Yöntem makalesi

HER2 Gene amplifikasyon meme kanserleri heterojen değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tarama Platform kurma

DOI:

10.3791/56686

⸱

5 Aralık 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pathology, Fondazione IRCCS Ca' Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2School of Medicine, University of Milan, 3School of Biology, University of Pavia, 4Division of Breast Surgery, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 5Division of Medical Oncology, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 6Department of Biomedical, Surgical, and Dental Sciences, University of Milan

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Türdeş olmayan dağıtım HER2-pozitif hücrelerinin meme kanserlerinin bir alt kümede görülebilir ve klinik ikilemler oluşturur. Burada, tanımlamak, ölçmek ve HER2 içi tümör genetik heterojenite heterogeneously işlenmiş meme kanserlerinin büyük bir dizi karşılaştırmak için güvenilir ve düşük maliyetli bir iletişim kuralı tanıtmak.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) karşı hedefli tedaviler HER2-pozitif meme kanseri olan hastalarda, sonucunu kökten değişti. Ancak, bir azınlık olguların önemli klinik sorunlar oluşturan heterojen bir dağıtım HER2-pozitif hücrelerinin görüntüler. Bugüne kadar hiçbir güvenilir ve standart protokolleri karakterizasyonu ve miktar ile HER2 heterojen gene amplifikasyon içinde büyük tabur için önerilmiştir. Burada, aynı anda birden fazla meme kanserlerinin farklı topografik alanları arasında HER2 durumu değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek metodoloji mevcut. Özellikle, tümörler hedef eşlemesi ekleme gelişmiş doku microarrays (ayarlayınca) oluşturmak için laboratuvar yordamı göstermektedir. Tüm TMA parametreleri özellikle gümüş in situ hibridizasyon (FFPE) meme dokuları parafin gömülü formalin sabit için (SISH) optimize edilmiştir. Prognostik ve akıllı biyolojik (Yani, ER, halkla ilişkiler, Ki67 ve HER2) analizini immunohistokimyasal otomatik yordamları kullanarak yapılmalıdır. Özelleştirilmiş bir SISH protokol farklı fiksasyon, işleme ve depolama yordamlar yapılan birden fazla doku arasında bir yüksek kaliteli moleküler analiz izin vermek için uygulamaya konmuştur. Bu çalışmada, biz bir kanıt-in-belirli DNA dizileri verimli ve düşük maliyetli bir yöntem kullanarak aynı anda birden çok farklı topografik alanlarında yerelleştirilmiş ve heterogeneously işlenmiş meme kanserlerinin olabilir ilke sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HER2 overexpressed ve tüm invaziv meme kanserleri1,%215-30'güçlendirilmiş bir proto-oncogene var. HER2 overexpression varlığı ile değişkenden > % 10 hücrelerle gene amplifikasyon zaman HER2/şeması oranı ≥2 ya Gen kopya sayısı ≥6, tespit edilebilir iken boyama (3 +), sayma güçlü membran immunohistokimyasal (IHC) En azından 20 hücreleri tarafından in situ hibridizasyon (ISH)3.

İçi tümör genetik heterojenite, meme kanserleri, biyolojik değerlendirme ve tedavi yanıt4potansiyel olumsuz bir katılımcı olmak yaygın olarak tanımlanmıştır. HER2 içinde güçlendirilmiş College of Amerikan patologlar (kap göre), HER2 heterojenite var demektir > % 5 ve < %50-in tümör infiltre hücreleri5. Ne yazık ki, meme kanserleri HER2 kayma heterojenite gerçek insidansı bir konu tartışma patologlar arasında kalır, bazı yazarlar bu bakımı ile son derece nadir bir olaydır ve diğerleri olguların % 40 ilâ ima HER2-heterojen1,5,6,7,8,9,10. Bu durum temelini oluşturan biyolojik mekanizmaları rağmen değil henüz tam olarak, içi tümör HER2 heterojenite prognostik ve klinik etkileri meme kanseri hastaların11için önemlidir açıkladı.

