Yöntem makalesi

Toplama ve mesleki hava örnekleri çıkarma mantar DNA analizi için

12.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56730

⸱

2 Mayıs 2018

 ,  , 
1Allergy and Clinical Immunology Branch, Health Effects Laboratory Division, National Institute for Occupational Safety and Health, Centers for Disease Control and Prevention

Bu makalede

Özet

Bir ortam içerisinde mantar çeşitlilik belirleme iş sağlığı çalışmalarda sağlık tehlikeleri tanımlamak için kullanılan bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı DNA çekme--dan amplifikasyon ve sıralamanın mantar Its bölgeler için mesleki hava örnekleri açıklar. Bu yaklaşım geleneksel değerlendirme yöntemleri tarafından göz ardı edilebilir birçok mantar türleri algılar.

Özet

Kültür ve mikroskopi tabanlı yaklaşımlar gibi mesleki ortamlarda mantar Etkilenmeler tanımlama geleneksel yöntemleri birçok türü dışlanması sonuçlandı çeşitli kısıtlamalar bulunmaktadır. Son yirmi yılda alanındaki gelişmeler iş sağlığı araştırmacılar mantar tehlikeleri tanımlamak için moleküler tabanlı yaklaşımlara açmak için açmıştır. Bu yöntemler geleneksel yöntemlerle tespit değil kapalı ve mesleki ortamlarda birçok türün algılama sonuçlandı. Genomik DNA ekstraksiyon, güçlendirme, sıralama ve taksonomik tanımlaması mantar iç hava içinde mantar çeşitlilik belirlemek için bir yaklaşım örnekleri bu protocol detayları Rondela (ITS) bölgeleri transkripsiyonu. Sıralama sonuçları algılanan veya kültür veya mikroskobu kullanarak tür seviyeye tespit etmek zordur birçok mantar türünün bulunması. Bu yöntemler mantar yükünün nicel ölçüleri sağlamak değil, onlar tehlike tanımlama için yeni bir yaklaşım sunuyoruz ve Genel türler zenginliği ve çeşitlilik mesleki bir ortam içerisinde belirlemek için kullanılan.

Giriş

Kapalı ve mesleki ortamlarda mantar Etkilenmeler Alerjik Sensitizasyonu ve astım1gibi solunum morbiditeler içinde sonuçlanabilir. Mantar tehlikeleri tanımlaması risk değerlendirilmesi ve işçi pozlama önlenmesi için önemlidir. Bu mantar tehlikeler kapalı kirlenme, açık hava saldırı veya mantar malzemeleri nakliyesi işçilerin mevcut2nerede alanlara neden çevre bozuklukları sonucu olabilir. Mantar değerlendirmek için yöntemler mikroskobik mantar sporları tanımlaması yanı sıra uygun kültür örnekleme dahil ettik. Bu yaklaşımlar çeşitli sınırlama vardır ve sık sık gözden kaçırmak için genel olarak mantar yük3katkıda birçok mantar türü. Kültür tabanlı yaklaşımlar sadece besin medyada ekili uygun bu mantar organizmalar ayırt edebilir. Mantar sporları türler düzeye mikroskobu ile tanımlayan benzer türleri Morfoloji paylaşımı sporlar tarafından şaşırmış. Her iki yöntem son derece analiz ve birçok kalan tanımlanamayan mantar türleri, belirlemek için mycologists bağlı.

