Yöntem makalesi

Transcriptionally düzenlenmiş uyku güzellik sistem entegrasyon arızalı Lentiviral vektör paketlenmiş bir verimli Vitro transpozisyonu yöntemle

DOI:

10.3791/56742

⸱

12 Ocak 2018

 ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı tarafından transcriptionally düzenlenmiş Uyuyan güzel sistem istikrarlı bir gen ilgi entegrasyonu insan genomu ulaşmak için bir yöntem açıklanır. Arızalı lentiviral Vektörler, vitro iletim insan hücre ve moleküler tahlil transduced hücrelerde entegrasyonu hazırlanması rapor edilmektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uyuyan güzel (SB) transposon gen transferi ve fonksiyonel genomik için kanıtlanmış etkinliği ile viral entegre bir sistemdir. SB transposon makine en iyi duruma getirmek için bir transcriptionally düzenlenmiş hiperaktif transposase (SB100X) ve T2 tabanlı transposon istihdam edilmektedir. Genellikle, transposase ve transposon geçici plazmid transfection tarafından sağlanır ve SB100X ifade bir bünye düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir. Burada, SB100X ifade denetlemek ve stabil bir gen ilgi (GOI) "kes ve Yapıştır" SB ile tümleştirmek için çeşitli fiziksel ve kimyasal transfection yöntemler dayanıklıdır insan hücreleri SB bileşenleri sunmak için verimli bir yöntem tarif mekanizma. Hiperaktif transposase ifade sıkı gen ekspresyonu 1992'den beri denetlemek için yaygın olarak kullanılan Tet-ON sistem tarafından kontrol edilir. Gen ilgi ters yineler (IR) T2 transposon tarafından çevrili olduğunu. Her iki SB bileşenleri arızalı lentiviral vektörler geçici HEK293T hücrelerinde üretilen entegre olarak paketlenir. İnsan hücreleri, hücre hatları veya Primer hücre insan dokusundan vitro geçici viral Vektörler ile transduced vardır. Doksisiklin (dox, tetrasiklin analog) ek kültür orta içine, üzerine bir transposase ifade ince ayar ölçülür ve gen tedavi hücre genomu ilgi uzun ömürlü entegrasyonunu sonuçları. Bu yöntem etkili ve uygulanabilir hücre kültürünü (örneğin, HeLa hücreleri) ve Primer hücre (örneğin, insan birincil lenfositi) ve böylece genetik mühendisliği ve tedavi gen transferi için değerli bir araç temsil eder.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T2-esaslı transposon birleştiğinde hiperaktif SB100X transposase preklinik gen terapisi uygulamaları1,2,3' te, genom değişiklikler4,5, zaten kullanılmış ve İndüklenmiş pluripotent kök hücre (IPSC)6,7yeniden programlama. Genellikle, SB bileşenleri geçici plazmid transfection tarafından sağlanır ve güçlü bir bünye organizatörü transposase ifade ediyor. Ancak, transfection gelişmiş yeni yöntemler rağmen birçok uygulama için bir meydan okuma iki bileşenli sistemi teslimini kalır. Böylece, yeni bir teslim iletişim kuralı geliştirilmesi artan ilgi vardır. Plazmid8 ve mRNA9transfection yöntemlerinin yanı sıra, viral teslim dayalı adenoviral10,11, adeno ilişkili viral (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 ve lentiviral vektörler15 geçmişte önerdi. Özellikle, seçim sistemi viral vektör entegrasyonunu olmadan SB bileşenlerinin geçici bir teslimatlar garantilemelidir. Yine de, transposase kurucu ifade güvenlik kaygıları nedeniyle kontrol edilemeyen transposon rehopping riskini yükseltir.

Bu nedenle, bir rafine Tet-ON sistem tarafından transkripsiyon düzenleme SB100X, ilk mücadeledir. Herpes simpleks virüs-1 (HSV-1)16, Timidine kinaz (TK) gen en az organizatörü (-81) ile orijinal gelişmiş en az Sitomegalovirüs (CMV) düzenleyici yerine kullanarak elde edilen bir değiştirilmiş Tet-duyarlı organizatörü klonlanmış, ters yönde SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). Mutasyona uğramış ters-tetrasiklin-transactivator rtTA2s-M217 farklı bir plazmid klonlanmış güçlü kurucu organizatörü (phosphoglycerate organizatörü, PGK) kontrolü altında ifade edilir (pCCL-PGKrtTA2S-M2). Kültür ortamına eklendiğinde rtTA2sdox bağlar-M2 modülatör ve karmaşık veya SB100X ifade18sıkıca düzenlenmiş indüksiyon sonuçlanan Tet organizatörü tethers.

