Yöntem makalesi

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

11.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56820

⸱

21 Aralık 2017

 ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Boston University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Translasyonel yönetmelik protein bereket kontrolünde önemli bir rol oynar. Burada, kantitatif analiz tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeçeviri için bir yüksek-den geçerek yöntemi açıklanmaktadır.

Özet

MRNA tercüme proteinler düzenleme birkaç kat içeren karmaşık bir işlemdir. Bu kez değişiklikleri protein sentezi mRNA transkripsiyon değişiklikleri yansıtmak, ama pek çok özel durumlar gözlenmiştir varsayılır. Son zamanlarda, ribozom profil oluşturma (Ribo Seq) adında bir teknik veya kimlik, mRNA hangi bölgelerinde protein ve miktar çeviri genom geneli düzeyinde çevriliyor yüksek doğrulukla sağlar güçlü bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Burada, genom çapında miktar Ribo Seq mayası içinde kullanarak çeviri için Genelleştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut. Buna ek olarak, mRNA bereket ölçümleri ile Ribo Seq veri birleştirerek aynı anda mRNA transkript aynı örnek içinde binlerce çeviri verimliliğini ölçmek ve bu parametreler deneysel cevaben değişiklikleri karşılaştırmak için bize izin verir işlemler veya farklı fizyolojik devletler. Biz üretimi ile birlikte uygun derin sıralama için nükleaz sindirim, bozulmamış ribozom-ayak izi kompleksleri Sükroz degrade ayırma ile yalıtım ve hazırlık DNA kütüphanelerinin kullanarak ribozom ayak izi için detaylı bir protokol tarif Kalite denetimleri doğru analiz vivo içinde çeviri sağlamak için gerekli.

Giriş

Hücredeki protein ifade yönetmelikte önemli bir rol oynayan temel işlemlerden biri mRNA çevrilmiştir. Bu nedenle, mRNA çeviri sıkı farklı iç ve dış fizyolojik uyaranlar 1,2yanıt olarak kontrol edilir. Ancak, translasyonel düzenleme mekanizmaları çöküşünde kalır. Burada, biz genom çapında miktar mayası çeviri için protokol ribozom profil oluşturma açıklanmaktadır. Ribozom profil çıkarma tekniği genel amacı çalışma ve çeşitli hücresel koşullarda belirli mRNA'ların çeviri ölçmek etmektir. Bu teknik ribozom doluluk genom boyunca kantitatif analiz için yeni nesil sıralama kullanır ve protein sentezi vivo içinde tek kodon çözünürlük 3,4oranı izleme sağlar. Şu anda, bu yöntem protein çeviri düzeyde ölçmenin en gelişmiş araçlar sağlar ve mevcut diğer tekniklerle, örneğin microarrays ortaya bilgi veren yararlı keşif aracı olduğu ispatlanmıştır veya Çeviri Durumu dizi analizi (TSAA) 5. Transkript düzeyleri ve çevirim çıkış birleştirilmiş değişiklikleri ile ilgili raporlar profil oluşturma ribozom da diğer yöntemlerine göre çok daha fazla hassasiyet sağlar.

Bu yaklaşım mRNA parçaları 3ribozom korumalı derin sıralama üzerinde temel alır. Ribozomlarda protein çeviri sırasında korumak ~ 28 nt bölümlerini (ayak izleri olarak adlandırılır) mRNA 6. Ribozom tarafından korunan parçaları dizisi belirleyerek, Ribo Seq ribozomlara çevrilmiş mRNA üzerinde konumunu harita ve mRNA hangi bölgelerinde aktif protein 3,7olarak tercüme edilebilir muhtemeldir tanımlamak. Buna ek olarak, biz kantitatif mRNA tercümesi verilen bir mRNA transkript hizalamak ayak izleri sayısını sayarak ölçebilirsiniz.