Mesleki tehlike tanımlama ve pozlama Değerlendirmeler kullanılan mevcut metodolojiler üzerine geliştirmek için pek çok araştırmacı moleküler tabanlı teknolojileri kapatmış. Mikrobiyal çeşitlilik kapalı ve mesleki ortamlarda değerlendirmek için yaklaşımlar dayandırılmış mikroskobu ve uygun kültür3,4 gibi yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha geniş bir spektrum karşılaştı mantar türlerinin ortaya koymuştur ,5. Burada sunulan yöntem iş ortamları hava örnekleme ve potansiyel mantar tehlikeleri tanımlanması için genomik DNA ekstraksiyon açıklar. Tehlike tanımlama nükleer ribozomal iç kopya etmek rondela veya Its, mantarlar arasında değişkendir ve sık mantar türleri6,7ayırt etmek için kullanılmış olan bölgelerin sıralama tarafından gerçekleştirilir, 8,9. Birçok canlı türünün uygun kültür olarak tanımlanabilir Bazidyumlu mantarlar, türe ait bazı türler değildir gibi mesleki ayarlarında buldum ve mikroskobik ayırt etmek zordur. Bu mantarlar sıralama mantar Its bölgeleri3,4,10tarafından değerlendirildi kapalı ve mesleki ortamlarda yüksek göreli bolca gözlenmiştir. KENDİ sıralama içine kapalı ve mesleki ortamlar içinde karşılaşılan mantarlar çeşitliliği daha fazla bilgi sağlamıştır.

Protokol yöntemleri toplamak, hulâsa ve bioaerosols dizi analizi için mantar Its bölgelerden yükseltmek için kullanılan ayrıntılarını tanımlamak burada. Bu yaklaşım hava parçacıkları toplamak mesleki güvenlik ve Sağlık (NIOSH) iki aşamalı Siklon sprey örnekleyici Ulusal Enstitüsü kullanır. Bu örneği bioaerosols ve ayrı solunabilir (≤4 µm aerodinamik çapı) toplamak için geliştirilmiştir ve solunabilir sigara (> 4 µm aerodinamik çapı) çoğu kapalı ortamlarda mantar organizmalar tanımlanması için sağlar parçacıklar işçi11tarafından inhale muhtemeldir. Siklon numune, dahil olmak üzere diğer hava numune parçacıklar solunabilir Aralık içinde toplamak için yeteneği var piyasada bulunan (< 4 µm) kullanarak filtre12,13. Buna ek olarak, NIOSH iki aşamalı Siklon sprey örnekleyici mantar türleri içine aşağı akım uygulamaları14için hemen işlenebilir tek kullanımlık, polipropilen borular üzerinde aerodinamik kendi çapı göre ayırır.

Genomik DNA ayıklanması ve mantar Its bölgeleri yükseltecek işlemlere bu protokol için ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Memeli hücre, bakteri veya özellikle Mayalar15birçok ticari kitleri hedef olarak sunulan çıkarma yöntemleri mantar ve bakteri, genomik DNA'ın çıkarılması için özel olarak geliştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan astar mantar onun 1 ve onun 2 bölgeleri4,5genel onların kapsama göre seçilir. Bu bölgelerin sıralama çok banked ITS dizileri de dahil olmak üzere, karşılaştırma için o dizi onun 1 bölge, onun 2 bölge veya onun 1 ve onun 2 bölgeleri sağlar. Hava örnekleri mantar çeşitliliği bir kapalı ayarı bu yöntemleri gösterilir, Ascomycota ve Bazidyumlu mantarlar kültürlenebilen yerleştirilen dizileri yanı sıra diğer serileri gibi daha az baskın mantar kültürlenebilen için ait önemli sayıda açığa kullanarak toplanan Zygomycota. Bu yaklaşımı kullanarak tanımlanan mantar sıralarının geniş çeşitlilik ekimi veya mikroskobu gibi geleneksel tehlike tanımlama yöntemlerini kullanarak esir edilemeyen değil. Mantar Its bölgelerin sıralama mantar tehlikeleri tanımlamak ve daha iyi kapalı ve mesleki mantar pozlama anlamak için izin vermek için gelişmiş bir yöntem sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hazırlanması NIOSH aerosol örnekleyici

Not: NIOSH aerosol örnekleyici iki aşamalı Siklon sprey örnekleyiciyi iki örnekleme tüp ve politetrafloroetilin (PTFE) filtresi kullanarak bioaerosols toplar var.

