Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

9.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/56779

⸱

2 Mart 2018

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Columbia University, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

Bu makalede

Özet

Drosophila yumurtalık kök hücre niş geliştirme eğitim için mükemmel model bir sistemdir. Larva ve yetişkin yumurtalık dissekan için yöntemleri yayımlanmış olsa, Pupa yumurtalık diseksiyonlarının ayrıntılı olarak yayınlanmamıştır farklı teknikler gerektirir. Burada diseksiyon, boyama ve pupa yumurtalık montaj için bir protokol anahat.

Özet

Yetişkin Drosophila yumurtalık, Pupa yumurtalık erişmek ve onların küçük nedeniyle incelemek nispeten zor olan boyut, translucence ve bir pupa dava içinde kapatan. Pupa yumurtalık dissekan meydan aynı zamanda fiziksel konumlarını pupa içinde yatıyor: yumurtalık içinde pupa karın yağ vücut hücreleri tarafından çevrilidir ve bu yağ hücrelerinin doğru antikor boyama için izin vermek için kaldırılması gerekir. Bu zorlukları aşmak için pupa karından yağ vücut hücreleri ayıklamak için özelleştirilmiş Pasteur pipets bu protokolü kullanır. Ayrıca, Pupa görünürlüğünü artırmak için odacıklı bir coverglass yerine microcentrifuge tüp boyama işlemi sırasında kullanılır. Ancak, bu ve diğer avantajları bu protokol için kullanılan araçlar rağmen bu tekniklerin başarılı yürütme hala pratik pupa yumurtalık küçük boyutu nedeniyle birkaç gün içerebilir. Bu protokol için özetlenen teknikleri yumurtalık çeşitli yaşlardaki pupa analiz edilir zaman ders deneyler için uygulanabilir.

Giriş

Drosophila yumurtalık kullanarak kök hücre araştırma kök hücre niş1,2,3,4ilk belgelenmesi beri yaygın olarak genişletti. Soy izleme genetik araçlarını, Drosophila yumurtalık diseksiyonlarının sık kök hücre soy eğitim için kullanılan gelişimi takip ve kök hücre bakım, yayılmasını önleme ve kök hücre niş kadere düzenleyen yolları sinyal. Bu sinyal yolları bilgisine kanserlerin anormal kök hücre etkinlik5,6,7' den kaynaklanan olası nedenler anlayışlar verim. Ayrıca son zamanlarda folikül kök hücreler (FSCs) bilinen Drosophila yumurtalık somatik kök hücre şiddetle memeli bağırsak kök hücre kendi organizasyon8birçok yönleriyle benzer gösterilmiştir. Bu nedenle, Drosophila yumurtalık kök hücre davranış eğitimi için son derece faydalı model sistemi vardır.

Larva ve yetişkin yumurtalık erken kök hücre gelişimi ve niş içinde son kök hücre organizasyon ipuçları sırasıyla sunarken, Pupa yumurtalık germline ve somatik hücre yeniden düzenlemek ve kimliklerini kurmak bir ara yapıdır 9 , 10. rağmen birçok araştırma yönleri pupa yumurtalık10,11,12,13' te doku gelişimi inceledik, farklılaşma ve mekansal organizasyonu ile ilgili sorular kalır pupa geliştirme sırasında yumurtalık hücre türleri. Özellikle, bu döneminde FSCs tayini oluşur. Bu iletişim kuralı anatomi ve istediğiniz zaman noktalarda pupa yumurtalık boyama yöntemi özetliyor — pupa yumurtalık gelişimi yetişkin sahneye larva üzerinden ayrıntılı olarak analiz zaman ders deneylerde kullanılan bir teknik.

Küçük boyutu, translucence ve pupa karın içinde pupa yumurtalık erişilememesi için hesap için bu iletişim kuralını antikor erişimin engellenmesi karın yağ vücut dokusu kaldırmak için bir ısmarlama ince uçlu Pasteur damlalıklı gibi araçlar kullanır Yumurtalık. Teklifler geniş çaplı bir görünürlük pupa ve yumurtalık "Nutator" üzerinde sallanan nazik bir platform boyama antikor sırasında kullanılan bir açık, odacıklı coverglass Larva yumurtalık gruptakiler için bir protokol Maimon ve beratını14tarafından dayanarak, Triton X-100 nispeten yüksek bir konsantrasyon boyama yordamın ilk adımda hücre zarının permeabilization ve antikor erişimin en üst düzeye çıkarmak için istihdam edilmiştir Yumurtalık hücreleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. EggLaying

  1. Yaklaşık on erkek ve on beş kadın yetişkin Drosophila sinekler istenen genotip normal zengin sinek yemek Maya ile desteklenmiş bir şişe içinde birleştirir. Şişeyi aşırı kalabalık önlemek için 2-4 h14saatten uzun için yumurtlamak şeklindeki kadın izin.
  2. Yetişkinler şişeyi uçmak gıda ile farklı bir şişe karşı açılış şişe dokunarak yeni bir şişe aktarın. Larvalar, oda sıcaklığında içine 3-4 gün için geliştirmek yumurta izin.