Ribozom tarafından korunan parçaları ayırmak için hücre lysates başlangıçta ribonükleaz sindirim tarafından takip ribozomlara oyalamak için bir çeviri önleyici ile tedavi edilir. Ücretsiz mRNA ve ribozomlar tarafından korunmamasına çevrilmiş mRNA'ların bölümlerini ribonükleaz tarafından bozulmuş ise, ribozom korumalı mRNA parçaları sağlam ribozom-ayak izi kompleksleri arındırıcı tarafından elde edilebilir. Bu mRNA ayak sonra cDNA kitaplığa dönüştürülür ve derin sıralama (şekil 1) tarafından analiz. Ribozom profil oluşturma için paralel olarak sağlam mRNA aynı örneğinden ayıklanmış ve sıralı. MRNA bereket ölçümleri ile Ribo-Seq tarafından tanımlanan çeviri düzeyini karşılaştırarak, biz özellikle up - veya aşağı-düzenlenmiş çeviri düzeyde olan genlerin tanımlamak ve mRNA genom geneli düzeyinde verimliliğini çeviri hesaplamak. Bu makalede açıklanan protokol için Maya belirli olmakla birlikte, aynı zamanda diğer sistemlerde Ribo Seq Protokolü kurmaya çalışacağız araştırmacılar için yararlı olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hazırlık ayıklamak

  1. YPD plakaları (% 1 Maya ekstresi, % 2 pepton, % 2 glikoz ve %2 agar) çizgi Maya suşları tek kolonileri için dondurulmuş hisse senedi üzerinden. Tabak 30 ° C'de 2 gün kuluçkaya.
  2. YPD orta (% 1 Maya ekstresi, % 2 pepton, % 2 glikoz) 50 mL konik santrifüj tüpü 15 mL içine Maya YPD plaka (kullanım bir koloni) aşılamak ve gecede 30 ° C'de (200-250 devir/dakika) sallayarak ile büyümek
  3. Kültür YPD ortamda bir 2 L steril şişe 500 mL içine oranında seyreltin böylece OD600 < 0,1. 3-5 h için 30 ° C'de OD600 kadar sallayarak ile Maya hücreleri büyümek 0,5 (orta log fazı) =.
  4. Hücreleri bir cam tutucu filtre derleme kullanarak 0,45 mikron membran filtreler aracılığıyla filtre uygulayarak toplamak. Bir spatula, sıvı azot, flaş donma ile Pelet scrape ve-80 ° C'de depolayın Donmuş Pelet beklenen boyutu ~ 0,2 - 0,5 g.
    Dikkat: Son derece düşük sıcaklık sıvı azot olduğunu; uygun koruma giymek.
  5. Taze lizis arabellek hazırlamak (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 μg/mL sikloheksimit, 0,5 mM DTT, % 1 Triton X-100) kullanımdan hemen önce buz üstünde tutun.
  6. 3 krom-çelik boncuk (3.2 mm) 1,8 mL paslanmaz çelik boru koymak. Sıvı nitrojen içinde önceden sakin ve donmuş granül eklemek için bir silikon kauçuk kapaklı kapağı. Cryogrinding 10 tarafından örnek homojenize s 4200 RPM; 10 kez tekrarlayın. En az 10 için sıvı azot tüp chill s arasında her turda.
    Not: Her zaman donmuş örnek tutmak önemlidir.
  7. 1 mL lizis arabellek ekleyin, de pipetting tarafından mix. Yeni 1,5 mL tüp içine aktarın.
  8. 4 ° C'de 5 min için 20.000 x g, santrifüj Buz üzerinde çalışırken, süpernatant yeni 1,5 mL tüp içine aktarın. Lysate, 100 μL yeni 1,5 mL tüp Poli(a) mRNA izolasyonu için transfer. Derhal RNA izolasyon veya flaş dondurma için sıvı azot tüp gidin. Hangi ayak izi çıkarma için kullanılır ve birden parlamak ölçü birimi OD260 lysate, geri kalan sıvı nitrojen tüpleri dondur. Lysates-80 ° C'de depolayın