  1. Montaj önce örnekleyiciyi dikkatle inceleyin. Emin olmak için örnekleyici zarar görmediğinden, yer ve rahat olarak tüm vidaları vardır ve sızdırmazlık bandı dikiş çevresinde oluşan iki tarafından kontrol yarıyı da olduğu gibi. Örnekleyici O-ring herhangi bir rumuz, çatlak ya da gözyaşı ve silikon yağı ile çok hafif bir kaplama vardır yok emin olmak için kontrol edin.
    Not: Sampler polistiren veya polipropilen üç parçalı filtre kaset 37 mm 3 µm PTFE filtre içerir.
    1. Selüloz veya plastik filtre destek yastığı (ile filtreler dahil) temel parça gridded yüzeye yerleştirerek filtre kaset montajı (bkz. şekil 1). Filtresini pensler toplama yüzü yukarı bakacak şekilde filtre filtre destek yastık üstüne koymak için kullanın.
    2. El ile veya pnömatik basın kullanarak filtre kaset kapatın. El kapatma hava filtresi kaçak ve toplama etkinliğini azaltmak izin verir. Halka şeklinde parça (uzantısı baca şapkası) ekleyin ve basın sıkı ve eşit olarak aşağı doğru itin. Uzantısı baca şapkası filtre üzerine yeterince sıkı hava filtresi kaçak değil emin olmak için bastırın.
      Not: Kaset top parçası örnekleme sırasında kullanılan ancak örnekleme işlemi tamamlandıktan sonra filtre kapağı için kaydedilmesi gerekir.
    3. Örnekleyiciyi üst üzerine monte kaset uygun ve mümkün olduğunca aşağı doğru itin. 19 mm (3/4 inç) bant filtre kaset ve örnekleyici filtre kaset tutmak için ve sızıntıları önlemek için yedek bir mühür çalışacak şekilde dış çevresindeki bir parçası sarın.
    4. Her tüp sıkıca ve tam olarak bu diplerinde kadar örnekleyici ve sızdırmazlık bandı her tüpün etrafında sarma sızıntıları karşı ikinci bir mühür gibi davranmaya canı cehenneme.
      Not: İlk tüp, 15 mL polipropilen boru, solunabilir parçacıklar bir aerodinamik çapı ile toplar > 4 µm. İkinci tüp, bir 1,5 mL polipropilen microcentrifuge tüp 1 ve 4 µm arasında solunabilir parçacıkları toplar. Kalan daha küçük parçacıklar, < 1 µm, PTFE üzerinde toplanan vardır (bkz. Şekil 2) filtre.
  2. NIOSH örnekleyici ile her kullanımdan önce kalibrasyon kavanoz aracılığıyla hava filtreleri farklılıkları olarak kalibre ve numune olarak değişen hava akımı neden olur.
    1. Bir kalibrasyon kavanoz kullanmak için küp 's radarı uygun filtre kaset ekleyebilir, örnekleyiciyi kavanoza yerleştirin ve kavanoz mühür.
    2. Kalibrasyon kavanoz kalibrasyon debimetre ve örnekleme pompa bağlayın. Akış ölçer açmak ve bir kaç dakika boyunca ısınmak sağlar. Akış ölçer her zaman akış ölçer ve örnekleyici kirletici önlemek için onun giriş bağlı bir filtre olması gerektiğini unutmayın.
    3. Örnekleme pompa açmak ve ısınmak ve stabilize etmek üzere birkaç dakika çalışmasına izin vermek.
    4. 3.5 L/dak doğru akış oranını ayarlamak için pompa ayarlayın.
      Not: NIOSH aerosol örnekleyici için akış hızı genellikle 3,5 L/dak için ayarlanır. Bu akış hızı örnekleyiciyi solunabilir parçacık örnekleme16ACGIH/ISO ölçütlerini uygundur. Diğer akış oranları farklı kesim boyutları istenen veya gürültü düzeyini azaltmak için ama farklı bir Debi kullandıysanız, sonra örnekleyiciyi artık solunabilir örnekleme kriterlere uygun ki farkında olmak kullanılabilir.
    5. Kalibrasyon sona erdiğinde, pompa ve debimetre kapatın.

