Yöntem makalesi

Nicel Dot Blot tahlil AAV titrasyon ve virüs Adeno ilişkili derleme etkinleştirme işlev değerlendirmesi için kullanımı için proteinler

DOI:

10.3791/56766

⸱

12 Haziran 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması bir basit nokta leke tahlil Nefelometri adeno ilişkili virüs (AAV) titreleri ve derleme aktif rol çalışmaya uygulanması için detayları proteinleri (AAPs), yapısal olmayan viral proteinlerin tüm AAV buldu romanı bir sınıf serotipleri, soydaş ve kapaklı AAV serotipleri türetilmiş capsids Meclisi teşvik.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adeno ilişkili virüs (AAV) yaygın olarak gen tedavisi için çekici bir vektör olarak kabul ederken, ayrıca virüs biyoloji anlamak için bir model virüs olarak hizmet vermektedir. İkinci açıdan derleme aktive protein (AAP) olarak adlandırdığı bir yapısal olmayan AAV protein son keşfi viral kapsid VP proteinlerin derlemeye bir kapsid içinde gerçekleştirilen işlemlere yeni bir ışık tutmuştur. Birçok AAV serotipleri için derleme AAP gerektirse de, son zamanlarda bildirdin bu AAV4, 5, ve 11 Bu kuralın istisnaları vardır. Ayrıca, AAPs ve monte capsids farklı serotipleri için farklı hücre altı bölmeleri yerelleştirmek gösterdi. Biyolojik özellikleri ve AAPs arasında farklı AAV, fonksiyonel rollerinin beklenmeyen bu heterojenlik önemini AAPs üzerine farklı serotipleri türetilen alt çizgi serotipleri. Bu el yazması bir basit nokta leke tahlil AAV Nefelometri ve kapsid derlemesinde AAP bağımlılık ve serotip özgüllük değerlendirmek için uygulama için ayrıntıları. Bu dot blot testin yardımcı programı göstermek için biz kapsid derleme ve AAP bağımlılık yılan AAV, daha önce uncharacterized sürüngen AAV, hem de AAV5 ve AAV9, hangi AAP bağımsız ve AAP bağımlı olmak daha önce gösterilmiş olan karakterize etmek için yola çıktı , sırasıyla serotipleri. Tahlil ortaya yılan AAV kapsid derleme yılan AAP gerektirir ve AAPs tarafından AAV5 ve AAV9 yükseltilemez. Tahlil birçok ortak serotip Contegra kapsid derleme çapraz-uluslara tarafından teşvik AAPs, yılan AAP AAV9 capsids Meclisi teşvik değil, aynı zamanda gösterdi. Buna ek olarak, biz seçimi nükleaz, önemli ölçüde dot blot testin okuma etkiler ve böylece, en uygun bir enzim seçme AAV titreleri başarılı değerlendirmesi için kritik olduğunu gösteriyor.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adeno ilişkili virüs (AAV) genomu yaklaşık 4.7 kilobases (kb) ile küçük, Sigara saran, tek iplikçikli DNA virüsüdür. AAV genom açık okuma çerçevesi (ORFs) temsilcisi ile kap gen için içerir. 2010'da evvelce tanımlanamayan bir mekansal protein + 1 çerçeve kaymıştır ORF AAV2 kap gen içinde tarafından kodlanmış Sonntag vd tarafından keşfedilen ve AAV2 kapsid VP monomer proteinler bütünleştirilmiş koda bir viral kritik bir rol oynamak için bulundu kapsid1. Bu roman protein derleme aktive protein (AAP) kapsid derleme1teşvik oynadığı rolü sonra adlandırılmıştır.