2. ayak izi çıkarma

  1. Sükroz degradeler hazırlanması
    1. % 50, % 40, % 30, % 20 ve % 10 Sükroz degrade arabelleği (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 μg/mL sikloheksimit, 0,5 mM DTT) çözümleri hazırlayın.
    2. Hazırlanan % 50 Sükroz arabelleği 13.2 mL ince duvar polyallomer tüp altına 2,2 mL pipet ve Don eriyik için 10 dk-80 ° c (Şekil 2). Sonra 2,2 mL % 40 Sükroz arabelleği donmuş % 50 Sükroz arabellek üst katman ve-80 ° C'de 10 dakika için dondurma Ardından aynı talimatlar, katman % 30, sonra % 20 ve son olarak % 10 Sükroz üstüne birbirinden arabelleğe alır. Hava kabarcıkları katmanlama süre yapmaktan kaçının. Degradeler-80 ° C'de kullanımda kadar devam. Sükroz degradeler en az bir gün önce deney hazırlanmış ve-80 ° C'de depolanan
  2. Nükleaz sindirim
    1. Sükroz degradeler deneyler 4 ° C'de önceki gece tezcan
    2. Cep lysate (ayak izi örnek) buz çözme. Bir aliquot hücre 50 OD260 adet yeni 1,5 mL tüp içeren lysate nakletmek ve taze lizis arabellek eklemek 1 mL. -80 ° C'de lysate kalan mağaza 10 μL eklemek RNase ben (100 U/μL) ve bir baş-over-topuk rotator nazik rotasyon ile oda sıcaklığında 1 h kuluçkaya.
    3. (İsteğe bağlı) 20.000 x g 4 ° C'de 5 min için de örnekleri açıklamak ve süpernatant yeni 1,5 mL tüp içine kurtarmak.
  3. Ultrasantrifüj
    1. Yavaşça lysate örnekleri 10-%50 Sükroz degrade üst katman.
    2. Ultracentrifuge polyallomer 210.000 x g (35.000 devir/dakika) için 3 SW-41 Ti rotor kullanarak h 4 ° C'de, tüpleri.
  4. Degrade ayırma sistem kurulumu
    1. Bileşenler açmak ve UV monitör ısınma için en az 30 dk için izin.
    2. Bir dijital kaydedici yazılımı kullanmaya başlamak belgili tanımlık bilgisayar yazılımı bilgisayarda, grafiğin ölçekleme sınırları-0.01 ve 1 ayarlayın.
    3. Şırıngaya doldur Chase çözüm (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, % 60 Sükroz) ile herhangi bir hava kabarcıkları şırınga ve kanül içinde kaldırmak.
    4. RNase free su ile dolu bir ultracentrifuge tüp yükleyin. İki siyah işaretleri görülebilir kadar tüp kanül ile pierce. 1 mL/dk şırınga pompa başlatın.
    5. Su akışı cep geçerken, satır taban çizgisine 0 ayarlamak için UV monitörde "Otomatik sıfır" düğmesine basın. UV izlemek için duyarlılık "2.0 AU". İstikrarlı bir temel ayarlandıktan sonra şırınga pompa durdurun. Chase çözüm yeniden elde etmek ve ultracentrifuge tüpü çıkarması.
  5. Monosome yalıtım
    1. Yükleyin ve sukroz degrade içeren ultracentrifuge tüp pierce. 1 mL/dk şırınga pompa başlatmak,254 değerleri izleme 1 mL kesirleri toplamak. 80 lerin monosome en yüksek temsil eden bir tüpün içine kesirler havuz, buz (şekil 3) tutmak.
    2. Chase çözüm akışı hücre ulaştıktan sonra şırınga pompa durdurun. Chase çözüm yeniden elde etmek ve ultracentrifuge tüpü çıkarması. Ayırma 2.5.1 adımda başlangıç örnekleri geri kalanı için yineleyin.
      Not: ne zaman tamamlanmak, en az 30 mL ayırma sistemiyle RNase free su temiz. Boru, şırınga ve tüm çıkarılabilir bileşenleri ılık suyla iyice yıkayın.
    3. Kesirler 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de 0.5 mL santrifüj filtrelerden (100 kDa MWCO) filtre ve akış yoluyla atmak, birim kadar yineleyin < 100 μL. Çıkış arabelleği (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 2 mM EDTA, 40 U/mL RNase inhibitörü) 400 μL ekleyin. Pipetting tarafından Mix kuluçkaya 10 dk buz ve birimi yeni bir koleksiyon tüp içine aktarın. 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de santrifüj kapasitesi ve akışı aracılığıyla toplamak.
  6. Ayak izi parçası arıtma
    1. Yeni 1,5 mL tüp, SDS (için bir son konsantrasyonu % 1), mix pipetting tarafından % 20 20 μL eklemek için akışı aracılığıyla içeren ayak izi RNA parçaları aktarın.
    2. Asit 1 birim eklemek-fenol: kloroform (pH 4.5), 10 için girdap s.
      Dikkat: Asit-fenol: kloroform toksik, cilt ve solunum yolu ile temasından sakının.
    3. 5 min için 65 ° C'de ısı, buz 1 dk. 4 ° C'de 5 dakika santrifüj örneği 12.000 x g'koymak, sulu faz (üst) yeni bir 1,5 mL tüp transfer.
    4. Ayak izi RNA parçaları 1/10 NaOAc (pH 5.5), glikojen (10 mg/mL) hacmi 1/100 ve % 100 etanol 2.5 hacimleri hacmi ekleyerek çökelti.
-20 ° c en az 1 h için kuluçkaya.