2. statik ve kişisel aerosol örnekleme

  1. NIOSH aerosol örnekleyici ya kişisel veya statik alan örnekleme için ayarlayın.
    Not: Bir tripod veya holding cihaza bağlı iken aerosol örnekleyici kullanarak statik örnekleme anlamına gelir (ne zaman örnekleme kişisel karşı (bkz. şekil 4) okudu kişi örnekleyici ve pompa monte edilmiş olarak, bkz. şekil 3).
    1. Statik alan örnekleme için belirli alandaki mümkün olduğunca yakın numune okudu tutmak. Numune hava girişleri, Oda girişlerinde ve hava akımı yolunda olabilir yerlerde uzak tutmak.
      Not: özellikle aerosol kaynak Oda17' ise Aerosol konsantrasyonları önemli ölçüde kısa mesafelerde bile değişebilir.
    2. Kişisel örnekleme için kişinin nefes bölgedeki örnekleyici ayarlayın. Yaka, omuz veya göğüs örnekleyiciyi ekleyebilir ve örnekleme pompanın bel veya bir sırt çantası içinde getirin.
      Not: Nefes bölge sık hava çoğunluğu inhalasyon17sırasında çizilen bir kişinin burun çevreleyen bir 30 cm Yarımküre olduğu varsayılır.
  2. Boru örnekleyici örnekleyici alıcılar uzak ve hiçbir şey alıcılar engellemekte veya hava akımı ile örnekleyici engel olun. Boru örnekleyici müstehcen veya sıkışmak gerekir değil. Herhangi bir tıkanıklık durdurmak pompa neden olur.
  3. Pompalar üzerinde açın. Bir ya da iki dakika sonra pompalar hala çalışıp çalışmadığını kontrol edin.
    Not: Kuralları hava bağlı olarak çevre10,18,19tam 8 h çalışma vardiyası için 10 dk kadar arasında değişen dönemleri için örnekleme. Şekil 6 ' da sunulan bir 60 dk örnekleme döneminden kapalı bir ortamda temsilcisi sonuçlarıdır.
  4. Hava örnekleme tamamlandıktan sonra örnek borular ve filtrenin toplamak. Sızdırmazlık bandı çıkarın, tüpler sökün ve onları kap. Yer süzgeci kaset filtre üzerinden üçüncü parçası. İşleme için hazır kadar örnekleri 4 ° C'de depolayın.

