Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

Özet

Retina pigment epitel hücreleri hücre-replasman tedavisi için Kuru yaşa bağlı makula dejenerasyonu gelişmiş form olarak hizmet verebilir. Bu iletişim kuralı coğrafi Atrofi büyük gözlü modeli ve hastalık bu modeline insan embriyonik kök hücre kaynaklı retina pigment epitel hücrelerinin nakli subretinal nesil açıklar.

Özet

Coğrafi Atrofi (GA), Kuru yaşa bağlı makula dejenerasyonu geç aşamasında kaybı hayati retina yapıları (örneğin, photoreceptors) sonraki dejenerasyonu uzaklaşan retina pigment epitel (RPE) katmanın, karakterize neden şiddetli bozukluğu. Benzer şekilde, RPE kaybı ve görme keskinliği azalma görülür uzun süreli takip kadar intravitreal Anti-vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) tedavi gören hastaların gelişmiş ıslak yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ile. Bu nedenle, bir yandan, bu verimli bir şekilde RPE hücrelerinin replasman tedavisi hizmet verebilir bir sınırsız kaynak türetmek için esastır. Öte yandan, davranış ve entegrasyon-in hastalık gerektiren bir modeli türetilmiş hücrelerde cerrahi değerlendirmek önemlidir ve görüntüleme yöntemleri olarak bu insanlarda uygulanan mümkün olduğunca yakın. İnsan embriyonik kök hücre değerlendirilmesi retina pigment epitel hücreleri (hESC-RPE) türetilmiş için burada, GA preklinik bir model nesil açıklayan önceki yayınlarımızı dayalı ayrıntılı bir protokol albino tavşan göz kullanarak içinde sağlamak bir Klinik ayarı. Farklılaşmış hESC-RPE nakledilen saf gözler veya gözleri NaIO₃-GA gibi retina dejenerasyonu 25 G transvitreal pars plana tekniği kullanarak indüklenen. Değerlendirme dejenere ve Transplante bölgelerinden multimodal yüksek çözünürlüklü non-invaziv gerçek zamanlı görüntüleme tarafından gerçekleştirilir.

Giriş

Bu iletişim kuralı bir transplante hESC-RPE subretinal uzayda entegrasyonunu değerlendirilmesi sağlar coğrafi Atrofi (GA) büyük gözlü preklinik model nesil açıklar. HESC¹, yanı sıra dış retina hasar ve GA benzeri fenotip RPE hücrelerinin zenginleştirilmiş, saf ve fonksiyonel bir nüfusun üretim göstermek 3 son yayınlarda ayrıntılı olarak açıklanan yöntemleri kullanılmıştır fizyolojik tuzlu Çözümleri (Yani, BSS ve PBS) veya tavşan göz^2,3NaIO₃ subretinal enjeksiyonla indüklenen. Biz daha fazla alt retinal süspansiyon nakli hESC-RPE, kapsamlı işlevsel monolayers photoreceptor kurtarma kapasitesi²formu gösterdi.

Çeşitli yararları GA manken hastalığı nesil tavşan göz kullanımına eşlik. İlk olarak, boyutu tavşan göz hangi yetişkin bir insan gözü hacmi % 70 's, klinik olarak anlamlı nakli rutin olarak küçük kemirgen gözler (1000 hücre/µL vs 50.000 hücre/µL)⁴ ' te kullanılan çok daha bir hücre yoğunluğu kullanarak verir ^{, 5}. ikinci olarak, kemirgenler genellikle transscleral retina bariyeri ödün vermez ve potansiyel bir enflamatuar yanıt ve mümkün ret⁶tetikler koroid aracılığıyla ameliyatta. İki faktör birlikte multilayering ve Transplante hücrelerinin ve kesintiye yerli retina mendil transplante hücrelerde genel zayıf bir entegrasyon topaklanma neden olabilir. Ancak, büyük gözlü tavşan modeli bir cerrahi teknik klinik bir ayarı için aynı araçları ile performans sağlar. Üçüncü olarak, büyük gözlü manken de görüntüleme ve Transplante hücrelerin ve üstteki retina ile zaman^1,2,3izleme yüksek çözünürlüklü vivo içinde verir. Böylece, kemirgenler normal ve hastalıklı retina ve alt retinal uzay araştırma ilgi olan herkes için cazip bir alternatif olması gereken bir klinik olarak ilgili ve maliyet-etkin preklinik modeli açıklar.