İkinci büyük sorun insan Primer hücre verimsiz transfection çeşitli fiziksel ve kimyasal yöntemlerle ortaya çıkar. Transposase transfection, SB100X ve rtTA2sdayanıklı insan hücrelerinde verimli bir şekilde teslim etmek-M2 ifade kaset iki Tümleştirme arızalı lentiviral vektörler (IDLVs)19paketlenir: IDLVTKSB ve IDLVrtTA2s- M2. Viral vektörler geçici olarak üçüncü nesil vektörel çizimler HEK293T hücreleri20 ve pseudotyped Vescicular Stomatit virüs (VSV-G), hangi enfeksiyon geniş bir yelpazede confers glikoprotein G ile üretilmektedir. Vektör parçacıklar tarafından ultrasantrifüj konsantre ve HIV-1 Gag p24 immunocapture tarafından titre. Hücre satırları ve Primer hücre transduce için vektör parçacıklar polybrene ile complexed ve hedef hücreleri ile dox içinde inkübe. SB100X ifade transduced hücrelerin aktivasyonu uyuşturucu bağımlı kantitatif RT-PCR (qRT-PCR)18tarafından ölçülür.

Tet düzenlenir SB100X ifadesi gösterdi sonra GOI (örneğin, yeşil flüoresan protein, GFP) transpozisyonu hedef hücre genomu içine Bak ve Mikkelsen21tarafından açıkça kapsamlıdır moleküler olayları izler. Üçüncü bir IDLV vektör taşıyan bir ifade kaset T2-transposon IRS (IDLVT2) arasında klonlanmış GOI için inşa ve yukarıda da belirtildiği gibi paketlenmiş vardır. Son olarak, üç IDLV vektörler verimli bir şekilde insan hücreleri (örneğin, birincil lenfositi) vitro transduce ve Doksisiklin18huzurunda GOI tümleştirmek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. plazmid istihdam

Not: Plazmid pCCL-PGKrtTA2S-M2 lütfen Prof. Zappavigna (üniversite, Modena ve Reggio Emilia, Modena, İtalya) tarafından sağlanan. Hiperaktif transposase kodlama dizisi taşıyan pCMVSB100X Plazmid ve pT2/BH transposon plazmid nazikçe Prof Z. Ivics (Paul Ehrlich Enstitüsü, Langen, Almanya) ve Prof. Dr. Z. Izvak (Max Delbruck Merkezi moleküler tıp, Berlin, tarafından verilmiştir Almanya).

  1. Tüm klonlama için Escherichia Coli içinde (E. coli), klonlama strateji seçimi ve restriksiyon enzimi yordam veya PCR güçlendirme parçasının klonlanmış için izleyin.
    Not: Tablo 1 tüm bu protokol için istihdam plazmid özetler. Bir açıklama ve her plazmid için başvurular sağlanır.

2. viral vektör üretim

Not: Viral vektörler biohazard başlıklı bir düzeyde BSL2 Biyogüvenlik çevreleme, kurumsal kurallara ve düzenlemelere göre üretilmektedir.