3. çıkarma genomik DNA'ın hava örnekleri

  1. Genomik DNA (gDNA) NIOSH BC251 örnekleyici her aşamasından ayıklayın. Koleksiyon tüpler örnekleme hava işlemek ve ayrı ayrı tayin edilmesi solunabilir ve solunabilir mikrobiyal aerosoller örnek izin vermek için filtre.
    Not: Alternatif olarak, üç aşamada olabilir kombine ve örnek inoculum çok küçük ise ayıklanır.
    1. Bir sınıf II biyolojik Emanet kabine veya laminar akım temiz tezgah, aseptik filtreyi kaldırın. Örnekleme kaset % 70 etanol ve meraklı örnekleme kaset açık bir kaset-açılış aracı kullanarak kullanarak Sil. Filtre ve destek yastığı yukarı itmek için bir filtre lifter kullanın. Filtre forseps kullanarak filtre kavramak ve içinde steril petri kabına yerleştirin. Filtrenin 6 eşit parçalar halinde kesilmiş ve 300 mg cam boncuk (0,2 - 0,5 mm) içeren bir takviye 2 mL tüp içinde koyun.
    2. 30 için sıvı azot filtre içeren tüp yer s ve hemen 4,5 m/s 30 için ayarlanan bir boncuk değirmen homogenizer yere koyun s.
    3. Filtre rendelenmiş kadar 3.1.2 bir veya iki kez tekrarlayın. Küçük parçalar halinde olduğu gibi filtre kalabilir. 0.5 mL lizis arabellek (4 M üre, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), pH 7,4) ekleyin.
    4. Lizis arabelleği 0.3 mL 15 mL ve 1,5 mL hava örnekleyici tüpler için ekleyin. Girdap 10-15 için tüp dik iken ve daha sonra başka bir 10-15 leri ters. Her tüpün içeriğini 300 mg cam boncuk içeren 2 takviyeli mL tüpler için aktarmak.
      Not: Her örnekleyici tüpte toplanan malzeme çoğunu tüp üst kısmında birikir.
    5. Boncuk değirmen homogenizer 4,5 m/s 30 s ve santrifüj için tüm tüplerde işlemek 20.000 x g 22 ° C'de 1 dk. için de onları Supernatants steril 1.5 mL microcentrifuge tüpler için aktarmak ve 20.000 x g 22 ° C'de 1 dk. için tekrar de tüpler santrifüj kapasitesi Bu adımı yineleyin.
  2. 30 µL lizis reaktif ekleyin (görmek Malzemeler tabloher boru ve tüpler için 15dk 37 ° C'de kuluçkaya için).
  3. Bağlama arabellek (10 M üre, 6 M guanidin-HCl, 10 mM Tris-HCl, %20 Triton X-100, pH 4.4) 0.2 mL ekleyin ve İndinavir K (100 µg/her boru ve tüpler için 10 dk. eklemek 100 µL her tüp isopropanol, 70 ° C'de kuluçkaya mL).
  4. Cam elyaf filtre tüpler (700 µL kapasite) 2 mL koleksiyonu tüplerde yerleştirilir içine özü çözümleri transfer ve 20.000 x g 30 için de koleksiyon tüpler santrifüj kapasitesi s 22 ° C'de Koleksiyon tüpler atın ve filtre tüpler yeni 2 mL koleksiyonu tüpler içine yerleştirin.
  5. İnhibitörü kaldırma arabellek (5 M guanidin-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6,6, % 38 etanol) 0.5 mL her tüpün ekleyin ve 20.000 x g 30 için de koleksiyon tüpler santrifüj kapasitesi s 22 ° C'de Koleksiyon tüpler atın ve filtre tüpler yeni 2 mL koleksiyonu tüpler içine yerleştirin.
  6. Yıkama arabellek (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5, % 80'i etanol) 0.5 mL her tüpün ekleyin ve 20.000 x g 30 için de koleksiyon tüpler santrifüj kapasitesi s 22 ° C'de Koleksiyon tüpler atın ve filtre tüpler yeni 2 mL koleksiyonu tüpler içine yerleştirin. Bu işlemi yineleyin.
  7. 20.000 x g 22 ° C'de herhangi bir kalıntı yıkama arabellek kaldırmak için ek bir 1 dk. için de koleksiyon tüpler santrifüj kapasitesi. Koleksiyon tüpler atın ve filtre tüpler yeni koleksiyon tüpler içine yerleştirin.
  8. Eklemek 100 µL sıcak (≥70 ° C) elüsyon arabelleğe (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) her tüp ve onları 1-2 dk. santrifüj için oda sıcaklığında 20.000 x g 30 için de koleksiyon tüpler kuluçkaya s 22 ° C'de Boş filtre tüpler bir steril 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve eluates 3,8 adımından yeniden uygulayın. 1-2 dk. santrifüj 20.000 x g 30 için de oda sıcaklığında kuluçkaya s 22 ° C'de
    NOT etmek-Ebilmek var kullanılmış Eluates hemen için adım 4 ya da saklı-20 ° c kadar kullanıma hazır. Genomik DNA için depolanan-20 ° C'de bir yıl kadar Uzun süreli depolama gerekirse DNA-80 ° C'de depolanması önerilir.