3. Poli(a) mRNA çıkarma

  1. Toplam RNA çıkarma
    1. 100 μL aliquot hücre lysate (Toplam RNA örnek) buz çözme, 20 mM Tris-HCl pH 7,0 ve 20 μL SDS (için bir son konsantrasyonu % 1), mix pipetting tarafından % 20, 300 μL ekleyin.
    2. 1 birim (400 μL) asit eklemek-fenol: kloroform (pH 4.5) ve 10 için girdap s.
    3. 5 min için 65 ° C'de ısı, buz 1 dk. 4 ° C'de 5 dakika santrifüj örneği 12.000 x g'koymak, sulu faz (üst) yeni bir 1,5 mL tüp transfer.
    4. İkinci bir fenol çekimi gerçekleştirmek. Asit 1 birim eklemek-fenol: (pH 4.5), kloroform 5 min için 65 ° C'de 10 s. ısı için girdap koymak buz 1 dk. 4 ° C'de 5 dakika santrifüj 12.000 x g örnek, yeni bir 1,5 mL tüp sulu faz transfer.
    5. RNA çökelti. Bunun için 3 M NaOAc (pH 5.5), glikojen (10 mg/mL) hacmi 1/100 ve % 100 etanol 2.5 hacimleri hacmi 1/10 ekleyin. -20 ° c en az 1 h için kuluçkaya.
  2. Poli(a) mRNA yalıtım
    1. 20.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de RNA örnekler santrifüj kapasitesi, etanol kaldırın. Spin 30 s maksimum hızda jel-yükleme bahşiş ile etanol geri kalanı kaldırın ve hava kuru Pelet 5 min için.
    2. Lizis/bağlama arabellek Poli(a) mRNA yalıtım Takımı'ndan 300 μL Pelet geçiyoruz. Poli(a) mRNA ayıklama Poli(a) mRNA yalıtım seti üreticisinin protokolüne göre devam edin.
    3. MRNA örnekleri 3 M NaOAc (pH 5.5), glikojen (10 mg/mL) hacmi 1/100 ve % 100 etanol 2.5 hacimleri hacmi 1/10 ekleyerek çökelti. -20 ° c en az 1 h için kuluçkaya.
  3. mRNA parçalanma
    1. 20.000 x g 4 ° C'de 30 dk için mRNA örnekler santrifüj kapasitesi, etanol kaldırın. Spin 30 sn, etanol jel yükleme ile geri kalanı çıkarmak ipucu ve hava kuru Pelet 5 min için.
    2. MRNA su RNase free 18 μL içinde resuspend, 10 RNA parçalanma arabellek x 2 μL ekleyin. 94 ° C'de 5 dk kuluçkaya Buz için tüp aktarın.
    3. 3 M NaOAc (pH 5.5), glikojen (10 mg/mL) hacmi 1/100 ve % 100 etanol 2.5 hacimleri hacmi 1/10 ekleyerek çökelti. -20 ° c en az 1 h için kuluçkaya.