  1. Kültür yapisan HEK293T hücrelerde Dulbecco'nın modifiye kartal orta % 10 HyClone serum, 100 U/mL penisilin-streptomisin ve 2 mM glutamin ile desteklenmiştir.
  2. 0. gün: beş 15 cm tabak/viral hazırlık ve tohum 5.5x106 hücreler orta 30 ml hazırlayın.
  3. 1. gün: Transfection
    1. Transfection başlamadan önce 2 x HEPES arabellek salin (HBS) 100 mL hazırlayın:
      NaCl (5 M) 5,6 mL
      HEPES (1 M) 10.0 mL
      Na2HPO4 (0, 5 M) 0.3 mL
      Steril su 84,1 mL
      PH %7.1 37 ile uyum HCl.
      Not: 2 x HBS 4 ° C'de saklanabilir Tam bir pH verimli transfection için son derece önemlidir. 7.10-7.12 optimum pH aralıktır.
    2. Orta kaldırın ve 22,5 mL/tabak taze orta 4 h transfection önce ekleyin.
    3. HEK293T hücreleri transferi plazmid, pMD.Lg/pRRE.D64VInt ambalaj plazmid, zarf kodlama pMD2.G Plazmid ve pRSV-Rev (Tablo 1) aşağıdaki miktar/plaka göre transfect:
      Plazmid 25,00 µg transfer
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 µg
      pMD2.G 8,75 µg
      pRSV-Rev 6,25 µg
      Not: Plazmid DNA'lar Maniatis22 veya bir plazmid endotoksin ücretsiz arıtma seti kullanarak açıklanan CsCl protokolüne göre hazırlanır.
      1. DNA (4 plazmid karışımı) 56.25 µg 1,125 ml steril su resuspend ve 125 µL 2.5 M CaCl2 (a çözüm) ekleyin.
      2. 2 x HBS 1.250 mL steril 15 mL konik santrifüj tüpü (çözüm B) ekleyin.
      3. Çözüm (1.250 mL) B (1.250 mL) dropwise köpüren yaparken 1 veya 2 mL pipet ile eklemek (transfection çözüm, Toplam hacim 2.500 mL).
      4. (RT) oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
      5. P1000 micropipette kullanarak, tüm hücre monolayer transfection çözümü (2.500 mL) dropwise dağıtın.
    4. Gecede bir hücre kültür kuluçka 37 ° c, % 5 CO2kuluçkaya.
  4. 2. gün: Orta kaldırın ve taze orta 15 mL ekleyin (bkz. Adım 2.1).
  5. 3. gün: Toplamak ve lentiviral partikül içeren süpernatant konsantre.
    1. Tüm (~ 70 mL) süpernatant toplamak (n = 5) transfected hücre Kaplamalar, filtre PESS filtre ve 2 polyallomer tüpler (1 inç x 3,5 inç) doldurun 0,45 µm ile / viral hazırlık.
    2. Vektör parçacıklar tarafından ultrasantrifüj fren ile 15 ° C'de 2,5 h için 106,000 x g, konsantre ol.
    3. Hemen (Pelet tüp resuspension önlemek için) ultrasantrifüj, yavaşça durdurduktan sonra süpernatant % 10 çamaşır suyu içeren bir konteyner içine dökün ve 2 görünür zor granül 1 x PBS 100 µL içinde askıya alma (+ %1 BSA). Bu açık ve çok küçük Pelet olduğu gibi normaldir. Taze hazırlanmış veya aliquot konsantre vektör kullanın ve viral hazırlıklar-80 ° C'de depolayın
      Dikkat: Süpernatant iyice biohazard atık atılmadan önce ağartılmış gerekir lentiviral parçacıklar içerir.
  6. Viral vektör hazırlık titre için üreticinin protokolüne göre HIV-1 Gag p24 immunocapture seti kullanın.
    Not: lipozomlar tabanlı reaktifler viral vektör üretim standartlaştırmak için istihdam olabilir. Yine de, viral vektör titresi yüksek transfection verimliliği ve plazmid DNA saflığı bağlıdır.

3. iletim insan hücre hatları (örneğin, HeLa hücreleri)

Not: HeLa hücreleri % 10 fetal buzağı serum, 100 U/mL penisilin-streptomisin ve 2 mM glutamin ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal ortamda kültürlenir. Tablo 1 tüm bu protokol için istihdam vektörel çizimler özetler. Her vektör için bir açıklama sağlanmıştır. HeLa hücreleri iletim iki IDLV vektörler iyi doz kombinasyonu SB transposase transkripsiyon Yönetmeliği doğrulanmasına izin verir. IDLV doz varyasyonu vektör parçacık titrasyon ve hedef hücre türü için ilgili olabilir.

  1. 0. gün: 2 x 105 için her şey bir 6-şey plaka orta 3 mL hücrelerde tohum. 4 kuyu hazırlayın.
  2. 1. gün: İletim HeLa hücre.
    1. Her koşul için bir son hacim 1 mL orta lentiviral vektörlerinin seyreltik (yukarıdaki nota bakın), polybrene (son konsantrasyon 8 μg/mL) 10 μL huzurunda:
      Seyreltme de #1 için: transduced hücreleri (negatif kontrol) alay.
      Seyreltme için de #2: IDLVTKSB vektör (2.600 p24 ng).
      Seyreltme kuyuları #3 #4 için: IDLVTKSB vektör (2.600 p24 ng) + IDLVrtTA2s-M2 vektör (9600 p24 ng).
    2. Nerede HeLa hücreleri gün 0 kaplama her kuyudan orta kaldırın ve lentiviral vektör dilutions için karşılık gelen de ekleyin.
    3. Spinoculate 6-şey plaka vasıl 754 x g 20-25 ° C ve sonra aktarmak 6-şey plaka bir hücre kültür kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2, 45 dk için.
    4. 6 h sonra bütün Wells taze orta orta içeren vektörel çizimler yerine ve Doksisiklin de 4 # 1 mikron ekleyin. Bir hücre kültür kuluçka 37 ° C'de 48 h için içine plaka koymak.
  3. 3. gün: Hücre Pelet hazırlanması RNA çıkarılması için.
    1. Hücreleri ayırma önce tripsin çalışan bir çözüm (1 x) hazırlayın:
      % 2.5 tripsin (10 x) 5.0 mL
      500 mM EDTA (son konsantrasyonu 5 mM =) 0.5 mL
      PBS 44.5 mL x 1
    2. Sıcak tripsin çalışma çözüm kullanmadan önce 37 ° C'de. Tripsin çalışma çözüm 4 ° C'de depolayın
    3. Orta kaldırmak ve hücreleri 1 x PBS ile yıkayın. Her şey için 0.5 mL Önceden ısıtılmış 37 ° C tripsin çalışma çözeltisi ekleyin ve 7 dakika (içinde bir hücre kültür kuluçka) 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Kuluçka sonra 0.5 mL serum içeren ekleyin orta tripsin ve toplamak bir santrifüj tüpü hücrelerde devre dışı bırakabilirsiniz için her şey için. Her şey bir kez 3 mL 1 x PBS ile durulayın ve hücre süspansiyon için 240 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi.
    5. 5 mL 1 x PBS, santrifüj 240 x g de 5 min için de hücrelerle yıkayın ve süpernatant atın. Taze toplanan hücre topakları kullanın veya-80 ° C'de depolayın Toplam RNA yarı kantitatif RT-PCR gerçekleştirmek için çökeltilerini ayıklamak (bkz. Adım 6).

