Method Article

Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti

DOI:

10.3791/56794

⸱

September 19th, 2018

1Uppsala University, Dept. Immunology, Genetics and Pathology, Rudbeck Laboratory, 751 85, Uppsala, Sweden

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapiller isoelectric odaklanarak proteinler ve onların izoformlarının son derece küçük biyolojik örneklerinden detaylı karakterizasyonu etkinleştirme bir antikor tabanlı, vericiyi, yüksek üretilen iş, tekniğidir. Aşağıda bir protokol olarak algılanmasını ve miktar belirli proteinlerin ve onların izoformlarının otomatik ve robotized bir şekilde açıklanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoblotting biyolojik örneklerinden protein karakterizasyonu için birçok laboratuarlarında rutin bir teknik haline gelmiştir. Aşağıdaki iletişim kuralı bir alternatif strateji sağlar, kapiller isoelectric (cIEF), pek çok avantajı ile odaklama için geleneksel immunoblotting karşılaştırıldığında. Bu yordamın tamamı Batı blotting bir ultrathin kılcal içinde gerçekleştiği bir antikor tabanlı, otomatik, hızlı ve nicel bir yöntemdir. Bu teknik bir membran lekesi sıyırma, aktarmak için bir jel gerektirmez veya geleneksel immunoblotting için genellikle gerekli olan filmler, x-ışını. Burada, proteinler onların ücret (isoelectric noktası; pI) göre kullanarak daha az bir microliter ayrılır (400 nL) Toplam protein lysate. Elektroforez sonra proteinler, kapiller duvarları ultraviyole ışık tedavisi, birincil ve ikincil (horseradish peroksidaz (HRP) Birleşik) tarafından takip tarafından immobilize antikor kuluçka bağlantısını aracılığıyla algılandığında, gelişmiş Kemiluminesan (ECL), yakalanan ve bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera tarafından kaydedilen bir ışık sinyal üreten. Dijital görüntü analiz edilebilir ve (pik alanı) sayısal yazılım kullanarak. Bu yüksek üretilen iş yordamı 96 örnekleri teker teker işleyebilir; Son derece hassas, protein algılama picogram aralığında olduğunu; ve otomasyon nedeniyle son derece tekrarlanabilir sonuçlar üretir. Örnekleri (Örneğin, doku örnekleri ve biyopsi) miktarı kısıtlayıcı bir faktör olduğunda tüm bu yönleriyle son derece değerlidir. Teknik uyuşturucu veya antikorlar, biyomarker keşif ve tanılama amacıyla tarama dahil olmak üzere de, daha geniş uygulama alanı vardır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapiller isoelectric (cIEF) odaklanarak proteinler onların ücret1,2,3temel alınarak giderir, kılcal tabanlı otomatik immunoassay olduğunu. Bu son derece tekrarlanabilir ve proteinler ve onların post-translationally değiştirilmiş izoformlarının hızla ve kantitatif çözme yeteneğine sahip olduğunu. Western Blot gibi geleneksel yöntemlerle bir alternatif sunar. Western blot kolayca erişilebilir örnekleri bol proteinlerin varlığı teyit için çok iyi olmakla birlikte; değişkenliği, zaman tüketimi ve doğru Nefelometri tüm mevcut sorunlar, özellikle biyolojik doku örnekleri incelerken....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hücre kültürü, stimülasyon ve lizis

Not: Bu yöntem çok hücre türü ile kullanılabilir. Yöntem göstermek için örnek insan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) kullanarak tanımlanır.

  1. Kültür HUVECs uygun takviyesi ile endotel hücre bazal ortamda 10 cm Petri yemekleri jelatin kaplı (bkz. Tablo reçetesi) ve ayrıca % 5 FCS, epidermal büyüme faktörü (5 ng/mL), vasküler endotelyal büyüme faktörü içeren (VEGF: 0,5 ng/mL), temel FGF (10 ng/mL), insülin benzeri büyüme faktörü (20 ng/mL), hidrokortizon (0.2 µg/mL) ve askorbik asit (1 µg/mL).
  2. Hücreler endotel hücre bazal orta % 1 FCS ve hiçbir büyüme faktörü ek t....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni bir testin tasarım: Bir tahlil plaka Düzen Şekil 1Aile gösterilir. Sonuna kadar 96 wells 384-şey plaka blok 12 Wells (antikor) her koşul için kullanılabilir. Her blok 12 Wells A1-A12 veya A13-A24 başlayabilirsiniz. Renk kodlu satır örnekleri ya da reaktifler birbirinden ayırt etmek izin. Tahlil şablon (Şekil 1B), ilgili bilgi için bu özel tahlil, hangi-ebilmek var olmak kullanılmış sonuç analizi daha sonraki.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Duyarlılık ve kararlılık proteinlerin biyolojik örnekler proteomik araştırma için çok önemli. Hücrelerdeki dakika miktarlarda olan proteinleri tespit etmek mümkün olmakta çok değerli şey. cIEF geliştirilmiş hassasiyet ve proteinler ve onların izoformlarının4tespiti için çözünürlük sunabilir.