Son zamanlarda, chromogenic ISH (CISH) ve gümüş ISH (SISH), gibi parlak alan moleküler teknikleri floresan ISH (balık)12' ye göre bazı avantajları ile FFPE dokularda HER2 heterojenite algılamak için güvenilir yöntemi olarak ortaya çıkmıştır. Ne yazık ki, toplu analiz tek olguların büyük kohort araştırma çalışmaları içinde pratik kalır. Çeşitli gruplar histochemistry, IHC ve ISH TMA teknolojileri kombinasyonu çalışmada kanser Biyoloji13,14,15,16, değerli bir strateji doğurabilecek tavsiye ettiler. Bu yaygın olarak kabul edilen yöntemle doku örnekleri farklı hastalarda aynı anda, doku ve istihdam ve böylece durumlarda14büyük bir dizi tek tip analizi teşvik reaktifler minimize analiz edilebilir. Ancak, iletişim kuralı yok eşzamanlı yüksek üretilen iş moleküler karakterizasyonu farklı olarak arşivleme işleme reaktifler, fiksasyon kez ve koruma yöntemleri istihdam, böyle açısından uygulanan birden fazla doku örnekleri için kullanılabilir. blok.

HER2 kayma heterojenite prognostik ve klinik etkileri meme kanserlerinin göz önüne alındığında, biz heterogeneously işlenmiş durumda büyük dizi değerlendirmek için entegre bir moleküler platform geliştirilmiştir. Burada, biz üretmek ve yüksek verimli ayarlayınca içinde HER2 amplifikasyon meme kanseri içi tümör heterojen SISH aracılığıyla analiz laboratuvar stratejileri tasvir. Aşağıdaki iletişim kuralı ölçme tümörler için geliştirilen > 5 mm (> pT1b göre TNM 2017)17. Daha küçük lezyonlar için tam yüz seri bölümlerde çözümlemesini öneririz. Prosedürü her servis talebi için 6 farklı alanlara (aralığı 4-8) ortalaması kapsayan 30 meme kanserlerinin eşzamanlı IHC ve SISH analizi için izin verir. Özet olarak, 1 mm çapında, çekirdek ve kılavuz ve kenarları arasında 2 mm arasında 500 µm ile 180 doku çekirdek her TMA bloğu için oluşturulur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada IRCCS CA'dan kurumsal inceleme kurulları tarafından kabul edildi ' Granda Vakfı, Policlinico hastane, Milan, İtalya.

1. hasta ve doku örnekleri seçkisi

  1. Tüm kullanılabilir Hematoksilen ve Eozin (H & E) ve özgün tanıdan IHC slaytlar dahil olmak üzere analiz edilecek, tüm servis talepleri arşivleme slaytlar almak ve varsa, bir H & açısı neoplastik olmayan meme dokusu (örneğin, cerrahi kenar boşluğu) bahisler .
  2. Büyük değerlendirmeleri gerçekleştirin.
    Not: Bu görev için meme patoloji deneyimi ile en az iki patolog tanı slaytlar tartışmak ve anlaşmazlıklar collegially çözebilirsiniz. Geleneksel mikroskop veya (çok merkezli çalışmalar ikinci lehine) telepathology araçları kullanın. Varsa, tüm uyumsuz durumlarda hariç.
    1. Histolojik yeniden sınıflandırma18meme tümörleri Dünya Sağlık Örgütü (WHO) sınıflandırılması son sürümü göre tüm vakaların gerçekleştirin.
    2. Her durumda için normal doku arşivleme klinik örneklerinde varsa en az bir neoplastik olmayan terminal lobular duktal birim oluşur emin olun.
    3. Türdeş olmayan göstermek tüm neoplastik alanları belirlemek saytolojik, mimari, veya (ortaklaşa bir patolog ve ayarlayınca inşa technician(s) tarafından gerçekleştirilecek) alan parlak mikroskop kullanarak IHC özellikleri.
  3. Ayrık topografik alanları cam slayt üzerinde bir marker ile veya bir dijital slayt yazılımı (şekil 1A) uygun aracı ile vurgulayın.
  4. Seçili slaytlar üzerinde bağlı olarak, karşılık gelen FFPE blok arşivlerinden almak.
    Not: TMA en iyi duruma getirmek için inşaat, doku tükenmesi önlemek için ve TMA korumak için yumruk yapısal bütünlük, servis talepleriyle < 1 mm kalınlığında kalan doku hariç.