Protokol

Aşağıdaki iletişim kuralı Karolinska Instituet hayvan bakımı kuralları izler. Yeni Zelanda albino tavşan (Tablo reçetesi) kullanarak tüm hayvan deneyleri bölgesel hayvan Etik Komitesi (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) tarafından onaylanmış olan (izin: dnr 56/15). HESC (dnr 2011/745-31/3) kullanımı ve transfer ve hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) manipülasyon da İsveçli mevzuat ve Karolinska Institutet düzenlemelere uygun şekilde ve bölgesel insan Etik Komitesi (tarafından onaylandı Regionala Etikprövningsnämnden ben Stockholm).

1. sodyum iyodat (NaIO₃) subretinal enjeksiyon büyük gözlü hayvan modeli içine

1. 35 mg/kg ketamin karışımı ile uyluk kas içi yönetiminde ve tuz 30 G şırınga kullanarak 5 mg/kg xylazine hayvanları anestezi ve öğrenciler topikal göz damlası % 0.75 cyclopentolate ve % 2.5 phenylephrine bir karışımını kullanarak genişletmek. Uygun anesthetization doğruladı Eğer hayvan arka bacağını zor bir tutam tepki vermez.
2. Cerrahi mikroskop altında tavşan ile baş cerrah (şekil 1A) karşı karşıya koyun. Bir kapak Retraktörü göz kapakları ve nictitans membran bulaşma riskini en aza indirmek için bir steril bezle kaldırmak için kullanın. Kullanımı dengeli tuz solüsyonu (BSS) altında anestezi sırasında her iki gözde kuruluk önlemek için.
3. Mikrocerrahi, 2 bağlantı noktasını kullan (veya isteğe bağlı 3-bağlantı noktası) için 25 G transvitreal pars plana tekniği ile mikrocerrahi aletleri (şekil 1B) ekleme için Vanalı sigara trocars. Çok işlevli vitrektomi makine bir infüzyon kanül, endoillumination, vitrector ve endolaser bağlanmak için bağlantı noktası yok. Subretinal enjeksiyonlar için sadece endoillumination 2-liman set-up yeterli kılan, zorunludur. Endoillumation üst sol trokar yerleştirebilir ve üst sağ trokar subretinal enjeksiyon kanül için kullanabilirsiniz.
   1. 3-port kurulum için daha düşük zamansal trokar BSS infüzyon kanül için kullanın. (Örneğin vitrector) isteğe bağlı aygıtlar olup olmadığını kullanılan, bunları üst sağ trokar ekleyin.
   2. Üst 2 trocars 1-2 mm kapmak ve ekleme sitesi örten konjonktiva yerinden pençeli forseps kullanarak limbus ekleyin.