4. dephosphorylation

  1. Ayak izi ve parçalanmış mRNA örnekleri T4 polinükleotit kinaz ile tedavi. Bunun için 20.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de örnekler santrifüj kapasitesi, etanol kaldırın. Spin 30 s maksimum hızda ipucu yükleme bir jel ile etanol geri kalanı kaldırın. Hava Kuru Pelet 5 min için.
  2. Pelet su 7.75 µL içinde resuspend, 10 x T4 polinükleotit kinaz arabelleği 1 µL, T4 polinükleotit kinaz (10.000 U/mL) 1 µL ve RNase inhibitörü (20 U/µL) 0,25 µL ekleyin. 1 h 37 ° C'de kuluçkaya
  3. (İsteğe bağlı) % 15 TBE-üre jel önceden 180 V 1 x TBE tampon kullanarak 15dk için çalıştırın.
  4. 2 X TBE-üre örnek arabellek 10 µL her ayak izi ve mRNA örnek 10 µL için ekleyin. 10 µM üst boyutu marker Oligonükleotid 1 µL içeren bir denetim örnek hazırlamak (32 nt), 10 µM alt boyutu marker Oligonükleotid 1 µL (28 nt), 8 µL su ve 2 x TBE-üre örnek arabellek ayak izi örnekleri için 10 µL. 10 µM RNA marker Oligonükleotid 1 µL içeren bir denetim örnek hazırlamak (63 nt), 9 µL su ve 2 x TBE-üre örnek arabellek mRNA örnekleri için 10 µL.
  5. Örnekleri ve denetimleri 75 ° C'de 3 dk kuluçkaya, spin aşağı, 1 dk. yüklemek için her örnek 2 wells tarafından Jel Elektroforez vasıl 180 V 1 h için ayrı RNA parçaları % 15 TBE-üre jel içine buza koy.
  6. Leke 5 min için jel ile bir nükleik asit jel leke (suda seyreltik 10.000 x), ışıktan korumak.
  7. Mavi bir ışık transilluminator, ayak izi örnekleri (şekil 4A) ve yaklaşık 28 ve 32 nt işaretçileri arasındaki uygun bant kesme kullanarak 50-70 nt mRNA için temiz bir tıraş bıçağı ile (şekil 4B) örnekler. Polyacrylamide jel parçaları için en az 10 dk-80 ° C'de dondurmak.
  8. RNA polyacrylamide jel aşağıdaki gibi ayıklayın. Jel adet 2 min için 70 ° C'de ısı, tek kullanımlık Pelet dibekler kullanarak jel eziyet. RNA ile 300 µL elüsyon tampon (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 2 mM EDTA) elute, 1 µL RNase inhibitörü (20 U/µL) ekleyin ve 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
  9. 12.000 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi, süpernatant toplamak ve NaOAc (pH 5.5), ekleme 1/10 hacimce glikojen (10 mg/mL) hacmi 1/100 ve % 100 etanol 2.5 miktarda çökelti. -20 ° c en az 1 h için kuluçkaya.