2. tasarım ve Kononen tekniğine göre ayarlayınca oluşturmak

  1. Oluşturma ve her örneğinin farklı bölgelerin kayıtlarını içeren yeni bir elektronik tablo dosyasını açın. Tablo 1'olarak ayrı sütunlarda aşağıdaki verileri içerir: durum kimliği, blok kimliği, alan kimliği, doku türü (örneğin, normal doku, invaziv bileşeni histotype, situ bileşen histotype), topografya (örneğin, tümör çekirdek, invaziv açık), Morfoloji (örneğin, nükleer grade, mimari, mitoses, saytolojik özellikleri), biyolojik durumu (Yani, östrojen reseptör (ER), progesteron reseptör (PR), Ki67 ve HER2) ve tüm diğer IHC özellikleri kullanılabilir.
    1. Belgeyi kaydedin.
  2. TMA projesi oluşturun.
    1. Yükleyin ve TMA tasarımcı yazılımını açın.
    2. TMA alıcının block(s) tanımlamak: erişim menüsünden Dosya > Yeni > blok veya CTRL + b kullanarak
    3. Doldurun veya SEKME tuşuna basın ve parafin blok boyutları yazın ilk alanını tıklatın: Genişlik 35 (mm), yükseklik (mm) 20. Tip "2" "marj" değeri (Yani, mm parafin kenara uzaklığı) olarak (şekil 1B). Uygun düğmesini tıklatarak verileri kaydetmek. Yeni şablon alıcı blok / şimdi kaydedilir ve yeni doku dizi şablonlarında kullanılmak üzere hazır.
    4. Bir doku dizi projesi oluşturun: Dosya menüsüne erişim > New > doku dizi veya CTRL + t kullanarak
    5. Doku dizi, yorum ve yazar adına doldurmak, o zaman tıkırtı "En yakın." "Alma" simgesini tıklatın, alıcı blok önceden oluşturduğunuz şablon dosyası seçin ve "next" tıklayın
    6. 1 mm yuvarlak düğmesini tıklatarak nokta boyutunu seçin. 500 µm olarak komşu noktalar iki merkez arasında boşluk olan nokta aralığı seçin. 231 olması gereken noktaların oluşturulan, toplam sayısını hesaplamak için hesap makinesi simgesini tıklatın. "İleri" düğmesini tıklatın
    7. Spot numaralandırma modu bir kez tıklayarak tanımlayın. Düğmesini tıklatın "tanımlamak" Izgaralar ve alt Izgaralar oluşturmak için. Ana damar (satır 6) silmek ve 8 ve 15 sütun. 3 sıraya oryantasyon 1 satırının korumak. Son harita Toplam 183 noktalar, Şekil 2' de temsil edilen kapsayacak.
    8. Doku türlerinin listesini tanımlayın: erişim menüsünden Dosya > Yeni > listesi doku türleri veya CTRL + l kullanarak
    9. Önceden tanımlanmış doku açıklamaları ekleyin. Aşağı ok tuşuna basın veya tıklatın bir satır eklemek için + düğmesine.
    10. Proje tanımlayın: erişim menüsünden Dosya > Yeni > Booster proje veya CTRL + s. kullanarak