4. insan Primer hücre (örneğin, lenfositi) iletim

Not: İnsan birincil lenfositi öğrenirim radyasyonlu 3T3-J2 hücreleri (besleyici katman)23, Yan Barrandon (EPFL, Lozan, İsviçre) bir tür hediye üzerine tohumlari.

  1. Dulbecco'nın modifiye kartal % 10 donör sığır serum, 50 U/mL penisilin-streptomisin ve 4 mM glutamin (3T3 orta) ile desteklenmiş Orta İsviçre fare 3T3-J2 hücrelerinde büyür.
  2. Öğrenirim radyasyonlu 3T3-J2 hücreleri cFAD orta, bir Dulbecco'nın modifiye kartal orta ve Ham'ın F12 medya karışımı (3:1) içeren fetal sığır serum (% 10), penisilin-streptomisin (% 1), glutamin (% 2), insülin (5 µg/mL), adenin (kaplama lenfositi büyümek 0,18 mM), hidrokortizon (0.4 µg/mL), kolera toksin (0,1 nM) ve triiyodotironin (2 nM).
  3. 0. gün: Tohum 3 x 105 öğrenirim 3T3-J2 hücreleri, daha önce her iyi 6-şey plaka 1 X 105 hücre/mL, son bir konsantrasyon 3T3 orta içine seyreltilmiş ışınlanmış. 9 kuyu hazırlayın.
  4. 1. gün: İletim birincil keratinositler
    Not: Lenfositi iletim miktar SB transposase transkripsiyon Yönetmeliğin iki IDLV vektörler iyi doz kombinasyonu (tarafından qRT-PCR) sağlar ve entegrasyon, GOI (GFP) hedef hücrelerdeki (cytofluorimetric tarafından doğrulamak için analizi).
    1. Hücreleri ayırma önce tripsin çalışma çözüm hazırlayın:
      %0.5 tripsin-EDTA (10 x) 5.0 mL
      500mM EDTA (son konsantrasyonu 5 mM =) 0.5 mL
      PBS 44.5 mL x 1
    2. Sıcak tripsin çalışma çözüm kullanmadan önce 37 ° C'de. Tripsin çalışma çözüm 4 ° C'de depolayın
    3. Kültür subconfluent keratinositler ayırmak için orta kaldırın, 1 x PBS hücrelerle yıkayın ve her şey için 1 mL Önceden ısıtılmış tripsin çalışma çözeltisi ekleyin. Hücre kültür kuluçka 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Kuluçka sonra bir de hücrelerin resuspend iyice ve hücre süspansiyon 2 mL serum içeren içeren bir santrifüj tüpü transfer orta (37 ° C'de ek bir min için hücrelerin çoğu hala iliştirilmişse, kuluçkaya). Her biri de bir kez 3 mL 1 x PBS veya taze orta durulama ve hücre süspansiyon ile santrifüj tüpü durulama çözüm ekleyin.
    5. 580 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
    6. 5 mL 1 x PBS, santrifüj 580 x g de 5 min için de hücrelerle yıkayın ve süpernatant atın.
    7. Polipropilen 15 mL tüp içinde 1.6x105 lenfositi cFAD orta, her koşul için bir seyreltme 1 ml seyreltik.
    8. Lentiviral vektörler cFAD orta polybrene (8 µg/mL 2 mL son hacmi, son konsantrasyonu) 20 μL huzurunda 1 ml seyreltik:
      Dilutions kuyu #1, #2, #3 için: transduced hücreleri (negatif kontrol vektörel çizimler olmadan) alay.
      Dilutions kuyu #4, #5 için: IDLVTKSB vektör (13.000 p24 ng) + IDLVrtTA2s-M2 vektör (48.000 p24 ng).
      Dilutions için kuyu #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB vektör (13.000 p24 ng) + IDLVrtTA2s-M2 vektör (48.000 p24 ng) + IDLVT2 vektör (9,160 p24 ng).
    9. Süspansiyon hücrelerde her lentiviral vektör seyreltme (1 mL) ekleyerek ilgili keratinosit süspansiyon (1 ml 1.6x105 lenfositi) transduce.
    10. Orta gün 0 ve transduced plaka keratinositler (1.6x105 lenfositi 2 ml) onları üzerine numaralı seribaşı öğrenirim radyasyonlu 3T3-J2 hücreleri kaldırın. Transducing sonra bir de diğeri ile devam edin.
    11. 25 ° c 30 dk için kuluçkaya ve sonra 37 ° c 6 h hücre kültür kuluçka hücreleri aktarın.
      Not: canlılık ve nükleer silahların yayılmasına karşı şiddetle etkilenir değil spinoculate birincil keratinositler, yap.
    12. 6 h sonra her şey için cFAD orta 1 mL ekleyin. 1 mikron Doksisiklin (son konsantrasyonu) kuyu #5, #8 ve #9 ekleyin. Dönüş hücreleri ile 37 ° c
  5. 2. gün: 3 mL 10 ng/mL EGF ile KC orta cFAD orta yerine.
  6. 3. gün: Trypsinize ve hücreleri (bkz: 4.4.1-4.4.6) daha önce açıklandığı gibi #5 #1 ve #4 kuyulardan yıkayın. Hücre topakları qRT-PCR analiz için toplam RNA ayıklamak için-80 ° C'de dondurmak (bkz. adım 7).
  7. 4.4.1-4.4.5 adımlarda açıklandığı gibi hücreleri de #2, #6 ve #8 trypsinize ve cytofluorimetric çözümlemesi GFP ifade için (bkz. Adım 5).
  8. En az 3-4 doublings, un tümleşik IDLVT2 vektör (5 gündür besleyici katman üzerinde kaplama insan birincil lenfositi) sulandırmak için yeterli için #3 ve #7 #9 kuyulardan kültür tutun.
  9. 6. gün: Yaklaşık 5 gün iletim sonrası, kuyu #3 ve #7 #9 GFP ifade için cytofluorimetric analiz yapmak (bkz: adımları 4.4.1-4.4.5) hücrelerden trypsinize (bkz. Adım 5).
    Not: Deney zamanlama ve iletim verimliliği son derece etkiledi birincil hücre türüne göre ve toplanan örnekleri değişkenliği tarafından.