5. 3'-adaptör ligasyonu

  1. 20.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de ayak izi ve mRNA örnekler santrifüj kapasitesi, etanol kaldırın. Spin 30 s maksimum hızda kaldırmak jel-yükleme bahşiş ile etanol geri kalanı. Hava Kuru Pelet 10 dk için.
  2. Pelet nükleaz ücretsiz su 4.75 µL içinde resuspend, PEG8000, 1 µL 10 X T4 RNA ligaz arabelleği, 3'-adaptörü (100 ng/µL), RNase inhibitörü (20 U/µL), T4 RNA ligaz 2 in 1 µL 0,25 µL 1 µL % 50 2 µL kesildi KQ (200.000 U/mL). Gecede 16 ° C'de kuluçkaya
  3. Ertesi sabah, 5'-deadenylase (10 U/µL) 0.5 µL ve Rec J eksonükleaz aktivitesi (10 U/µL) 0.5 µL ligasyonu tepki doğrudan ekleyerek bağdaştırıcısı fazlalığı kaldırın. 30 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
  4. Örnekleri çökelti. Bunun için 30 µL nükleaz ücretsiz su, 1 µL glikojen (10 mg/mL), NaOAc (pH 5.5) hacmi 1/10 ve % 100 etanol 2.5 birimleri ekleyin. -20 ° c en az 1 h için kuluçkaya.

6. ters transkripsiyon

  1. 20.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de örnekler santrifüj kapasitesi, etanol kaldırın. Spin 30 s maksimum hızda kaldırmak jel-yükleme bahşiş ile etanol geri kalanı. Hava Kuru Pelet 10 dk için.
  2. Pelet nükleaz ücretsiz su 11,5 µL içinde resuspend, 8 µM ters transkripsiyon astar (RT astar) 0.5 µL ve 1 µL dNTP mix (10 mM) ekleyin. 65 ° C'de 5 min için kuluçkaya, Buza koyun.
  3. İlk strand arabellek, 0.1 m DTT, RNase inhibitörü (20 U/µL), ters transkriptaz (200 U/µL) 0.5 µL 0.5 µL 2 µL X 5 4 µL ekleyin. 48 ° C, 65 ° c, 80 ° C'de 5 dk 1 dk, 30 dk için kuluçkaya
  4. Çökelti don't ve hemen RNA, hidroliz için 0.8 µL 2 M NaOH ekleyerek devam, 98 ° C'de 30 dk kuluçkaya Eklemek 0.8 µL 2 M HCl tepki nötralize etmek için.
  5. Örnekleri çökelti.
Bunun için 20 µL nükleaz ücretsiz su, 1 µL glikojen (10 mg/mL), NaOAc (pH 5.5) hacmi 1/10 ve % 100 etanol 2.5 birimleri ekleyin. -20 ° c en az 1 h için kuluçkaya.
  • 20.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de örnekler santrifüj kapasitesi, etanol kaldırın. Spin 30 s maksimum hızda kaldırmak jel-yükleme bahşiş ile etanol geri kalanı. Hava Kuru Pelet 10 dk için.
  • Pelet nükleaz ücretsiz su 5 µL içinde resuspend, 2 X TBE-üre örnek arabellek 5 µL ekleyin. 3 dk. 75 ° C'de kuluçkaya, spin aşağı, 1 dk. için buz koymak.
  • (İsteğe bağlı) % 10 TBE-üre jel önceden 180 V 1 X TBE tampon kullanarak 15dk için çalıştırın.
  • Örnek 1 de % 10 TBE-üre jel üzerinde yük. Ters transkripsiyon reaksiyon ürünleri tarafından Jel Elektroforez vasıl 180 V 50 dk ayırın. Bir denetim olarak 1 µL 2.5 µM RT astar, 2.5 µM 128 nt marker Oligonükleotid, 3 µL su, 1 µL içeren bir örnek hazırlamak ve 2 X TBE-üre 5 µL arabellek örnek ve jel ayrı bir lane üzerinde çalıştırın.
  • Leke 5 min için jel ile bir nükleik asit jel leke (suda seyreltik 10.000 x), ışıktan korumak. Mavi bir ışık transilluminator kullanılarak kesme grubu yaklaşık 128 nt ve daha yüksek (şekil 5) temiz bir tıraş bıçağı ile. Polyacrylamide jel parçaları için en az 10 dk-80 ° C'de dondurmak.
  • Jel adet 2 min için 70 ° C'de ısı, tek kullanımlık Pelet dibekler kullanarak jel eziyet. DNA 20 mM Tris-HCl pH 7,0 300 µL ile elute ve 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
  • Örnek 4 ° C'de 5 min için 12.000 x g, santrifüj kapasitesi, süpernatant toplamak ve NaOAc (pH 5.5), ekleme 1/10 hacimce glikojen (10 mg/mL) hacmi 1/100 ve % 100 etanol 2.5 miktarda çökelti. -20 ° c en az 1 h için kuluçkaya.