    11. Doku dizi, yorum ve yazar adına doldurmak, o zaman tıkırtı "En yakın." Elektronik tablo dosyası, doku türlerinin listesi ve daha önce uygun simgelerini tıklatarak oluşturulan doku dizi modelini alın.
    12. "Tümünü Seç" seçeneğini tıklatın ve her doku türü için noktaların sayısını tanımlayın; ayarları uygulamak için "match" butonuna tıklayın. Örneklenmiş ve bu projede alıcı blok transfer çekirdek toplam sayısı listeleyen bir tablo görüntülenir. Projeyi kaydedin ve programı kapat.
  3. Alıcısı block(s) (şekil 1B) hazırlayın.
    1. Temizlenmiş metal kalıplar 65 ° C'de elastomerli parafin ile doldurmak
    2. Parafin blok gecede metal kalıplar içinde oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
    3. Parafin blok metal kalıplar ayıklayın. Çatlak oluşursa, blok atmak ve adımları 2.3.1-2.3.3 tekrarlayın.
  4. Bir otomatik veya yarı otomatik arrayer19kullanarak TMA oluşturmak.
    1. Tüm seçili FFPE bloklar ve ek açıklamaları karşılık gelen H & E bölümlerle almak.
    2. Arrayer üzerinde açmak ve alıcısı block(s) arrayer atlıkarınca ekleyin.
    3. Arrayer kontrol istasyonu yazılımı açın, "Yeni doku dizisinin"'ı tıklatın ve önceden oluşturulmuş proje (şekil 1 c) yükleyin.
    4. "Devam" ı tıklatın ve donör block(s) konumunu seçin.
    5. Alıcı blokların üzerine başlangıç yerini tanımlar: alıcı blok parafin sol üst kenarında ile hizalayın ve lazer ışığı taşımak için ok tuşlarını kullanın.
    6. "Next" butonuna tıklayın ve dikey hizalama için yineleyin.
    7. "Sonraki" otomatik olarak alıcı (alıcısı) blok önceden tanımlanmış koordinatıyla bir delik oluşturmak için tıklatın.
    8. Yumruk boş.
    9. Örnekleme için donör bloğu getirin ve ilgi alanı daha önce Açıklama eklenmiş bir doku göbeğini çıkarın.
    10. Donör doku çekirdek alıcı (alıcısı) blok deliğe yerleştirin.
    11. Donör blok arrayer kaldırın.
    12. TMA tamamlanıncaya kadar adımları 2.4.5-2.4.11 tekrarlayın.
  5. Yeni oluşturulan TMA blok doku tarafında steril bir boş slayt üzerinde koymak ve 5 min için 45 ° C'de laboratuvar fırında yerleştirin.
  6. Yavaşça 5 için slayt üzerinde blok basın s doku çekirdek düzleştirmek için. Bir kez (Toplam 2 kez) için işlemi yineleyin.
  7. TMA blok slayt ile birlikte Kaldır fırın, onları çevirmek ve yavaşça slayt bloğundan bağlantısını kesin.
  8. Kapak ince bir tabaka halinde 65 ° C'de elastomerli parafin ile TMA doku yüzey
  9. TMA blok 2 h için oda sıcaklığında bırakın.
  10. TMA blok 24 h için 4 ° C'de aktarın.
    Not: TMA blok 4 ° C'de tükenme kadar saklanır.