AAP için ORFs tüm parvoviruses cins Dependoparvovirusiçinde ancak farklı cins parvovirus aile1,2virüs genleri içinde genleri tespit bioinformatically olmuştur. Bu roman protein fonksiyonel çalışmalar başlangıçta hangi AAP2 önemli rol unassembled VP proteinleri birikimi ve düzene çekirdekçik için tam hedefleme kurmuştur AAP AAV2 prototipten (AAP2), üzerinde durulmuştur capsids1,3,4toplandı. AAP ifade olmaması durumunda montajı AAV2 capsids yetersizliği bağımsız oldu bizimki de dahil olmak üzere birden çok grubu tarafından1,2,3,4,5 onaylandıktan . AAV serotipleri 1, 8 ve 9 sonraki çalışmalar AAPs kritik rolü ile kapsid derleme, AAV1, 8, VP3 monomer proteinler olarak doğrulanmıştır ve 9 tam olarak birleştirilmiş bir kapsid AAP2Co ifade yokluğunda oluşturmak yapamaz.

Son zamanlarda, nicel nokta kullanımını içeren yaklaşımlar deneyleri leke, biz AAV1 yeteneği VP3 monomerleri Meclisi tanıtmak için 12 AAP ifade yokluğu ve AAP1 yeteneği capsids içine monte 12 VP3 monomer için araştırdık kapaklı serotipleri. Bu çalışmada ortaya koyduğu bu AAV4, 5 ve 11 VP3 monomerleri AAP monte. Ayrıca, biz muayene on iki AAP serotipleri sekizi bulundu oldu (yani, tüm AAP4, ama 5, 11 ve 12) AAP4, 5, 11 ve 12 görüntülenen süre Contegra AAV serotip capsids Meclisi kapsid desteklemek için geniş bir yetenek görüntülenen bir önemli ölçüde Bu konuda6sınırlı yetenek. Bu dört serotipi diğer AAP serotipleri2,3filogenetik uzak. Ayrıca, çalışma içinde farklı AAPs6hücre altı yerelleştirmeler önemli heterojenite ortaya çıkardı. Ayrıca, çalışma AAP sıkı Derneği ile birleştirilmiş capsids ve çekirdekçik, AAV2 kapsid derleme, hallmark mutlaka AAV5, dahil olmak üzere diğer serotipleri genişletilemez önerdi 8 ve 9, genelde dışlanması görüntülemek Monte capsids6. Böylece, herhangi bir belirli serotip AAP çalışma elde edilen bilgilerden tüm AAP biyoloji için genel olarak geçerli değildir. Böyle şaşırtıcı doğa AAP biyoloji rolü ve fonksiyonu her AAP kurallı ve kanonik olmayan AAV serotipleri üzerinden araştırmak gereğini vurgular.

Biyolojik rolü AAP kapsid derleme tam olarak paketlenmiş AAV viral parçacık titreleri insan embriyonik böbrek (HEK) 293 hücreleri, en sık kullanılan hücre kültürünü AAV vektör üretim, ile ya da ezelî AAP protein için üretilen belirleyerek tespit edilebilir ifade. Kantitatif PCR (qPCR) AAV Nefelometri için standart metodlar-tabanlı deneyleri7,8 ve nicel nokta leke tabanlı deneyleri9. Diğer yöntemleri için AAV viral parçacık Nefelometri enzim bağlı immunosorbent assay10,11 veya optik yoğunluk ölçüm12 gibi birçok farklı AAV serotipleri elde edilen örnekler veya örnekleri için ideal değildir sık sık AAV araştırmalar için kullanılan örnekleri kirleri (ham lysates veya kültür ortamı), ile kirlenmiş. Şu anda, qPCR en yaygın AAV Nefelometri için kullanılır; Ancak, potansiyel uyarılar qPCR tabanlı testin tahlil olarak sistemik hataları ve önemli titresi varyasyonları13,14neden olabilir kabul etmek gereklidir. PCR tabanlı deneyleri potansiyel kovalent kapalı terminal saç tokaları amplifikasyon13inhibe PCR şablonları varlığı gibi faktörler semptomlarıdır bir dizi etkilenir. Deneyimli bir birey bile potansiyel tanıtabilirsiniz karıştırıcı faktörlerin qPCR tabanlı içine tahlil bilmeden13. Buna ek olarak, nicel nokta leke deneyleri genom amplifikasyon içermeyen ve hataları qPCR tabanlı deneyleri ile karşılaştırıldığında en az riskle çok daha basit ilke kullanan bir klasik moleküler biyoloji tekniği vardır. Teknik olarak zor daha az yöntemdir; Bu nedenle, tahlil sonuçları bile deneyimsiz kişiler tarafından makul tekrarlanabilir.