   3. Trocars eklenen transsclerally 30-45 ° limbus paralel açı ve trokar ucunu ortasına kadar devam emin olun. Sonra 90 ° trokar dönüp gözün arka kutbunda amaçlayan göz içine ilerlemek. Bu yordam sclerotomies üzerinden ameliyat sonrası kaçağı önlemek ve aynı zamanda endoftalmi (Yani, bakteriyel enfeksiyon göz) riskini azaltmak. Ayrıca şekil 2B trokar pozisyonlar için bkz.
   4. Tek kişi kullanımlı düz kontak lens kornea göz ve Kontakt lens (şekil 1A) arasında iletişim jel olarak sentetik gözyaşları ile retina görselleştirmek için koymak.
   5. Bir uzatma tüpü (yardımcı tarafından işletilen) bağlı bir 1 mL şırınga ve bir 38 G polytip kanül (cerrah tarafından işletilen) içine NaIO₃ 500 µL çizin.
   6. Endoillumination sonda aracılığıyla üst sol trokar ve enjeksiyon kanül aracılığıyla üst sağ trokar yerleştirin ve optik sinir başı altındaki alanda yönelik retina doğru vitreus uzayda kanül ilerlemek.
   7. Odak bir beyazlatma görünene kadar yavaş yavaş retina dokunmak kanül ucu izin. Enjeksiyon kendisi subretinal teslimat için izin retina, nüfuz. Bu kanama neden olabilir beri retina, nüfuz kanül izin vermeyin.
   8. 50 µL NaIO₃ subretinally 5 s dönemde enjekte et. Doğal göğüs arası uçak retina ve alttaki koroid arasında olduğundan, açıkça görülebilen bir yarı saydam bleb enjeksiyon sırasında yavaş yavaş oluşturmalıdır.
   9. Enjeksiyon sırasında yavaş yavaş iğne geri çek, ama belgili tanımlık uç reflü en aza indirmek için bleb içinde korunur emin olun.
   10. Sonra endoillumation ve enjeksiyon kanül kaldırılması, pençeli forseps kullanarak trocars kaldırın ve 30 için hafif basınç uygulamak için belgili tanımlık uç veya künt sonuna forseps kullanarak kendinden contalı dikiş daha az sclerotomies s.
4. Post-surgically 10 mL subkutan su kaybı önlemek için tuz verin. Ameliyat sonrası topikal steroid veya antibiyotik vermek değil. Ağrı kesici için ameliyattan sonra 0.5 mL buprenorfin 0.3 mg/ml subkutan sonra cerrahi, hem de gün ver.
5. Onları birkaç saniye için öncelikle % 70 etanol, ikincisi % 45 etanol içinde çeker tarafından tüm aletleri kullanımdan sonra yıkama ve son olarak içinde distile su. Onları düzgün bir kağıt havlu ile kurulayın.
6. Onlar yeterli kendine gelmek ve onları tek tek encaged yere kadar hayvan katılmak. (Örneğin, immünhistokimya amaçlar için) gerekirse, hayvanlar 100 mg/kg Fentobarbital intravenöz enjeksiyon tarafından ötenazi ( Tablo malzemelerigörmek).
7. HESC-RPE hücrelerinin nakli ile devam etmek için 7 gün bekleyin.