3. histochemical ve immunohistokimyasal analizleri

  1. TMA bölümleri kestim.
    1. TMA alıcısı block(s) parafin tarafı parafin chill için 10 dakika için bir-10 ° C yüzeye yerleştirin.
    2. Flotasyon banyo ultrasaf su ile doldurun ve ısı 38 ° C'ye ayarla
    3. Yeni bir bıçak üzerinde döner bir microtome ve mum blok bıçak yüzleri ve dikey düzlemde hizalanmış blok microtome chuck yerleştirin.
    4. Blok dikkatle bıçakla yaklaşım ve konumlandırma doğru olduğundan emin olmak için birkaç ince kesitler kesti; gerekirse ayarlayın.
    5. 3 µm kalınlığında bölümleri kestim.
    6. Cımbız kullanarak bölümleri seç ve onları su banyosu yüzeyinde float.
    7. Su banyosu düzenli ve IHC/ISH cam slaytlara bölümleri seç.
    8. Slaytları bir rafa yerleştirin ve 45 ° C fırında gecede depolayabilirsiniz.
      Not: bir kez hazırlanan, TMA bölümleri içinde 24 h lekeli.
  2. Histochemical (H & E) Boyama gerçekleştirmek bir autostainer kullanarak.
    1. Slaytları autostainer rafa takın ve 10 dk 60 ° C'de yer onları.
    2. Autostainer ve TMA ile raf bir yük istasyonları dışa doğru bakan bir standart H & E klibi ile slaytlar ekleme yük çekmece açın.
    3. Bir kez çekmeceyi kapalı, klibi otomatik olarak sistem tarafından tanınması ve aşağıdaki protokol başlayacak: fırın istasyonunda 37 ° C (6 dk), Ksilen (2 dk), Ksilen (2 dk), etanol %100 (2 dk), etanol %100 (2 dk), etanol %95 (2 dk), etanol %95 (2 dk) , distile su (4 min), Carazzi'nın Hematoksilen (9 dk.), alçak basınç akan su (2 dk), Eozin %1 (1 dakika), alçak basınç akan su (2 dk), etanol %95 (20 s), etanol %95 (20 s), etanol %95 (20 s), etanol %95 (20 s), etanol %100 (15 s), etanol %100 (15 s) , Ksilen (30 s), Ksilen (30 s).
    4. Raflar çekmeceyi gelen numarayı boşaltıp bir kapak notu ile slayt monte.
      1. Bir pipet ile monte bir damla toplamak ve kapak slayt dış kenarındaki koydu.
      2. Islak yan kapak slip slayt üzerinde yerleştirin ve 30 dk için Kuru Dağı izin.
  3. ER, halkla ilişkiler, Ki67 ve HER2 için IHC boyama gerçekleştirmek otomatik bir immunostainer kullanarak.
    Not: Boyama koşuya başlamadan önce sistemi, başlatmak ve sarf malzemeleri reaktif şişe (Tablo reçetesi) kontrol ve kapsayıcılar atık.
    1. 10 dk 60 ° C'de çözümlenecek TMA slaytlar yerleştirin.
    2. İmmunostainer enstrüman ve yazılım başlatın.
    3. Giriş Görünümü, iletişim kuralları düğmesini tıklatın ve Oluştur/Düzenle iletişim kuralları'ı tıklatın.
    4. Standart DAB seçin (3, 3'-diaminobenzidine) IHC yordamı temel şablonunu değiştirmek için.
    5. "Deparaffinization" kutu listesinde bayrak ve 72 ° C'de orta sıcaklık ayarla
    6. Cc1 maskesinin çözüm bayrak, orta sıcaklığı 95 ° C ve kuluçka saat 36 dk olarak belirlenmiştir.
    7. Birincil antikor kutusu bayrak (araç yazılım dağıtıcısı reaktif atlıkarınca üstünde-ecek tanımak) ER satır içi Dağıtıcı kimliği eklemek ve kuluçka saat 16 dk az ayarla.