2. kadın larva seçme

  1. Nemli bir ince fırça ile yumuşak kıllar kullanarak, göçebe üçüncü-biçim larva de 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x ile ağzına kadar dolu bir cam şişe aktarmak için şişe duvar boyunca fırça ile çalışırken bir hareketi yapmak. Gıda artıkları larvalar kapalı onların 1 x PBS ile dolu iyi diğerine transfer ederek yıkayın.
  2. Erkek ve dişi larva forseps kullanarak ayırın. Büyük, yuvarlak ve yarı saydam testis yağ vücutta yaklaşık üçte vücut yan tarafındaki aşağı onun ön uç15gömülü bir çift tarafından erkek larva tanımlayın. Kadın larva ortalama olarak daha büyük, daha az erkeklerden daha saydam ve daha tespit etmek zordur çok daha küçük gonads var.
  3. Erkek larva karşı kadın larva toplamak için seçin. En az 10 kadın kuyudan toplamak. Kadın larva de 1 x PBS ile dolu ayrı bir yerleştirin.
  4. Kadın larva yavaşça taze uçmak yiyecek yeni bir şişe aktarmak için kullanmak forseps Maya ile desteklenmiştir.
  5. Şişeyi kadın larvaları ile pupariation16kolaylaştırmak için karanlık bir konuma yerleştirin. Gün boyunca, larva pupariation için izleyin. Her larva immobilizes ve bir prepupa geliştirir, şişeyi karşı prepupa daire ve ne zaman o ilk oluşturur bir prepupa yaklaşık süreyi kaydetmek. Prepupae anterior vızıltısı çıkıntı ve zamanlama puparium oluşumu17belirleyebilir. Prepupae (puparium oluşumu, APF sonra saat cinsinden) istenen saat noktasına geliştirmeye olanak sağlar.
    Not: bir prepupa puparium formasyonu içerisinde yaklaşık 10 s aralığı tabi herhangi bir hayvan olarak kabul edilebilir. Dahili bir tüy dökme yerini almıştır sonra pupa aşamada yaklaşık 12 h puparium oluşumu sonra başlar.

3. pupa antikor boyama için hazırlanması

  1. Sonraki adımda pupa yağ cesedi temizlenmesi için kullanılmak üzere bir ince cam damlalıklı oluştururlar.
    1. Pasteur damlalıklı cam ucu Bunsen brülör üzerinde kavrulur. Cam erir gibi pens ucunu yatay olarak daha ince bir ipucu oluşturmak üzere damlalıklı kalan uzak çekmek için kullanın.
    2. Soğutma sonra temiz bir dairesel açılış kurmaya damlalıklı ipucu küçük bir bölümünü kır. Bir ampul damlalıklı diğer ucunu takın.
    3. 1 x PBS ile damlalıklı yükleyin.
  2. Şişeyi duvara yapıştırılmış, Pupa, hasat için küçük bir damla su pupa ve flakon arasında temas bölgesi boyunca geçerlidir. Protein bildirmek için 1-2 dakika bekleyin tutkal dağıtılması hafifçe nemli bir ince fırça ile duvarından pupa kaldırma önce. 1 x PBS ile dolu pupa bir cama iyi transfer. Tek bir kuyu kuyu aşırı kalabalık önlemek için pupa başına adamak.
  3. Pupa başkanı görünene kadar pupa arka sonu forseps bir çift ile açgözlü iken, başka bir çifti pupa modelinde ön kısmını dikkatlice gözyaşı.
  4. Pupa başından en ön ucu Forseps ile kavrama ve yavaşça pupa pupa kendi halinde dışarı çekin.
    Not: Yağ vücudun bir kısmı dışarı bu süreçte dökülme.
  5. Ayrı ve pupa posterior yarım üzerinden ön yarısı kadar sadece karın çuval kalır atın.
  6. Yağ vücut hücrelerinin karın çuval ayıklayın.
    1. 1 x PBS başka bir el ile dolu ince cam damlalıklı tutarken bir yandan Forseps ile karın çuval kuyunun karşı kavramak.
    2. İnce damlalıklı ipucu açılması çuval ve yavaş yavaş damlalıklı 1 x PBS pupa yumurtalık çevreleyen yağ vücut hücrelerinin silsin karın içine doğru nişan al.
      Not: Yumurtalık karın çuval içinde kalması gereken küçük, yarı saydam, çizgili ve dikdörtgen yapıları bir çift vardır.
    3. Yağ vücut hücreleri en az üçte iki yağ vücudun gitmiş oluncaya veya yumurtalıkların karın çuval açılış yakınındaki görünür hale gelene kadar silsin. Yavaş yavaş bu adımı yürütmek çok önemlidir bu yüzden karın dışında yumurtalıkların kazara yıkamak değil.
  7. Yumurtalık dışarı yağ vücut hücre yıkama sırasında dökülen Eğer kontrol etmek için iyi inceleyin. Yumurtalık içinde iyi görünür değilse, karın içinde kalması gereken. Yumurtalık dışarı gelmiş varsa, yeni bir pupa kuyuda yerleştirebilir ve bu adımı yineleyin.
  8. Fiksasyon arabellek (1 x PBS, %4 paraformaldehyde) ile dolu bir açık coverglass odasına karın aktarmak ve kapağı üzerinde yer. Yumurtalıklar yeterli sayıda dayanacak boyama ve montaj işlemi, emin olmak için gerekenden daha fazla yumurtalıkların incelemek.
    Uyarı: Toksik olan paraformaldehyde fiksasyon arabellek içeriyor. Lütfen uygun korumaları eldiven, koruyucu gözlük, vbgibi tak.