4. mantar ribozomal DNA amplifikasyon

  1. Evrensel mantar astar kendi bölgeleri 1 ve 2 den hulâsa gDNA yükseltmek için kullanın.
    Not: Bu iletişim kuralı için astar çifti Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') Its bölgeleri4,5en büyük kapsama sağlamak için kullanılır. O da tek başına, ITS1 ve ITS2 bölgeleri yükseltmek gibi diğer astar kümeleri kullanılabilir.
    1. Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) steril 0.5 mL PCR tüpleri veya 96-şey PCR plakaları onaylatılacak 50 µL reaksiyonlarda her örnek için aşağıdaki gibi ayarlayın: ayıklanan şablonu DNA (Adım 3), 5 µL 33,3 µL PCR sınıf su, 10 x PCR arabelleği 5 µL , 50 mm MgCl21.5 µL, 10 mM 2'-deoxynucleoside 5'-trifosfatlar arasında 1 µL, 0.5 µL 20 µM Fun18Sf ileri astar, 0.5 µL 20 µM ITS4R ters astar ve Taq DNA polimeraz 0.2 µL.
    2. Reaksiyonlar bir termal cycler gerçekleştirmek: denatürasyon 95 ° c 3 dakika; denatürasyon 6 döngüleri (96 ° C, 30 s) tavlama (50 ° C, 45 s) ve astar uzantısı (72 ° C, 3 dk); denatürasyon 20 döngüleri (96 ° C, 30 s), tavlama (50 ° C, 45 s) ve astar uzantısı (72 ° C, 1 dk); ve astar uzantısı için 10 dk. 72 ° C'de reaksiyon karışımları 4 ° C'de sonraki adım kadar.
  2. Silis zar bazlı arıtma seti kullanarak onaylatılacak PCR reaksiyonları arındırmak birleştirin.
    Not: Bu yordam PCR bileşenleri (astar, dNTPs, enzimler, tuzları, vb) ve diğer kirletici güçlendirilmiş DNA hazırlıklar üzerinden kaldırılması için izin verir.
    1. Her örnek (150 µL toplam) steril 1.5 mL microcentrifuge tüpler için üç reaksiyonlar birleştirin. Bağlama arabellek (5 M guanidin-HCl, % 30 isopropanol) 5 x birimi (750 µL) ve yukarı ve aşağı on kat pipetting tarafından çözüm karıştırın.
    2. 450 µL sütunlar koleksiyonu tüplerde yerleştirilen spin ve tüpler 17,900 x g, 30 s. atmak için filtrates santrifüj kapasitesi için karışımı ekleyin. Kalan 450 µL için sütunları ekleyin ve santrifüj kapasitesi 30 17,900 x g, s 22 ° C'de
      Not: Sütunlar için DNA adsorpsiyon için izin veren bir silika membran spin sütunlar içerir.
    3. Filtrates atmak ve 750 µL çamaşır arabellek (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, % 80'i etanol) spin sütunları ekleyin. 17,900 x g 30 için sütunları santrifüj kapasitesi s 22 ° C'de
      Not: Bu işlem yukarıda belirtilen PCR reaksiyon kirleticileri kaldırır.
    4. Filtrate atmak ve 17,900 x g 22 ° C'de 1 dk. için de boş sütunlar santrifüj kapasitesi
      Not: Bu adım aşağı akım uygulamaları ile girişime neden olabilir arabellek yıkama herhangi bir kalıntı kaldırmaktır.
    5. Spin sütunları steril 1.5 mL microcentrifuge tüpler için transfer. 45 µL elüsyon arabelleği (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dk. santrifüj tüpleri 17,900 x g 22 ° C'de 1 dk. için spin sütunları kuluçkaya
    6. Eluted DNA hemen adım 4 ve 5 için kullanmak veya kullanım için hazır kadar-20 ° C'de depolayın.
      Not:-Ebilmek var olmak stok amplicons için-20 ° C'de bir yıl kadar Uzun süreli depolama gerekirse DNA-80 ° C'de depolanması önerilir.