5. Cytofluorimetric analiz transduced birincil lenfositi üzerinde

Not: mavi lazer ile yapılandırılmış bir Akış Sitometresi (488 nm), kırmızı bir lazer (633 nm) ve GFP ve APC Floresans tespiti istihdam için filtreler ( Malzeme tabloyabakın).

  1. Etiket transduced keratinositler 3 gün ve gün (bkz. Adım 4.7 ve 4,9) 6 ile müstakil fare monoklonal APC lenfositi 3T3-J2 besleyici katmandan ayırımcılık için-konjüge Anti-besleyici antikor.
    1. Her örnek için tampon boyama 4 mL hazırlayın:
      %5 FBS 200 μL
      500 mM EDTA (son konsantrasyonu 2.5 mM =) 20 μL
      PBS 1 x 3780 μL
    2. Müstakil hücreleri arabellek boyama 1 mL ile yıkayın. 580 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
    3. Akış Sitometresi Alım için bir tüp, 5 x 104 boyama arabelleği 100 μL hücrelerde resuspend ve anti-besleyici antikor (1:50) 2 μL ekleyin. Mix iyi ve karanlıkta buzda 30 dk için kuluçkaya.
    4. 30 dakika sonra arabellek boyama 2 mL ile yıkayın. 580 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. 200 μL arabellek boyama resuspend.
    5. APC ve GFP sinyalleri cytofluorimetric analiz18tarafından elde. APC- hücre nüfusun GFP+ hücre kısmı transduced keratinositler gösterir.
      Not: arzu edilirse, lekeli örnek Akış Sitometresi önce PBS 1 %2 paraformaldehyde ile düzeltmek x ve mağaza koşmak kadar karanlıkta 4 ° C'de.
  2. GFP+yüzdesi arasındaki oran komplo tarafından Akış Sitometresi verileri analizhücreleri (5 gün) bitiş noktası ve GFP+yüzdesihücreleri 2 gün sonrası IDLVT2 transduced kalan seviyesine normalleştirilmiş iletim, hücreleri.

6. yarı kantitatif RT-PCR

Not: bir PCR termal cycler kullanın.