    8. Counterstaining kutusu bayrak, Hematoksilen seçin ben ve set 12 dk kuluçka anda.
    9. "Farklı Kaydet" düğmesini tıklatın ve protokolün adı.
    10. Adımları 3.3.3-3.3.9 kullanarak aşağıdaki birincil antikorlar kuluçka kez kalan antikorlar için yineleyin: PR 16 dk, Ki67 16 dk ve HER2 12 dk. önceden seyreltilmiş için kullanıma hazır (RTU) antikorları kullanın.
    11. Giriş Görünümü etiket Oluştur düğmesini tıklatın.
    12. İletişim kuralları düğmesini tıklatın ve ER, halkla ilişkiler, Ki67 ve HER2 iletişim kuralları her TMA analiz etmek için ekleyin.
    13. Yakın /Print düğmesini tıklatın.
    14. Etiket şablon açılır gibi TMA kimlikleri etiketini girin.
    15. Etiketleri yazdırmak ve ardından onları TMA slayta uygulamak için Yazdır düğmesini tıklatın.
    16. Araç simgesini tıklatın ve araç başlangıç modunu "Hazır" olarak ayarlayın.
    17. Reaktifler atlıkarınca kapsar başlık açmak, algılama sistemi yerleştirin ve birincil antikorlar, başlık kapatın.
    18. Bir slayt çekmece açmak, TMA slaytlar yük ve aynı düğmesini tıklatarak çekmeceyi kapatmak için açık düğmesini tıklatın.
    19. Olarak "çalışan" enstrüman başlangıç modunu ayarlayın ve yönergeleri izleyin.
    20. TMA tamamlanan slaytlar düğmesini slayt denetim cihazda ve durulama açık tüm Çekmeceli basarak slayt çalışma, unload sonunda onları içinde kalan herhangi bir reaktifler kaldırmak için sabunlu su sıcak.
    21. Slaytları düşük basınçlı soğuk akan suyun altında yıkayın, TMA slaytlar kurutmak ve cam coverslip her slayta uygulamak.
  4. ER, halkla ilişkiler ve HER2 IHC analizini gerçekleştirmek Amerikan Derneği, klinik Onkoloji (ASCO) takip / kep yönergeleri ve Ki67 meme kanseri çalışma grubu (Tablo 2) Uluslararası Ki67 önerilerine göre.
    Not: Bu analiz ayrı ayrı ayrı doku sıralarda meme patoloji bir deneyimi olan bir patolog tarafından gerçekleştirilmelidir.
    1. ER ifade ≥ % 1'tümör hücre çekirdeği immunoreactive20,21,22,23ise pozitif olarak değerlendirmek.
    2. PR ifade ≥ % 1'tümör hücre çekirdeği immunoreactive20,21,22,23ise pozitif olarak değerlendirmek.
    3. HER2 ifade olarak değerlendirmek: a) puanı 3 + Eğer çevresel membran tam ve yoğun, boyama b) puanı 2 + çevresel membran boyama eksik ve/veya zayıf/orta ise ve > %10 invaziv tümör hücreleri veya tam içinde ve çevresel membran boyama yoğun ve ≤ % 10 içinde invazif tümör hücrelerinin c) 1 + eksik membran boyama zayıf/ancak algılanabilir ise ve invaziv tümör hücrelerinin d > %10 içinde puan) hiçbir boyama varsa negatif veya membran Boyama eksik ve zayıf/ancak algılanabilir ve ≤ içinde invazif tümör yüzde 10'u3,24hücreleri.
    4. Nükleer en az 1.000 neoplastik hücrelerde rasgele boyama ile hücre yüzdesi üzerinde 10 yüksek güç alan (büyütme, 400 X) seçilen olarak Ki67 dizin değerlendirmek25.