Bu raporda, biz biz düzenli olarak AAV vektör Nefelometri için kullanın ve nasıl AAPs derleme teşvik rolü ortak çalışmaya tahlil uygulamak için (AAV5 ve AAV9) serotipleri ve bir örnek sağlar bir nicel nokta leke tahlil metodolojik ayrıntıları açıklamak daha önce uncharacterized AAP yılan AAV14. Doğada, AAV VP proteinler ve AAP proteinler CIS bir tek gen (yani, VP-AAP CIS-tamamlayıcı), burada açıklanan tahlil üzerinden ifade edilir, Müdür Yardımcısı ve AAP proteinler trans iki ayrı plazmid (yani, VP-AAP üzerinden sağlanır Trans-tamamlayıcı). Farklı serotipleri her VP veya AAP protein her bağımsız plazmid ifade edilebilir beri kapsid derleme (yani, VP-AAP çapraz-tamamlayıcı) için kapaklı VP-AAP kombinasyonları test etmek mümkün olur. Kısaca, çeşitli serotipleri üzerinden AAV VP3 HEK 293 hücrelerinde varlığı veya yokluğu soydaş serotip AAP veya kapaklı serotip AAP huzurunda bir AAV vektör genom paketlemek için plazmid DNA transfection tarafından ifade edilir. Üretim, Kültür Medya ve hücre lysates kapsid kabuk içinde viral genom ölçmek için bir nokta leke tahlil için tabi tutulmaktadır. Dot blot testin ilk adım örnekler bulaşıcı plazmid DNA'lar ve ambalajsız AAV genleri örneklerinde kaldırmak için bir nükleaz ile tedavi etmektir. Aksi halde ne zaman unpurified örnekleri denetlesinler arka plan sinyalleri özellikle artış olacaktır. Bu da bir proteaz tedavi viral capsids kırmak ve örnek çözümlerinizle nükleaz dayanıklı viral genom yayın tarafından takip ediyor. Sonraki, viral genom bir membran üzerinde deyimiyle, denatüre ve Nefelometri bir viral genom özgü DNA prob ile melezleşmiştir. Rapor burada örnek tahlil biz yılan AAV VP3 kapsid derleme için yılan AAP gerektirir ve yılan AAP AAV9 capsids Ayrıca Meclisi yükseltebilirsiniz AAP bağımlı serotipleri türetilmiş AAPs çoğunu aksine Meclisi teşvik değil göstermek kapaklı serotip capsids. Son olarak, biz qPCR için önemli bir uyarı raporu veya seçimi nükleaz, önemli ölçüde tahlil sonuçları etkiler nokta leke tabanlı AAV Nefelometri deneyleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Çözümler ve bu iletişim kuralı için gerekli arabellekleri için yemek tarifleri Tablo 1' de verilmiştir. Aşağıda açıklanan kapsid derlemesinde AAP proteinlerin rolleri çalışmaya VP-AAP çapraz-uluslara nokta leke tahlil için iletişim kuralıdır. Daha genel nicel nokta leke tahlil için saflaştırılmış AAV vektör titrasyon için yöntem Temsilcisi sonuçları bölümünde açıklanmıştır.

