoidleri işlemek içinSarstedt62.554.502
    1.5 mL LoBind tüpleriEppendorfİzole organoidler için30108051
    Fare monoklonal anti-E-kaderin antikoruBD Biosciences610181birincil antikoru 1:500
    Sıçan monoklonal anti-tubulin YL1/2 antikoruAbcamab6160birincil antikor 1:100
    Tavşan alfa-tubulin antikoruAbcamab15246birincil antikoru 1:100
    Tavşan anti-beta-aktin antikoruAbcamab8227primer antikoru 1:100
    Sıçan monoklonal anti-p150Yapıştırılmış antikorBD Bioscience610473/4primer antikoru 1:100
    Sıçan monoklonal EB3KT36 antikoruAbcamab53360primer antikoru 1:200
    Fare monoklonal EB1 antikoruBD Bioscience610535primer antikoru 1:200
    Tavşan anti-Lgr5 antikoruAbgentAP2745dbirincil antikor 1:100
    Dylight anti-sıçan 488Jackson112545167ikincil antikoru 1:400
    Dylight anti-fare 488JacksonST115545166ikincil antikoru 1:400
    Dylight anti-tavşan 647Jackson111605144ikincil antikoru 1:400
    etmek edin , Fare İmmünofloresan Tespit Kiti üzerinde kullanılır

    Kaynaklar

    1. Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium. J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).
    2. Bellett, G., et al. Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).
    3. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells. J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).
    4. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila. J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).
    5. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Curr Opin Cell Biol. , (2016).
    6. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
    7. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
    8. Goldspink, D. A., et al. Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres. Open Biol. 7 (2), (2017).
    9. Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. Elife. 5, (2016).
    10. Young, M., Reed, K. R. Organoids as a Model for Colorectal Cancer. Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).
    11. Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).
    12. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
    13. Goldspink, D. A., et al. The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation. Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).
    14. Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J Vis Exp. (105), e53042(2015).
    15. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765(2014).
    16. Coquelle, F. M., et al. LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway. Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).
    17. Belshaw, N. J., et al. Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa. Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).
    18. Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
    19. Hamilton, K. L., Butt, A. G. Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice. Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).
    20. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).

    Yeniden basım ve izinler

    Etiketler

    İmünofloresan EtiketlemeMikrotübül LokalizasyonuEx Vivo DokuFormaldehit Metanol FiksasyonuKonfokal MikroskopiAntikor PenetrasyonuOrganoid İzolasyonuMikrotübül Korunumu
    IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme
    Bize Ulaşın
    Kütüphaneye Öner

    Gizlilik

    Kullanım Koşulları

    Politikalar

    Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.