4. HER2 SISH analizi

  1. TMA bölümler (adımı yineleyin 3.1) kesti.
  2. Otomatik bir immunostainer kullanarak SISH HER2 için gerçekleştirin.
    1. 10 dk 60 ° C'de çözümlenecek TMA slaytlar yerleştirin.
    2. İmmunostainer enstrüman ve yazılım başlatın.
    3. Giriş Görünümü, iletişim kuralları düğmesini tıklatın ve Oluştur/Düzenle iletişim kuralları'ı tıklatın.
    4. Temel şablonunu değiştirmek için "U çift ISH CKT" yordamı seçin.
    5. Kutu listesinde "Kurutma" bayrak ve 20 dk 63 ° c sıcaklık ayarla.
    6. "Hücre Merkezi Klima" kutusu listesi, o zaman "hücre Merkezi Klima CC2", bayrak ve 4 dk. 86 ° C ve kuluçka zaman sıcaklığı ayarlamak.
    7. CC2 hafif (döngüsü 1), standart (döngüsü 2) ve genişletilmiş (döngüsü 3) 8 dk, 12 dk ve 8 dk için sırasıyla bayrak.
    8. Kutu listesinde "Ish-proteaz 3" bayrak ve kuluçka saat 16 dk az ayarla.
    9. HER2DNP ve CHR17DIG sondalar seçin ve kuluçka süresi 6 h olarak ayarlayın.
    10. 8 dk. 76 ° C'de yıkama ayarlayın.
    11. SISH multimer (SIL ISH DNP HRP) kuluçka saat 32 dk az ayarla.
    12. Gümüş Kromojen (SIL ISH DNP CHRC) kuluçka süresi 4 dk ayarlayın.
    13. Kırmızı multimer (kırmızı ISH KAZMAK AP) kuluçka süresi 24 dk az ayarla.
    14. Kırmızı Kromojen (kırmızı ISH KAZMAK FR) kuluçka süresi 8 dk ayarlayın.
    15. Bayrak "Counterstaining" kutu listesindeki "HEMATOKSİLEN II" seçin ve kuluçka süresi 8 dk ayarlayın.
    16. Bayrak "Counterstaining" kutu listesinde sonrası "MAVİLEŞTİRME reaktif" seçin ve kuluçka süresi 4 dk ayarlayın.
    17. 3.3.11-3.3.15 gelen adımları tekrarlayın (select değiştirilmiş U çift ISH CKT Protokolü).
    18. Açık reaktifler atlıkarınca kapsar hood çamaşır ve ISH tespit sistemleri yer, o zaman başlık kapatın.
    19. 3.3.18-3.3.21 gelen adımları yineleyin.
  3. HER2için SISH çözümlemesi: HER2/CEP17 oranı ≥2.0 ile bir ortalama HER2 kopya numarası ≥4.0 sinyaller hücre başına ise HER2 gene amplifikasyon olumlu olarak değerlendirmek ve HER2/CEP17 oranı ise negatif < 2.0 ortalama HER2 numarasını kopyalayın < 4.0 sinyalleri/hücre3,24.
    Not: IHC benzer, bu analiz ayrı ayrı ayrı doku sıralarda meme patoloji deneyimi olan bir patolog tarafından gerçekleştirilmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, SISH çözümlemesi HER2 gen ve onun karşılık gelen şeması içinde heterogeneously işlenmiş meme kanserlerinin yüksek verimli ayarlayınca yapma laboratuvar stratejileri ayrıntılı olması. Bu yöntem düşük maliyetli ve HER2 gene amplifikasyon heterojenite büyük tabur meme kanserleri alındı formu patoloji arşivlerin incelenmesi için çoğu laboratuarlarında yürütülen olabilir.

