Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Kalsiyum (Ca2 +) görüntüleme intrasellüler Ca2 + sinyaller nöronal dendrites de kronolojik zamanmekansal dinamikleri araştırmak için güçlü bir araçtır. CA2 + dalgalanmaları membran ve hücre içi mekanizmaları çeşitli aracılığıyla ortaya ve sinaptik plastisite indüksiyon ve dendritik uyarılabilirlik düzenlenmesi önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, farklı tipteki Ca2 + sinyalleri dendritik dallarında kaydetmek için yetenek nasıl dendrites bilgi entegre eğitim grupları için değerlidir. İki fotonlu mikroskobu gelişiyle böyle çalışmaları önemli ölçüde canlı doku, ışık saçılma ve duyarlilik gibi görüntüleme için içsel sorunları çözerek kolaylaştırdı. Ayrıca, geleneksel Elektrofizyolojik teknikleri ile görüntüleme İki fotonlu Ca2 + arada yoluyla, yerel Ca2 + dalgalanmalar nöronal dendrites kayıtları ile paralel olarak sinaptik faaliyete araştırmak mümkün olduğunu Soma. Burada, GABAergic inhibitör interneurons dendrites içinde yerel Ca2 + geçişler (kediler) dinamiklerini incelemek için bu yöntemi kullanmak nasıl açıklar. Yöntem aynı zamanda akut beyin dilimleri farklı nöronal türleri içinde sinyal dendritik Ca2 + eğitim için uygulanır.
Giriş
Ağ etkinliği için bir neuron katkısı büyük ölçüde aldığı sinaptik girişleri dinamik yapısı tarafından belirlenir. Geleneksel olarak, nöronlar sinirsel aktivite karakterize baskın yöntemi somatik hücre içi bütün yama-kelepçe kayıtların postsinaptik akıntılarının aksonlar geçiş elektriksel stimülasyon tarafından uyarılmış dayanıyordu. Ancak, proksimale yer sinapslarda tek faaliyet truthfully bu durum1' bildirdi. Buna ek olarak, sinaps özgü mekanizmaları değerlendirmek için kayıtları çiftinden nöronların ve dendrites belirli bir konumda sinapslarda ilgi ve dendritik Tümleştirme, mekanizmaları sırasıyla hedeflemek için kullanılmaktadır. Sinaptik fi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneyler Université Laval, Hayvan Koruma Komitesi ve hayvan bakımı Kanada Konseyi ve hayvan refahı kuralları uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. ön hazırlık (isteğe bağlı: 1 gün önceden hazırlamak)
- Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözüm (Normal, sukroz ve kurtarma çözümleri, 1 L; bkz: Tablo 1) üç tür hazırlamak. 300 ± 10 mOsm25 çözümlerinize osmolalite ayarlamak ve ACSF-Sükroz yakınındaki-donma noktası aşağı serin (0-4 ° C).
Not: Bir düşük sodyum kesme çözüm (ACSF-Sükroz) kullanımı akut dilimleri26yüzeysel katmanları nöronlarda canlılığı korunmasına yardımcı o....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada sunulan iletişim kuralını kullanarak, somatik geçerli enjeksiyon ve Hipokampus CA1 alanında oriens/alveus interneurons dendrites içinde elektrik stimülasyonu tarafından uyarılmış CaTs elde edilen. Sonra belirlenen bir nöron, yama, şekil ve konumunu temel alarak, biz linescans proksimal dendrite birden çok noktalarda karşısında alınan verilen mesafeler soma (şekil 1A). Soma (azaltılmış AP genlik veya kalsiyum kanal dağıtım, şekil 1B.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada gösterilen yöntem nöronal dendrites akut beyin dilimleri içinde sinyal dendritik Ca2 + eğitimi için iki fotonlu Ca2 + görüntüleme ve yama-kelepçe Elektrofizyoloji ile birlikte nasıl kullanılacağını gösterir. Bu yöntem dendritik kesimleri ve somatik hücrenin tepkisinde elektrik stimülasyon veya backpropagating AP tarafından uyarılmış her iki yerel Ca2 + çizimleri izlenmesi için izin verir. Bu çalışma dendritik ağacının nasıl çeşitli yerlerinde girişleri entegre ve soma ile iletişim .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çıkar çatışması var.
Teşekkürler
Bu eser Kanada Sağlık Araştırma enstitüleri, Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC keşif Grant) ve Savoy Vakfı tarafından desteklenmiştir. OC NSERC bir Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hayvan Suşu: Fare CD1 | Charles Nehri | 022 | |
| Isofluran | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 hidroklorür | Abcam | ab120337 | |
| Kalsiyum klorür & nbsp; | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glikoz | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnezyum klorür ve nbsp; | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnezyum sülfat heptahidrat | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehit tozu, %95 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Potasyum klorür ve nbsp; | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Potasyum glukonat | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Sodyum azid | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodyum bikarbonat ve nbsp; | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Sodyum klorür | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sükroz | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma tabanı | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma hidroklorür ve nbsp; | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Sodyum fosfat dibazik dihidrat | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodyum fosfat monobazik monohidrat | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biyosit | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hidrazid | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
| SR95531 (Gabazin) | Abcam | ab120042 | |
Adenozin trifosfat (ATP)-Tris | Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanozin (GTP)-Na+ | Sigma-Aldrich | G8877< | |
| br/> Oregon Yeşili BAPTA-1 | ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Fosfokreatin di(tris) tuzu | Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin konjuge Alexa-546 | ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Yama Borosilikat Cam Kılcal Damarlar | Dünya Hassas Aletler | 1B100F-4 | |
Teta Borosilikat Cam Kılcal | Damarlar Sutter Aleti | BT-150-10 | |
P-97 Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme | Sutter Aleti | ||
TCS SP5 Konfokal Çoklu Foton Mikroskobu | Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti: Safir multifoton lazer ve nbsp; | Tutarlı | ||
| LAS AF Görüntüleme Edinme Yazılımı | Leica Microsystems | ||
Sıcaklık Kontrol Cihazı TC-324B | Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifikatör | Moleküler Cihazları | ||
Digidata 1440A Sayısallaştırıcı | Moleküler Cihazlar | ||
Konfokal Çevirmen | Siskiyou | ||
mikromanipülatör | Siskiyou | ||
pClamp Veri Toplama Yazılımı | Moleküler Cihazlar | ||
A365 Sabit Akım Uyaran İzolatörü | Dünyası Hassas Aletler | ||
Vibraplane Optik | Masa Kinetik Sistemleri |
Kaynaklar
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997). ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