1. İnşaat VP3, AAP ve plazmidler ifade AAV2 Rep

  1. PCMV-AAVx-VP3 (x = serotipleri) İnşaatı
    1. PCR-yükseltmek tüm VP3 yüksek sadakat DNA polimeraz ve aşağıdaki astar çiftini kullanarak ORF (1,6 kb): VP3 ileri, CTAA-RE1-CACC-N25 (VP3 ORF ilk 25 nukleotid); VP3 ters, TCTT-RE2-N25 (VP3 ORF son 25 nukleotid).
      Not: RE1 ve RE2 enzimleri klonlama için (REs) için sitelerdir. CTAA ve TCTT terminal 5' ve sonuna çift iplikçikli DNA Restriksiyon enzimi sindirimi kolaylaştırmak için eklendi 3' tetranucleotides yakınındaki. CACC Kozak fikir birliği dizisidir.
    2. İnsan sitomegalovirüs hemen-erken (CMV-IE) enhancer-organizatörü için üst düzey ifade kullanan bir memeli ifade vektör sitelerin yeniden karşılık gelen arasında RE-digested PCR ürünleri klon.
      Not: moleküler klonlama için omurga plazmid DNA bir en uygun sıcaklıkta 1 h için 4 U/µg DNA bir konsantrasyon, bir restriction enzyme(s) ile 5 µg sindirmek. PCR parçaları için kullanılan enzimler (Örneğin, 10 U/µg 1,6 kb VP3 ORF PCR ürününün) ve daha uzun bir kuluçka süresi (Örneğin, 4 h) birim başına birim uzunluk Restriksiyon enzimi tanıma sitelerin sayısı artış nedeniyle artırmak. Moleküler Biyoloji Enzim ve bakteriyel dönüştürme de dahil olmak üzere klonlama yordamları yararlı bilgiler başka bir yerde15,16,17bulunabilir.
  2. PCMV-bayrak-AAPx (x = serotipleri) İnşaatı
    1. PCR-yükseltmek yüksek sadakat DNA polimeraz ve aşağıdaki astar çiftini kullanarak ilk amino asit dışında tüm AAP ORF (0.6 kb): AAP ileri, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (4 nükleotit üzerinden 25 nükleotit AAP ORF); AAP ters, TCTT-RE2-N25 (AAP ORF son 25 nukleotid).
      Not: Hiçbir zararlı etkileri4,5 için gösterilen ama gereksiz atlanabilir bir bayrak etiketi GACTACAAGGACGACGATGACAAA kodları.
    2. RE-digested PCR ürünleri bir memeli ifade vektör CMV-IE artırıcı organizatörü15,16,17ile ilgili siteler arasında klon.
  3. PHLP-Tem inşaatı
    1. Özeti 5 µg 20 birim her Xho ile pAAV-RC2 plazmid (7,3 kb), ben ve Xcm ben ve ticari bir DNA arıtma kit kullanarak DNA arındırmak veya fenol kloroform çıkarma.
      Not: 1,8 kb Xho ben-7,3 kb pAAV-RC2 plazmid sonuçlarda bir kayıp kapsid VP protein ifade Rep protein ifade koruyarak süre gelen parçası Xcm kaldırılması.
    2. Künt DNA 6 adet T4 DNA polimeraz ile biter, özel jel-5.5 kb DNA parçası arındırmak ve 50-100 kullanarak saf parçası kendi kendine ligate ng DNA ve 400 adet T4 DNA ligaz üreticinin tavsiye15göre.
    3. 1.1.2. adımda belirtilen standart bakteriyel dönüşüm prosedürü izleyin Not.
  4. Restriksiyon enzimi sindirim ve sıralama15,18tarafından plazmid oluşturur doğrulayın.
  5. Plazmid minipreps veya maxipreps plazmid DNA aşağı akım AAV üretim deneyler için yeterli miktarda elde etmek için piyasada kitleri kullanarak gerçekleştirin.