Meme kanseri ve türdeş olmayan ifade tarafından oluşturulan zorluklar test klinik önemi HER2 nedeniyle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkarlarının çakışma var.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Surgipath ParaplastLeica Biosystems, Wetzlar, Almanya, AB39601006Doku gömme ortamı, 56 &°; C erime noktası
Eozin Y % 1 su çözeltisiBio Optica, Milano, İtalya, AB510002Eosin sarımsı, suda çözünür
Carazzi' s hematoksilenBio Optica, Milano, İtalya, AB506012Potasyum iyodat kullanılarak olgunlaştırılan şap hematoksilen
Elmas kalitesiLaboindustria, Arzergrande, İtalya, EU3353326x76 mm mikroskop slaytları
Leica CV DağıLeica Biosystems, Wetzlar, Almanya, AB14046430011slaytlarında butilmetakrilat polimerlerine dayalı, monomer içermeyen montaj ortamı
Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, ABDK8020kullanım için FFPE'nin yapışması için kaplamalı mikroskop slaytları
, Tucson, AZ, ABDN750-BMKU-FSSlayt boyama sistemi
ONAYLA anti-Östrojen Reseptörü (ER) (SP1) Tavşan Monoklonal Primer AntikorVentana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD790-4324Primer antikor, kullanıma hazır
ONAYLAYIN anti-Progesteron Reseptörü (PR) (1E2) Tavşan Monoklonal Primer AntikorVentana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD790-2223Primer antikor, kullanıma hazır
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Tavşan Monoklonal Primer AntikorVentana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD790-4286Primer antikor, kullanıma hazır
PATHWAY HER2 (4B5) Tavşan Monoklonal Primer AntikorVentana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD790-4493Primer antikor, kullanıma hazır
ultraView Evrensel DAB Tespit KitiVentana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD760-500Fare IgG, fare IgM ve tavşan birincil antikorlarını tespit etmek için dolaylı, biyotin içermeyen sistem
INFORM HER2 Çift ISH DNA ProbuKokteyli Ventana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD780-4422INFORM HER2 Dual ISH testi - Meme kanseri hastalarında HER2 gen durumunu belirlemek için çift renkli in situ hibridizasyon FDA onaylı otomatik test 
ultraView Silver ISH DNP Tespit KitiVentana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD800-098
ultraView Red ISH DIG Tespit KitiVentana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD800-505
ISH Proteaz 3Ventana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD780-4149ISH işleminde, ilgilenilen hedef DNA dizilerini çevreleyen proteini çıkarmak için kullanılır
HematoksilenVentana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD760-2021Modifiye Gill'in hematoksilen karşı leke reaktifi
Hematoksilen II Karşı boyamaVentana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD790-2208Modifiye Meyer'in hematoksilen karşı leke reaktifi
Bluing reaktifiVentana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD760-2037Cam slaytlar üzerinde hematoksilen lekeli bölümleri mavileştirmek için sulu tamponlu lityum karbonat çözeltisi
HybReadyVentana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD780-4409ISH tahlilleri için formamid bazlı tampon
EZ Prep (10x)Ventana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD950-102IHC ve ISH reaksiyonları sırasında doku örneklerinden parafin çıkarılması ve 1:10 seyreltilmesi için konsantre çözelti.
SSC Tampon (10X)Ventana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD950-110Sodyum Klorür Sodyum Sitrat tampon çözeltisi, sıkı yıkamalar ve boyama adımları arasında slaytları durulamak ve yerinde hibridizasyon reaksiyonları için stabil bir sulu ortam sağlamak için kullanılır. 1:5 oranında seyreltin.
ULTRA LCSVentana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD650-210IHC ve ISH reaksiyonlarında buharlaşmayı önlemek için sulu reaktifler ile hava arasında bir bariyer olarak kullanılan önceden seyreltilmiş (kullanıma hazır) lamel çözeltisi
Reaksiyon Tamponu (10x)Ventana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD950-300Tris bazlı tampon çözeltisi (pH 7.6 & plusmn; 0.2) IHC ve ISH sırasında boyama adımları arasında slaytları durulamak için. 1:10 oranında seyreltin.
ULTRA Hücre Koşullandırma (ULTRA CC2)Ventana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD950-223IHC ve ISH sırasında doku örneklerinin işlenmesinde ön işlem adımları. Kullanıma hazır.
ULTRA Hücre Koşullandırma (ULTRA CC1)Ventana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD950-224
ultraView Silver Wash IIVentana tıbbi sistemi, Tucson, AZ, ABD780-003IHC ve ISH boyama adımları arasında slaytları durulamak için kullanıma hazır çözelti
MikrotomLeica Biosystems, Wetzlar, Almanya, ABRM 2255Otomatik döner mikrotom
MultistainerLeica Biosystems, Wetzlar, Almanya, EUST 5020Otomatik boyama ve lamel işleme için iş istasyonu
Minicore 1Alphelys, Plaisir, Fransa, EU00-MICO-1TMA Designer 2 gömülü yazılım ile TMA konstrüksiyonu için yarı otomatik dizileyici
Aperio ScanScope CS2Leica Biosystems, Wetzlar, Almanya, EUK080254Görüntü yakalama cihazı - dijital patoloji tarayıcı
Tissue-Tek III Uni-CassetteSakura Finetek Europe B.V4135Kaset
Doku-Tek Paraform Standart Taban KalıbıSakura Finetek Europe B.V7055Paslanmaz Çelik ana metal kalıp
Ksilen FLEX IHC mikroskop IHC BenchMark ULTRA Ventana tıbbi sisteminde

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232 (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31 (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12 (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133 (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54 (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64 (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. 'Genetic heterogeneity' in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25 (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136 (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25 (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now? Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10 (12), e0144923(2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review. Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. , Eight, Springer International Publishing. (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. WHO Classification of Tumours of the Breast. , 4th, IARC press. (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14 (3), R93(2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Meme Kanseri Heterojenli iG m In Situ HibridizasyonDoku Mikro dizi Olu turmaFormalinle Sabitlenmi Parafine G m lmm nohistokimyasal AnalizHER2 Kromozom Say mTopografik Alan HaritalamaOtomatik mm nboyama Cihaz

İlgili makaleler