Bu teknoloji birçok proteomik araştırma raporları5,6,7' başarıyla kullanılmaktadır. Yin.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar hiçbir açıklamalar vardır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar Prof. Lena Claesson-Welsh, Uppsala Üniversitesi, İsveç bu proje geliştirmek için ona destek için teşekkürler. Ayrıca, yazar Ross Smith ve Lena Claesson-Welsh, Uppsala Üniversitesi'nde kendi eleştirel okuma ve el yazması geliştirmek için öneriler için teşekkürler.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NanoPro 1000ProteinBasit
Premiks G2, pH 5– 8 (iç içe) ayırma gradyanı, pH 2– 4 fişliProteinSimple040-972Amfolit premiksi
DMSO inhibitör karışımıProteinSimple040-510Fosfataz inhibitörleri; cIEF 1:50 seyreltme için kullanılan
Sulu İnhibitör KarışımıProteinSimple040-482Proteaz inhibitörü; cIEF 1:25 seyreltme için
kullanılan pI standart merdiven 3ProteinSimple040-646CIEF 1:60 seyreltme için kullanılan
Numune seyrelticiProteinSimple040-649
Antikor seyreltici ProteinSimple040-309
Yıkama konsantresiProteinSimple041-108
Anolit DolumProteinSimple040-337
Katolit DolumProteinSimple040-338
Peroksit XDRProteinSimple041-084
LuminolProteinSimple040-652
Bicine/CHAPS Lizis Tampon ProteinSimple040-764
Kılcal Şarj Ayırma (1 paket) için ProteinSimpleCBS700
Test Plakası / KapakKiti ProteinSimple040-663
Peroksidaz-AffiniSaf Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L) Jackson İmmün Araştırmaları 711-035-152Kullanılan cIEF için (1: 300)
Peroksidaz-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson İmmün Araştırmaları 715-035-150Kullanılan cIEF için (1: 300)
Fosfo-Erk 1/2 Primer AntikorHücre Sinyali9101Kullanılan cIEF için (1: 50)
Pan Erk Primer AntikorHücre Sinyali9102Kullanılan cIEF için (1: 100)
Pusula yazılımıProteinSimple
HUVECATCCPCS-100-010
MV2 (EBM-2)PromoCell& nbsp; C-22221Endotel hücresi bazal ortamı
Endotel Hücre Büyüme Ortamı MV2 Ek PaketiPromoCellC-39221
VEGFAPeproTech100-20
Uzun R3 IGFSigma-Aldrich85580C / I1146İnsülin benzeri büyüme faktörü
Bioruptor (Sonikatör)DiagenodeB01020001
BCA Proteini Tahlil kiti Thermo Fischer Scientific23225
NuPAGE %4-12 Bis-Tris Protein JelleriThermo Fischer ScientificNP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Çalışma Tamponu (20X)Thermo Fischer ScientificNP0001
NuPAGE Transfer Tamponu (20X)Thermo Fischer ScientificNP0006
Immobilon PVDF membranKırlangıç IPVH00010
Mikrofüj tüpü girdap
Santrifüj Santrifüj
için mikrotitre
 
İpuçları
Buz
üzerinde MV2 Takviyesi Pipetleyiciler plaka adaptörü

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
  2. Aspinall-O'Dea, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Capillary Isoelectric FocusingProtein Isoform DetectionAutomated Western BlottingEnhanced Chemiluminescence DetectionCharge Coupled Device CameraProtein Lysate AnalysisAntibody Based QuantificationHigh Throughput ScreeningBiomarker Discovery ApplicationsIsoelectric Point Separation

Related Articles