2. subretinal nakli hayvanlarda tedavi hESC-RPE hücrelerinin

1. 1-2 mm den daha düşük zamansal kadranda limbus hESC-RPE nakli önce 1 hafta eklenen 30 g enjeksiyon iğne kullanarak imzalat hayvanlarda intravitreal triamsinolon, 2 mg (100 µL) yönetmek ve 3 ayda yeniden yönetmek. İpucu bir objektif dokunmatik önlemek için göz arka direğe doğru işaret etmek emin olun.
2. ¹daha önce açıklandığı gibi bir hESC-RPE monolayer kültür.
3. 24-şey Konfluent hESC-RPE monolayer hücre farklılaşması medya (bkz. Tablo reçetesi) kaldırın ve her yıkama PBS 500 µL Ca^{2 +} ve Mg^{2 +}olmadan ile iyi. Bir kez daha, bu eylem 2 yıkama toplam için yineleyin.
4. Süpernatant atmak, tripsin iyi başına 500 µL eklemek ve 37 ° C'de 12 dk için kuluçkaya
5. Plaka eğilme ve tripsin (hücreleri plakasına bağlı kalmalıdır) dikkatli bir şekilde çıkarın. Taze 37 ° C prewarmed farklılaşma medya 800 µL hücrelerde nazik pipetting veya hatta bir tek hücre süspansiyon elde etmek için gerekirse, kazıma toplamak.
   Not: Hücre kümeleri gözlenen bir 40 µm hücre süzgeç kullanın.
6. % 0,2 kullanarak hemasitometre odasında hücreleri hesaplama Trypan mavi, üreticinin yönergelerine göre.
7. Farklılaşma medya ve santrifüj hücreleri, oda sıcaklığında, 300 x g 5 min için 5 mL ekleyin.
8. Süpernatant atın ve Pelet taze filtre sterilize PBS 1000 hücre/µL son bir konsantrasyon (bir 25 mm şırınga filtreden geçirilen) içinde resuspend.
9. Aliquot önceki hücre süspansiyon 600 µL aliquots ve buz kadar ve ameliyat sırasında üzerinde tutun.
10. Tuz 30 G şırınga kullanarak 35 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg xylazine karışımı ile uyluk kas içi yönetim tarafından hayvanların anestezi. Öğrenciler topikal göz damlası % 0.75 cyclopentolate ve % 2.5 phenylephrine amix kullanarak genişletmek. Uygun anesthetization doğruladı Eğer hayvan arka bacağını zor bir tutam tepki vermez.
11. Tavşan ile baş cerrah bakacak şekilde yerleştirin. Bir kapak Retraktörü göz kapakları ve nictitans membran bulaşma riskini en aza indirmek için bir steril bezle kaldırmak için kullanın. BSS kuruluk anestezi sırasında her iki gözde altında engellemek için kullanın.
12. Mikrocerrahi, 2 bağlantı noktasını kullan (veya isteğe bağlı 3-bağlantı noktası) için 25 G transvitreal pars plana tekniği ile trocars adım 1.3 ve Şekil 2' de açıklandığı gibi aynı pozisyonda yerleştirilir. Önceki sclerotomies görünür durumdaysa, trokar ekleme sadece bitişik gerçekleştirmek ancak ameliyat sonrası kaçak riskini en aza indirmek için bunlar aracılığıyla.
    1. Tek kişi kullanımlı düz kontak lens kornea göz ve Kontakt lens (şekil 1A) arasında iletişim jel olarak sentetik gözyaşları ile retina görselleştirmek için koymak.
    2. (Bkz: adım 1.3.5 ve 1.3.6) konumlandırma uygun ucu sonra hafifçe karışık hESC-RPE süspansiyon (50.000 hücreleri), 50 µL subretinally enjekte. Karakteristik "metal" endo-aydınlatma refleks tarafından seçkin NaIO ön işleme₃ alanının için amaç. Neurosensory retina kolayca açıkça görünür bleb oluşturma ayrı olmalıdır. Tavşan/sonra steril H₂O arada iğneyle kullanın iğne nedeniyle hücre tıkanmasını önlemek için floş kümeler. Değişikliği ne zaman tıkanma iğneyi fark ettim.
    3. Enjeksiyon sırasında yavaş iğne geri çek ama ucu reflü en aza indirmek için bleb içinde korunur emin olun.
    4. Sonra endoillumation ve enjeksiyon kanül kaldırılması, pençeli forseps kullanarak trocars kaldırın ve 30 için hafif basınç uygulamak için belgili tanımlık uç veya künt sonuna forseps kullanarak kendinden contalı dikiş daha az sclerotomies s.
13. Post-surgically 10 mL subkutan su kaybı önlemek için tuz verin. Ameliyat sonrası topikal steroid veya antibiyotik vermek değil. Ağrı kesici için ameliyattan sonra 0.5 mL buprenorfin 0.3 mg/ml subkutan sonra cerrahi, hem de gün ver.
14. Onları birkaç saniye, öncelikle % 70 etanol, ikincisi % 45 etanol içinde çeker tarafından tüm aletleri kullanımdan sonra yıkama ve son olarak içinde distile su. Onları düzgün bir kağıt havlu ile kurulayın.
15. Onlar yeterli kendine gelmek ve onları tek tek encaged yere kadar hayvan katılmak. (Örneğin immünhistokimya amaçlar için), gerekirse 100 mg/kg Fentobarbital intravenöz enjeksiyon tarafından hayvanlara ötenazi.