5. özel Jel Elektroforez kullanarak mantar Its amplifikasyon doğrulanması

  1. Döküm % 1'özel jel içeren 1 µg/mL arasında etidyum bromür. Özel 1 x Tris-asetat-EDTA (TAE) arabellek kaynar çözülür. Çözüm yaklaşık 50 ° C soğuduktan sonra etidyum bromür ekleyin ve döküm jel dökün.
  2. Özel jel katılaşmış sonra 1 jel bırakın x TAE ve amplicons üzerinde jel yüklenebilmesi için hazırlamak. İçin 8 µL güçlendirilmiş DNA'ın arabellek yükleme x 5 2 µL ekleyin.
    Not: Bu birimlere istenen yükleme arabellek konsantrasyonu bağlı olarak ayarlanabilir.
  3. Örnekleri, jel ile birlikte bir DNA merdiven boyutu başvuru için üzerine tüm 10 µL yükleyin. Jel 75 V at koşmak (6 V/cm) yaklaşık 90 dk için ve genellikle 750 arasında görülen bantları, görselleştirmek ve 1000 baz çifti, ultraviyole kullanarak ışık (bkz şekil 5).

6. sıralama ve mantar Its bölgeleri analizi

  1. Ayıklanan gDNA veya güçlendirilmiş mantar Its bölgelerde sıra ve mevcut ve uygun yöntemlerle dizileri çözümleyebilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bir ortam içerisinde tür Dağıtım hava örnekleri içinde tanımlanan her OTU klonları sayısı belirlenerek göreli bereket kullanarak tespit edilebilir. Şekil 6 hava örnekleme 60 dk takip kapalı bir ortam içerisinde taksonomik yerleştirilen türler temsil eden bir Kronu grafiğidir. Çevre türler içinde iki büyük mantar kültürlenebilen, Ascomycota ve Bazidyumlu mantarlar gibi türler türe Zygomycota (Rhizopus microsporus) ait çeşitli içerir görülebilmektedir....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Dayandırılmış yaklaşımlar kullanarak bir iş ortamı içinde mantar çeşitlilik belirleme mantar tehlike tanımlama ve pozlama değerlendirme geliştirdi. Bu yaklaşımı kullanarak kültür veya değerlendirme mikroskobu tabanlı yöntemleri kullanarak algılanır çoğu zaman birçok ek mantar türü algılama için izin verdi. Bioaerosols mesleki ve kapalı ortamları ve genomik DNA çekme--dan onun amplifikasyon ve sıralama için hava örnekleri örnekleme yöntemi burada sunulmaktadır. Tespitler mantar çeşitliliğin bu yöntemleri kullanarak son de...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Bulgular ve sonuçlar bu raporda yazarlar vardır ve dün resmi konumunu Ulusal Enstitüsü mesleki güvenlik ve sağlık, merkezleri hastalık kontrol ve Önleme için yapıldı.