2. AAV HEK 293 yılında üretimini hücreleri plazmid DNA Transfection (çapraz-uluslara tahlil) tarafından

  1. Kültür HEK 293 hücreleri içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM)-yüksek glikoz (4,5 g/M) % 10 fetal Sığır serum ile (FBS), % 1 penisilin ve streptomisin Mix, takıma ve 1 mM L-glutamin, 37 ° C kuluçka %5 karbondioksit (CO2) ile.
    Not: AAV titreleri önemli ölçüde HEK 293 hücreleri kaynağına bağlı olarak değişir.
    Dikkat: her ne kadar AAV, ele alınabilir Biyogüvenlik seviye 1 (BSL1) kapsama, BSL2 koruyucu HEK 293 hücre iş için tavsiye edilir.
  2. Gün -1 (transfection önce 24 h), tabak 6-7 105

























    2. Tek sarmallı AAV parçacıklarını hesaplama denklemi; DNA miktar tayini; moleküler genetik formül.
      Plazmit uzunluğu kullanılarak çift sarmallı AAV parçacıklarının hesaplanması için denklem; Bilimsel formül.
    3. Yüzde hesaplama formülü: (320/400 × 200/240 × 0) veri analizi için.Matematiksel Denklem, Hesaplama, Formül, Oran, Bölme, Çarpma, Bilimsel Gösterim