  1. RNA üzerinden transduced veya üreticinin protokole göre bir RNA arıtma seti kullanarak hücreleri kontrol toplam ayıklayın.
    Not: Toplam RNA-80 ° C'de saklanabilir
  2. CDNA 100 kullanarak bir 20 µL tepki olarak sentez ng toplam RNA ve üreticinin protokolüne göre bir ters transkriptaz kit.
    Not:-20 ° C'de cDNA saklanabilir
  3. Tasarım astar SB100X için rtTA2sbelirli-M2 ve GAPDH (bir temizlik gen).
    Önerilen Tasarımlar:
    SB ileri astar: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
    SB ters astar: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
    rtTAM2 ileri astar: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
    rtTAM2 ters astar: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
    GAPDH ileri astar: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
    GAPDH ters astar: 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'
  4. PCR 50 µL son tepki hacmindeki gerçekleştirin. Özellikle, aşağıdaki reaksiyon her PCR tüpün montajı:
    cDNA (1:5 seyreltme) (Kimden adım 6.2) 1,00 µL
    İleri astar (10 µM hisse senedi) 1,00 µL
    Astar (10 µM hisse senedi) ters 1.00 µL
    dNTPs (10 µM hisse senedi) 1,00 µL
    Tampon (+ MgCl2) (10 x hisse senedi) 5,00 µL
    Taq polimeraz (5 U/µL hisse senedi) 0,25 µL
    Steril su 40.75 µL
  5. Termal cycler aşağıdaki programı kullanın: 1 döngüsü 95 ° C'de 5 dakika sonra devam etmek için 30 95 ° C ile s, 30 58 ° C s ve 30 72 ° C s SB100X için 34 döngü için 32 döngüleri için rtTA2s-M2 ve GAPDH 25 devredir.
  6. % 1'özel jel hazırlayın. Özel TBE 1 100 ml (steril suda seyreltilmiş 10 x hisse senedi), x 1 g bir kabı veya cep şişesi geçiyoruz. Özel tamamen eriyene kadar her dakika dönen bir mikrodalga fırında kavrulur. Yaklaşık 50 ° C ulaşıncaya kadar eritilmiş özel serin ve etidyum bromür (10 mg/mL stok) 5 µL ekleyin. Erimiş özel jel döküm için bir tarak monte jel tepsiye dökün.
  7. Örnekleri (10 µL her) özel jel üzerinde yük ve Elektroforez gerçekleştirin.
  8. İstenirse, jel resmi alacak ve PCR bantları üzerinde densitometric çözümlemesi gerçekleştirin.

7. kantitatif RT-PCR (qRT-PCR)

Not: Ticari bir sıra algılama sistemi istihdam edilmektedir. PCR astar ve 6-carboxyfluorescein (FAM) prob gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) için ticari olarak satın alınır.