3. in Vivo retina ve Subretinal görüntüleme

1. Spektral etki alanı optik Koherens tomografi (SD-Ekim) aygıt ile birlikte verilen yazılımı kullanın (kesitsel b-taranmasını üreticinin yönergelerine uygun tedavi hayvanlar elde etmek için malzemeler tablo bkz:). Görüntü bulanık önlemek için her 30-60 s topikal serum temizlenerek kornea nemli tutmak emin olun.
   1. Engelsiz bir yol enstrüman ışık kaynağından tavşan retina elde etmek için ayarlanabilir bir Mount (bkz. Adım 1.1 ve 2.10) imzalat ve öğrenci büyümüş hayvanlar koyun.
   2. En az 3 OCT taramaları ile eşzamanlı kızılötesi confocal tarama lazer ophthalmoscopy enjekte alanının üst, orta ve alt kısmını temsil eden (IR-cSLO) yansıma referans görüntü elde.
   3. Tr-yüz cSLO mavi, yeşil, kızılötesi ve çok renkli yansıma (Yani, birden çok eşzamanlı lazer renk), sırasıyla lazer ile fundus görüntü elde.
   4. Mavi ışık autofluorescence (BAF) SD-Ekim cihazın mavi ışık lazer özelliği kullanarak çekim.

Sonuçlar

BAF, IR-cSLO ve SD-Ekim normal albino tavşan retinanın temsilcisi vivo içinde görüntülerini Şekil 2' de gösterilmiştir. SD-Ekim enstrüman tarafından yakalanan ışık yansıması farklı düzeylerinin farklı retina katmanlarla unutmayın.

Şekil 1A ve şekil 1Balt retinal blebs oluşturmak için kurulum resimli: 3 trocars (

Tartışma

Bu protokol için hESC-RPE Tümleştirme vivo içinde değerlendirmek için büyük gözlü manken GA ve preklinik kullanımı nesil açıklanmıştır.

Rejeneratif terapileri için çeviri GA ve ilgili hastalıklar için klinik⁷içine, geliştirmek ve sadakatle nakli ve görüntüleme için klinik yöntemleri yakalama yöntemleri optimize etmek önemlidir. Tavşan bu açıdan çekici olduğunu: göz içi cerrahi ve kullanımını standart görüntüleme izni nispeten büyük bir göz vardır ve diğer büyük...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
NutriStem hESC XF farklılaşma ortamı – bFGF ve – TGFb	Biyolojik Endüstriler	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS, Ca2+ ve Mg2+	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
Hücre süzgeci 40 & mu; m Naylon	VWR	732-2757
İğne 30 G 0.5' ’; 0,3 mm x 13 mm	BD Microlance	304827
Acrodisc 25 mm Şırınga Filtresi	Acrodisc	PN4612
%0,4 tripan mavisi	ThermoFisher Scientific Corp	15250061	%0,2
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
%70 Etanol	Solveco'da kullanın AB	1047
Ketaminol, 100 mg / mL	Intervet, Boxmeer	511519	Kullanımı 35 mg / kg ketamin
Rompun vet, 20 mg / mL	Bayer Hayvan Sağlığı	22545	5 mg / kg ksilazin
Triescence, 40 mg / mL	Alcon Nordic A / S	412915	2 mg intraviterial
Siklopentalat-fenilefrin,% 0.75 +% 2.5	APL	321968	Her göze
Viscotears	Laboratoires Thé a	597562
Topikal	salin Apotea AB	7053249369080
Allfatal vet. 100 mg / mL	Omnidea	77168	100 mg / mL pentobarbital
kullanın Uzatma tüpü (Çekiç)	MedOne Surgical Inc	3223
25 G / 38 G politip subretinal kanül	MedOne Surgical Inc	3219	25 G / 38 G
Tek Kullanımlık Düz Lens	Volk
Barraquer Colibri kapak ekartörü	AgnTho'nun AB	42-020-030
Valfsiz trokarlar	Alcon Nordic A/S	8065751448
Pençeli forseps	Bausch & Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrektomi makinesi	Alcon Nordic A/S	8065740238
Accurus 25+ Ölçer Vitrektomi TotalL Plus Pak	Alcon Nordic A/S	8065751493
SD-OCT cihazı	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+OCT	Heidelberg Eye Explorer sürüm 1.9.10.0'ı kullanın
24 kuyulu plakalar	Sarstedt	83.3922
Neubauer hemositometre	VWR	631-0925
Yeni Zelanda albino tavşanları	Lidkö pings Tavşan Çiftliği, İsveç
hESC-RPE hücreleri			Referans numarasına bakın 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml	Dechra	660500	Deri altından 0.5 mL buprenorfin kullanın