Teşekkürler

Bu eser kısmen NIOSH ve NIEHS (AES12007001-1-0-6) arasında bir kurumlararası anlaşma tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
NIOSH BC251 biyoaerosol siklon örnekleyiciNIOSHBC251NIOSH örnekleyici henüz ticari olarak mevcut değildir. NIOSH örnekleyicinin edinilmesi hakkında bilgi için lütfen William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) ile iletişime geçin
Fisherbrand Vidalı Kapaklı Steril Mikrosantrifüj TüpleriFisher Scientific02-681-3731.5 mL polipropilen mikrosantrifüj tüpleri; vidalı üst diş açma, NIOSH örnekleyicinin diş açmasına uygun olmalıdır
Falcon 15 mL Konik Santrifüj TüpleriHava örneklemesi için Corning 352096 15 mL polipropilen tüpler
Temiz Oda Vinil Bant, Kolay Çıkarılabilir, 1/4" GenişlikMcMaster-Carr76505A1sızdırmazlık bandı
Filtre Kaseti, Şeffaf Stiren, 37 mmSKC Inc.225-3LF3 parçalı numune alma kaseti (filtresiz). İçindekiler: kaset tabanı, uzatma kaportası, kaset kapağı ve giriş/çıkış tapaları
PTFE hidrofobik floropore membran filtreleri, 3.0 ve mikro; m, 37 mmEMD KırlangıçFSLW03700İçeriği: 37 mm, 3.0 & m PTFE filtreler ve destek pedleri
Fisherbrand filtre forseps FisherScientific09-753-50filtre forseps
Model 502 Hassas PanaPressPanaVise502pnömatik kaset presi bu hassas çardak presinden yapılmıştır
Scotch Super 33+ vinil elektrik bandıMcMaster-Carr76455A2119 mm bant
Çok Amaçlı Kalibrasyon Kavanozu, BüyükSKC Inc.225-112kalibrasyon kavanozu
Evrensel PCXR4 Numune PompasıSKC Inc.224-PCXR4numune alma pompası
Kütle Akış Ölçer 4140TSI Inc.4140akış ölçer
Roche Yüksek Saf PCR Şablon KitiGenomikDNA ekstraksiyonu için kullanılan Roche Teşhis 11796828001 Kiti. İçindekiler: Lizis tamponu, Bağlama tamponu, Proteinaz K, İnhibitör giderme tamponu, Yıkama tamponu, Elüsyon tamponu, Cam elyaf filtre tüpleri ve 2 ml toplama tüpleri
Fisherbrand 2 mL Takviyeli Polipropilen Vidalı Kapaklı TüplerFisher Scientific15340162Boncuk homojenizasyonu için 2 mL takviyeli tüpler
Cam boncuklar, asitle yıkanmış, 212-300 &; mikro; mSigma-AldrichG1277cam boncuklar
Fisher Scientific Boncuk Değirmeni 24 HomojenizatörFisher Scientific15-340-163boncuk homojenizatör
CelLytic B Hücre Lizis Reaktifi, 10XSigma-AldrichC8740lizis reaktifi
Platin Taq polimerazInvitrogen10966-018İçindekiler: Platin Taq polimeraz, 10X PCR tamponu (MgCl2 yok), 50 mM MgCl2, KB Genişletici
dNTP MixInvitrogen18427-08810 mM dNTP karışımı
QIAquick PCR Saflaştırma KitiQiagen28106Mantar amplikonlarını saflaştırmak için kullanılan kit. İçindekiler: Tampon PB (bağlayıcı tampon), Tampon PE (yıkama tamponu), Tampon EB (elüsyon tamponu), pH İndikatör boyası (isteğe bağlı) ve GelPilot yükleme boyası
Owl EasyCast Mini Jel Elektroforez SistemiThermo FisherB1 veya B2
TrackIt 1 KB Plus DNA MerdiveniThermo Fisher10488-085DNA merdiveni
. Hava örneklemesi için

Kaynaklar

  1. Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
  2. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
  3. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
  4. Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
  5. Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
  6. Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28(2005).
  7. Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
  8. Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629(2014).
  9. Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863(2012).
  10. Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
  11. Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
  12. Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
  13. Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308(2015).
  14. Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
  15. Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
  16. ACGIH. Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).
  17. Rodes, C. E., Thornburg, J. W. Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. Ruzer, L. S., Harley, N. H. , CRC Press. (2005).
  18. Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
  19. Couch, J., et al. Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).
  20. Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
  21. Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
  22. Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189(2010).
  23. Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
  24. Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fungal DNA EkstraksiyonuMesleki Hava rneklemesisel Transkribe Edilmi Ara B lgeNIOSH Aerosol rnekleyiciBoncuklu De irmen Homojenizat rCam Boncuk LizisiITS B lgesi AmplifikasyonuFungal T r Tan mlamaMolek ler Fungal TespitHavadaki Fungal Analiz

İlgili makaleler