  1. Retro-transkripsiyon için bkz: adım 6.2.
  2. Astar tasarım ve SB100X için özel yoklama için yazılımı kullanın.
    Önerilen tasarım:
    SB.2 ileri astar: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
    SB.2 ters astar: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
    SB FAM yoklama: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
  3. Gerçek zamanlı PCR 96-şey pilakalar ve PCR Master Mix gerçekleştirmek ve astar + sonda karıştırın, 25 µL son tepki hacminde. Özellikle, aşağıdaki reaksiyon için her şey göz önünde bulundurun:
    cDNA (1:10 seyreltme steril su) 1,00 µL
    2 x Master Mix 12,50 µL
    Astar + 20 x sonda 1,25 µL mix
    Steril su 10.25 µL
    Not: Bütün tepkiler nüsha gerçekleştirin. Pipetting hataları önlemek için en az n + 3 reaksiyonlar (olmadan cDNA) için bir karışım hazırlayın. Bir çok kanallı pipet kullanarak aliquot.
  4. Aşağıdaki programı kullanarak gerçek zamanlı PCR çalıştırın: 1 döngüsü 10 dk sonra 95 ° C 40 döngüleri için 95 ° C'de 15 s ve 60 ° C için 1 dk ve 4 ° C'de tutun
  5. SB100X GAPDH aynı cDNA örnek düzeyi için göreli ifade (RQ değer) tipik veri analiz yazılımı kullanarak 2-ΔΔCT miktar tarafından normalleştirme tarafından qRT-PCR veri analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yordamı kullanarak sunulan burada, üç IDLV vektörler düzenlenmiş SB bileşenleri taşıma (SB100X, rtTA2S-M2 ve T2-GFP transposon) paketlenmiş ve verimli bir şekilde teslim ve sıkıca SB sistem insan hücrelerinde düzenlenmesi için kullanılır. Şekil 1A ( Tablo 2' de bildirilen) iki IDLV vektörler iyi doz kombinasyonu ile SB transposase transkripsiyon Yönetmeliği değerlendirmek için yapılan vitro iletim HeLa hücrelerin bir düzen...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, stabil bir GOI genom Uyuyan güzeltarafından hedef hücrelerin içine entegre etmek için yaygın olarak erişilebilir bir metodoloji açıklayan-hukuka aracılı. SB sistem genom düzenlemek için nonviral bir yöntem sağlamak için geliştirilmiştir, verimli bir şekilde teslim (transposase ve T2 transposon) tümleştirme makinelerin zorunlu olsa da. Bu nedenle, SB sistem pek transfectable Primer hücre üzerinde kullanmak için viral SB bileşenlerinin teslimatlar son yıllarda10,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prof. Zappavigna, Üniversitesi, Modena ve Reggio Emilia, Modena, İtalya ile pCCL-PGKrtTA2Sbize sağlamak için teşekkür ederiz-M2 plazmid. Biz de Prof Z. Ivics (Paul Ehlrich Enstitüsü, Langen, Almanya) ve Prof. Dr. Z. Izvak (Max Delbruck merkezi için moleküler tıp, Berlin, Almanya) için pCMVSB100X ve pT2/BH plazmidleri kabul edersiniz. Bu eser DEBRA uluslararası ve İtalyanca üniversite ve araştırma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' L-GlutaminLonzaBE12-614FHücre kültürü ortamı
HyClone Fetal Sığır Serumu (ABD),lentiviral partikül üretimi için hücre kültürü HEK293T kullanılanGE Healthcare Life SciencesSH30071.03
Penisilin 10.000 UI/ml Streptomisin 10.000 UI/mlLonzaDE17-602EHücre kültürü ortamı için reaktifler.
L-Glutamin 200mMLonzaBE17-605EReaktifi.
HBS 2X hazırlığı içinSodyum Klorür (NaCl)Sigma-AldrichS7653
HEPES Tamponu,HBS 2X hazırlığı içinsu LonzaBE17-737E
Disodyum hidrojen fosfat dihidrat (Na2HPO4· 2H2O), %99,5Merck106580HBS 2X hazırlığı için reaktif.
Hidroklorik asit - ACS reaktifi% 37 (HCl) HBS2X hazırlığı içinSigma-Aldrich320331
Enjeksiyon için steril suHBS 2X hazırlığı içinFresenius Kabi-Reaktif
0.45 ve mikro; m PESS filtresiWhatman10462100Viral süpernatanttan hücre kalıntılarını gidermek için kullanılan filtreler.
Polyallomer Beckman tüpleriBeckman Coulter326823IDLV vektörlerini ultrasantrifüjleme ile konsantre etmek için tüpler.
PBS-1X, Ca, MgLonzaBE17-516Folmadan hücre yıkama ve lentiviral partikül resüspanitasyonu için tampon.
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA2153(İsteğe bağlı) Lentiviral partikül resüspaniti için tampon.
IDLV partikül titrasyonu içinHIV-1 Gag p24 immünocapture kitiPerkin ElmerNEK50001KT
Transdüksiyon verimliliğini artırmak içinPolybreneSigma-Aldrich107689
Tripsin (10X) HBSS'de% 2.5 Ca, HeLaGIBCOBE17-160EReaktifi (seyreltilecek stok çözeltisi).
Tripsin çalışma çözeltisi hazırlama içinetilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu (EDTA)100938BAnalaR BDH
% 0.5 Tripsin-EDTA, fenol kırmızısı yok (10X)GIBCO15400-054Keratinositleri ayırmak için reaktif (seyreltilecek stok çözeltisi).
Donör Sığır Serumu, Yeni Zelanda MenşeiGIBCO16030-074İsviçre faresi 3T3-J2 hücre kültürü (besleyici tabaka) için serum.
Jambon' s F12 mediaGIBCO21765Keratinositler için besiyeri.
Fetal sığır serumuLonzaDE14-801FHeLa hücre kültürü ortamı için serum.
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, Avustralya MenşeliGIBCO10099-141İnsan primer keratinosit kültür ortamı için serum.
Sığır pankreasından insülinKeratinosit büyümesi içinSigma-AldrichI5500
Keratinosit büyümesi içinadeninVWR1152-25
HidrokortizonVWR3867-1Keratinosit büyümesi için reaktifler.
Vibrio cholerae'den kolera toksiniSigma-AldrichC8052Keratinosit büyümesi için reaktifler.
Keratinosit büyümesi içintriiyodotironinSigma-AldrichT5516
Keratinosit büyümesi içinİnsan EGFAustral BiyolojikGF-010-9
Fare monoklonal APC konjuge Anti-Besleyici antikoruMiltenyi Biotech130-096-099Besleyici katmanını etiketlemek için.