4. immünhistokimya

  1. Boyama işlemi süresince, forseps cam kuyunun kayan herhangi bir yumurtalık yumurtalık tamamen antikor çözümde daldırılır emin olmak için yavaşça itin için kullanın.
  2. Yer çift taraflı bant bir Nutator düz yüzeyine çıkarır ve sonra odacıklı coverglass veya yapışkanlı çekilebilecek.
  3. Oda sıcaklığında 15 dk için adım 3.7 fiksasyon arabellekte yumurtalık kuluçkaya.
  4. Yumurtalık durulama üç 1 x PBS % 1 ile Triton X-100 5, 10 ve 45 dk (toplamda 1 h), sırasıyla, kapsamlı permeabilization izin vermek için kez.
  5. 1 x PBS % 0,5 ile % 10 normal keçi Serumda yumurtalık engellemek Triton X-100 30 dk için.
  6. Yumurtalık gecede 600 kuluçkaya seçim birincil antikor µL Triton X-100 4 ° C'de % 0,5 ile 1 x PBS uygun konsantrasyonu seyreltilmiş
  7. 1 x PBS % 0.5 ile yumurtalık üç kez 5 min için durulama Triton X-100.
  8. Triton X-100 oda sıcaklığında 1 x PBS % 0.5 ile uygun konsantrasyon için 2 h seçtiğiniz ikincil antikor 600 µL içinde seyreltilmiş için yumurtalıkların kuluçkaya.
  9. Yumurtalık iki kez 5 min için 1 x PBS %0.5 Triton X-100 ve 5 dakika içinde 1 x PBS için bir kez ile yıkayın.