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicel nokta lekeleri büyük ölçüde üretilen saf AAV vektör stoklarının Nefelometri için temsil edici bir sonucu Şekil 1' de gösterilen. Bu dot blot yöntemi ile bir çift iplikçikli AAV2G9-CMV-GFP vektör hisse senedi titresi tespit edilmiştir. Vektör yoğunluğu-gradient ultrasantrifüj diyaliz yukarıda açıklanan20ardından sezyum klorür (CsCl) iki tur tarafından saflaştırıldı. Genel olarak, saf AAV vektör stokları için yinelenen bir değişikl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu raporda, nicel nokta leke deneyleri AAV AAPs ve kapsid derleme içindeki rollerine çalışmaya yardımcı programı açıklanır. Bu çalışmalardan elde bilgi AAPs işlevsel rolü farklı serotipleri arasında ve doğuştan gelen farklar AAV kapsid montaj sürecinde ayrıntılı kazandırabileceğini. Bu bağlamda AAV VP3-AAP çapraz-uluslara nokta leke yılan AAV VP3 soydaş, AAP kapsid derleme için ortak ifade sıkı bir bağımlılık görüntülenen ve yılan AAP Contegra serotipleri kapsid Meclisi teşvik değil ortaya tahlil . Bu gözlem ilginç çünkü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xiao Xiao Kuzey Carolina Üniversitesi, Chapel Hill pEMBL-CMV-GFP plazmid ile bize verdiğiniz için teşekkür ederiz. Christopher Cheng ve Samuel J. Huang el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu eser tarafından desteklenmiştir (NIH R01 NS088399 ve T32 EY232113) halk sağlığı hizmeti verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BenzonazMilliporeSigma1016970001Ana metinde Serratia marcescen endonükleaz olarak anılmaktadır.
DNase IRoche4716728001ana metinde DNaz I Enzim A olarak anılmaktadır.
DNase IInvitrogen18047019Ana metinde DNaz I Enzim B olarak anılacaktır.
DNase INew England BiolabsM0303LAna metinde DNase I Enzim C olarak anılacaktır.
1,5 mL Ekli O-Ring Vidalı Kapaklı Mikrosantrifüj TüpleriCorning430909
1,5 mL Mikrosantrifüj TüpleriThermo Fisher Scientific05-408-129
15 mL Polipropilen Konik BoruCorning352097
3 M Sodyum AsetatTeknova S0298
50 mL Polipropilen Konik BoruCorning430291
AAV-293 HücreleriAgilent240073HEK-293 hücre hattı, AAV viryonlarının paketlenmesi için optimize edilmiştir.
AccuGENE 0.5 M EDTA ÇözeltisiLonza51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0Lonza51238
AccuGENE% 10 SDSLonza51213
AccuGENE 1X TE TamponLonza51235
Bio-Dot AparatıBio-Rad1706545
Sığır Serumu AlbüminiMilliporeSigmaA3294
Hücre KaldırıcıCorning3008
KloroformMilliporeSigma372978
DNA Çıkarıcı KitiWako Saf Kimya Endüstrileri295-50201Bu, saflaştırılmış virüs üzerindeki kantitatif nokta lekeleri için kullanılır. Üretici tarafından sağlanan kılavuzda Protokol Şeması 2 için önerilen her adımda tüm reaktiflerin yalnızca yarım hacmini kullanıyoruz.
Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)-yüksek glikoz (4.5 g / L)Lonza12-614F
ElectroMAX DH10B HücreleriThermo Fisher Scientific18290015
Etanol 200 KanıtDecon Labs2716
Fetal Sığır SerumuVWR1500-500
Ficoll 400Alfa AesarB22095Polisakaroz 400 olarak anılır.
Floresan MikroskobuZeissAxiovert 40 CFL
GlikojenRoche10901393001
Ringa Balığı Sperm DNAInvitrogen15634-017
Hibridizasyon TüpleriThermo Fisher Scientific13-247-150
ImageQuant TLGE Sağlık Yaşam BilimleriImageQuant TL
L-glutamin 200 mMLonza17-605E
Magnezyum Klorür HekzahidratMilliporeSigmaM0250
MicroPulser ElektroporatörBio-Rad1652100
Mini Hızlı Döndürme DNA SütunlarıMilliporeSigma11814419001
pAAV-RC2 Vektör HücresiBiolabs IncVPK-422
Penisilin / Streptomisin 10K / 10KLonza17-602E
Fosfat Tamponlu TuzluLonza17-516F
Fosforgörüntüleme Pozlama KasetiGE Healthcare Yaşam BilimleriÇeşitli
Fosforgörüntüleme EkranıGE Healthcare Yaşam BilimleriÇeşitli
Plazmid Maxi KitiQIAGEN12162
Platin Pfx DNA Polimerazİnvitrojen
PolyethyleniminePolysciences Inc23966-2
PolivinilpirolidonMilliporeSigmaP5288
Prime-It II Rastgele Primer Etiketleme KitiAgilent Technologies300385
Primer AAP ORF'deki 4. nükleotidden ileri (N25 nükleotidler, RE1 klonlama için bir kısıtlama enzim bölgesidir): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		MilliporeSigmaÖzel Astar
Astarı AAP Ters (N25, AAP ORF'nin son 25 nükleotididir, RE2 klonlama için bir kısıtlama enzimi bölgesidir): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaÖzel Astar
Primer VP3 İleri (N25 VP3 ORF'nin ilk 25 nükleotidi, RE1 klonlama için bir kısıtlama enzimi bölgesidir): CTAA-RE1-CACC-N25MilliporeSigmaÖzel Astar
Astar VP3 Ters (N25, AAP ORF'nin son 25 nükleotididir, RE2, klonlama için bir kısıtlama enzimi bölgesidir): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaÖzel Primer
Proteinaz K ÇözeltisiInvitrogen25530-049
Restriksiyon EnzimleriNew England BiolabsÇeşitli
Somon Sperm DNAInvitrogen15632011
Serolojik PipetlerThermo Fisher Scientific13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodyum KlorürThermo Fisher ScientificS271-10
Sodyum Sitrat Tribazik DihidratMilliporeSigmaC8532
T4 DNA PolimerazNew England BiolabsM0203L
Termal DöngüleyiciEppendorf6321000515
Doku Kültürü Tedavi Edilmiş 6 KuyuluPlaka Corning
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-5
Typhoon FLA 7000GE Healthcare Yaşam Bilimleri28955809
UltraPure Tamponla Doymuş FenolInvitrogen15513-047
UV Çapraz BağlayıcıSpektrolineXLE-1000120 mJ/cm2.
Zeta-Prob MembranBio-Rad162-0165
11708013353046

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211(2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Montaj Aktive Edici ProteinKapsit MontajAAV KantitasyonuN kleaz UygulamasViral Partik l Geri Kazan mPlazmit DNA StandartlarHibritleme TamponuGeiger Sayac Tespiti

İlgili makaleler