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134RNA saflaştırma kiti.
SuperScript III Ters TranskriptazYaşam Teknolojileri18080051Ters transkriptaz kiti.
Deoksinükleotid Karışımı, 10 mM (dNTP)Yarı kantitatif PCR içinSigma-AldrichD7295
Yarı kantitatif PCR ve qRT-PCR için UltraPureDNase/RNase İçermeyen Damıtılmış Su(herhangi bir)Reaktif
GoTaq G2 Sıcak Başlangıç PolimerazPromegaM740BTaq polimeraz.
Agaroz, moleküler biyoloji içinSigma-AldrichA9539Agaroz jel elektroforezi için reaktif.
UltraPure TBE Tamponu, agarozİnvitrojen15581028Reaktifi, ddH2O'da seyreltik (1X).
Agaroz jel elektroforezi içinetidyum bromürSigma-AldrichE1510
HeLa hücrelerinde ve keratinositlerde transpozaz ekspresyonunu indüklemek içinDoksisiklinSigma-AldrichD-9891
TaqMan Universal PCR Master MixUygulanan Biyosistem4304437primerler ve prob dahil olmak üzere TaqMan Universal PCR Master Mix.
15 mL Yüksek Netlikli polipropilen Santrifüj Tüpü, Konik Alt, Kubbe Contalı Vidalı Kapaklı, Hücretoplama ve vektör seyreltme hazırlığı içinFalcon Corning352096
150 mm TC ile İşlenmiş 20 mm Izgaralı Hücre Kültürü Kabı, SterilFalcon Corning353025Viral üretim için Hücre kültürü kabı.
6 İyi Şeffaf Düz Tabanlı TC ile Muamele Edilmiş Çok Kuyulu Hücre Kültürü Plakası, Kapaklı, Ayrı Sarılmış, SterilFalcon Corning353046HeLa ve insan birincil keratinosit transdüksiyonu için hücre kültürü plakası.
Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleri, hacim 1,5 mLEppendorf0030 120.086Seyreltme hazırlığı için tüpler.
Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleri, hacim 2 mLEppendorf0030 120.094Seyreltme hazırlığı için tüpler.
Yarı kantitatif PCRiçin düz kapaklı 0.2ml PCR Tüpleri, RNase, DNase, DNA ve PCR İnhibitörü içermeyen(herhangi bir)Tüp
MicroAmp Barkodlu Hızlı Optik 96 Kuyulu Reaksiyon Plakası, 0.1 mLUygulamalı Biyosistem4346906qRT-PCR için 96 oyuklu.
5 mL Yuvarlak Alt Polistiren Tüp, KapaksızBD Falcon352052Akış sitometrisi alımı için Tüpler.
Tek Kullanımlık Serolojik Pipetler, Polistiren, Ayrı Ayrı Sarılmış, Steril (farklı hacimlerde)(herhangi bir)-Steril doku kültürü uygulamaları için pipetler.
toplama ve moleküler biyoloji uygulamaları içinFiltre Uçları, Steril ve RNase, DNase, DNA ve Pirojen içermeyen (farklı hacimlerde)(herhangi bir)filtre
pH metre(herhangi biri)-HBS 2X pH ölçümü için ekipman.
PCR Termal döngüleyici(herhangi bir)-Yarı kantitatif PCR için ekipman.
Agaroz jel elektroforezi ekipmanı(herhangi biri)-Yarı kantitatif PCR'nin agaroz jel elektroforezi için ekipman.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2BD-Flowsitometresi.
7900HT Hızlı Gerçek Zamanlı PCR sistemiqRT-PCR içinUygulanan Biyosistem7900HT
Hücre kültürü uygulamalarında verimli numune işleme için tezgah üstü santrifüjler, soğutulmuş, mikroplaka kovalı.(herhangi bir)-Hücre kültürü işleme ve spinokülasyon için santrifüj.
Optima L-90K Ultrasantrifüjlentiviral partikül üretimi içinBeckman Coulter-Ultrasantrifüj
Hücre kültürü ve moleküler biyoloji laboratuvarı için ekipman (örneğin, BSL2 malzemeleri, hücre kültürü inkübatörü, buzdolapları ve dondurucuları içeren çalışmalar için tasarlanmış Sınıf II laminer akış başlığı (+4 & derece; C, -20 derece > C, -80 derece > C), mikropipetler ve pipet yardımcısı).
Koruyucu laboratuvar önlükleri, eldivenler, Enstitü kural ve yönetmeliklerine uygun yüz koruması, özellikle lentiviral partikül üretimi ve iletimi için.
olmadan 4.5 g / L glikoz içeren s ortamı. Serumunu karakterize eder.Hücre kültürü ortamı için Reaktifi. normal tuzlu Reaktifinde 1M Stoku. Reaktifi.. Kiti. Reaktifi. hücrelerini ayırmak için Mg Reaktifi. Reaktifleri. Reaktifleri. Reaktifleri. Reaktifleri. Reaktifi.. jel elektroforezi için 10X Reaktifi. ilacı, , , Steril Tüpleri..Steril doku uçları. Ekipmanı., SW32TI rotor ile donatılmıştır.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
  2. Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
  3. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  4. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
  5. Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
  6. Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
  7. Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
  8. Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712(2014).
  9. Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
  10. Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
  11. Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344(2013).
  12. Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771(2013).
  13. Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
  14. Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
  15. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  16. Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
  17. Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
  18. Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038(2016).
  19. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
  20. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  21. Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. , 4th edition, (2012).
  23. Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sleeping Beauty SystemTranscriptional RegulationIntegration Defective Lentiviral VectorGene Of InterestHyperactive TransposaseTet ON SystemPrimary KeratinocytesFlow CytometryReal Time PCRDoxycycline Induction

İlgili makaleler