5. anatomi ve pupa yumurtalık montaj

  1. 1 x PBS bir mikroskop slayt üzerine küçük bir damla yerleştirin. Kullanım forseps karın çuval odacıklı coverglass bir cam de aktarmak için 1 x PBS ile dolu. Tek bir kuyu kuyu aşırı kalabalık önlemek için pupa başına adamak.
  2. Dışında kalan herhangi bir yağ vücut ve karın çuval Forseps ile gözyaşı.
    Not: bir çift küçük, yarı saydam, çizgili ve dikdörtgen yapıları vardır, yumurtalık, kuyunun içinde görünür olması gerekir. Yumurtalık kez sıkıca yağ vücut tarafından çevrili, emin olmak önemlidir bu yüzden tüm yağ vücut iyice parçalanmış ayrı.
  3. Yumurtalık kuyudan 1 x mikroskop PBS slayt yumurtalık forseps ipuçları arasında merkezi açgözlü tarafından damla içine aktarın. Bir tutuş yumurtalık sıkma olmadan kullanılması şekilde değil kaybetmek veya aktarım sırasında edilebilmek için çok önemlidir. Çözüm zaman içinde kurur 1 x PBS birkaç damla slayda ekleyin.
  4. Bir kez tüm yumurtalık disseke ve mikroskop slayt, damlalıklı 40 µL, 22 x 22 mm coverslip ve yer coverslip yavaşça yumurtalıklar üzerine montaj ortamına aktarılır. Slayt kuru gecede görüntüleme önce izin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu yordamın başarılı yürütme Drosophila pupa yumurtalık hücresel organizasyonu ve yapısını ortaya açık antikor boyama sonuçlanmalıdır. Bu protokol için özetlenen immünhistokimya genellikle larva ve yetişkin yumurtalıklarda lekeli hücre tipleri tanımlamak için kullanılabilir. Türetilen pupa SAP hücrelerinin hücre (beyaz Fasciclin III tarafından özetlenen)18 şekil 3' te gösterilen sürüsü. Pupa yumurtalık hücresel organizasyonu v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu iletişim kuralının en kritik ve zor adım pupa yumurtalık fiksasyon öncesinde hazırlanması içerir. Yumurtalıklar, küçük ve gömülü içinde pupa karın yağ vücut hücreleri tarafından yeterince antikorlar ile lekeli emin olmak için sadece büyük bir açılış karın yatakta Forseps ile gözyaşı ama aynı zamanda engel yağ vücut hücreleri ayıklamak önemlidir Yumurtalık antikorlar üzerinden. Bu adımın başarılı yürütme gerektirir yağ vücut hücrelerinin karın çuval dışarı yıkama sırasında Pasteur damlalıklı ampul üzerinde ince baskı u...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (RO1 GM079351 D.K. için). Dorothea Godt onun orijinal protokolüne dayanan pupa yumurtalık diseksiyonu yararlı onun tavsiye için teşekkür ediyoruz. Biz ayrıca Amy Reilein ona yardım ve el yazması üzerine yorum için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dumont #5 Forseps, biyolojiİnce Bilimsel Araçlar11252-20
Nunc Lab-Tek Odacıklı KapakCamı Thermo Fisher Bilimsel155383
Diseksiyon mikroskobuNikonSMZ-10A
Konfokal MikroskopCarl ZeissLSM 700
Analiz yazılımıCarl ZeissZen
9 Depresyon Cam Spot PlakalarıPyrex7220-85
Pasteur pipetiFisher Scientific13-678-6B
Pasteur pipet ampulüÇeşitli satıcılar
Bunsen brülörÇeşitli satıcılar
Fisherfinest Premium Buzlu Mikroskop SlaytlarıThermo Fisher Scientific12-544-2
22 x 22 mm cam lameller No 1VWR48366-067
Dapi Fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Çift taraflı bantScotch
NutatorClay Adams
İnce fırça #0, #3- #5Çeşitli satıcılar
Gilson Pipetman Başlangıç KitiThomas ScientificF167300p20, p200, p1000 içerir pipetleyiciler
%16 ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimleri15710%4'e seyreltin paraformaldehit
10xAmbion
Birincil antikorlar (protokolde: 7G10 anti-Fasiclin III 1:250 seyreltilmiş, tavşan anti-fosfohiston H3 1:1000 seyreltilmiş)Çeşitli satıcılar (protokolde: Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası, Millipore)% 0.5 Triton konsantrasyonu ile PBST'de seyreltin
İkincil antikorlar (protokolde: Alexa-546, FITC konjuge anti-tavşan serumu)Çeşitli satıcılar (protokolde: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)PBST'de% 0.5 Triton konsantrasyonu ile seyreltin
Sinek şişeleriDenville ScientificV9406
Pamuk Topları, Geniş Şişeler İçinGenesee Scientific51-102W
Maya, Fırıncılar Kurutulmuş AktifMP Biyomedikal101400
Sinek yemiLaboratuvardaüretilmiştirSu, bira mayası, mısır unu, pekmez, agar, EtOH, penisilin, metil 4-hidrobenzoat ve propiyonik asit karışımı
Erkek ve dişi Drosophila sinekler (protokolde kullanılan genotip: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)Bloomington Drosophila Stok Merkezi
1x PBS Triton Sigma-Aldrich 9002-93-1'de PBS AM9624 1x PBS Normal Keçi Serumu Jackson ImmunoResearch 5000121 PBST'de %0,5 Triton konsantrasyonu ile %10 normal keçi serumuna seyreltin

Kaynaklar

  1. Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
  2. Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
  3. Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
  4. Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
  5. Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
  6. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  7. Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
  8. Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
  9. Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).
  10. Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
  11. King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
  12. Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
  13. Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
  14. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537(2011).
  15. Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
  16. Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
  17. Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
  18. Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
  19. Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
  20. Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
  21. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52(2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Over Yumurtalık DiseksiyonuYağ Cismi UzaklaştırmaOdacıklı Lamelİmmünohistokimyasal BoyamaPupa Kabuğu UzaklaştırmaPBS ile YıkamaPens ManipülasyonuMontaj Medyumu UygulamasıKök Hücre Bölünmesi
Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.