    • 7. daireselleşmesi

    1. 20.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de örnekler santrifüj kapasitesi, etanol kaldırın. Spin 30 s maksimum hızda jel-yükleme bahşiş ile etanol geri kalanı kaldırın ve hava kuru Pelet 10 dk için.
    2. Pelet nükleaz ücretsiz su 16.75 µL içinde resuspend. 10 tek iplikçikli DNA (ssDNA) ligaz arabellek, 50 mM MnCl2, 0.25 µL ssDNA ligaz olan 1 µL x 2 µL ekleyin (100 U/µL). 60 ° C'de, 80 ° C'de 10 dk 1 h için kuluçkaya Değil çökelti ve ssDNA tüp ligasyonu reaksiyon ürünü-20 ° C'de depolayın

    8. PCR Kütüphane amplifikasyon

    1. Buz üzerinde çalışma mix iken bir PCR tüp sayfalarımızda: nükleaz ücretsiz su, 20 µM ileri astar, 2 µL 20 µM dizine ters astar, 5 x yüksek sadakat DNA plymerase arabellek, dNTPs (10 mM) 4 µL, ssDNA tüp ligasyonu reaksiyon ürünü 4 µL 40 µL 2 µL 146 µL ve yüksek-sadakat DNA polimeraz 2 µL. Sıralama için multiplexed her örnek için farklı bir dizine ters astar seçin. PCR karışımı bir 50 µL aliquot 4 yeni PCR tüpler içine aktarın.
    2. PCR güçlendirme döngüsü (8, 10, 12, 14) değişken sayısı ile gerçekleştirmek aşağıdaki ayarları kullanarak:
      1 dk 98 ° C ilk denatürasyon az
      8-14 döngüsü:
      15 s 94 ° c
      5 s 55 ° c
      10 s 65 ° c
      2 dk 65 ° C son uzantısı az
    3. PCR ürünü 3 M NaOAc (pH 5.5), glikojen (10 mg/mL) hacmi 1/100 ve % 100 etanol 2.5 hacimleri hacmi 1/10 ekleyerek çökelti. -20 ° c en az 1 h için kuluçkaya.
    4. 20.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de örnekler santrifüj kapasitesi, etanol kaldırın. Spin 30 s maksimum hızda jel-yükleme bahşiş ile etanol geri kalanı kaldırın ve hava kuru Pelet.
    5. Pelet nükleaz ücretsiz su 8 µL içinde resuspend, denaturing 5 nükleik asit örnek arabellek x 2 µL ekleyin. Örnek 1 de bir sigara denaturing % 8 TBE jel üzerinde yük. DNA ürünleri tarafından Jel Elektroforez 150 V 35 dakika ayırın. Bir denetim olarak 10 bp DNA merdiven (1 µg/µL), 7.5 µL su ve sigara denaturing 5 nükleik asit örnek arabellek x 2 µL 0.5 µL içeren bir örnek hazırlamak ve jel ayrı bir lane üzerinde çalıştırın.
    6. Leke 5 min için jel ile bir nükleik asit jel leke (suda seyreltik 10.000 x), ışıktan korumak. Mavi bir ışık transilluminator kullanılarak kesme grubu yaklaşık 150 bp ayak izi örnekleri ve yaklaşık 180 bp için temiz bir tıraş bıçağı ile mRNA örnekleri (şekil 6). Jel parçaları için en az 10 dk-80 ° C'de depolayın.
    7. Jel adet 2 min için 70 ° C'de ısı, tek kullanımlık Pelet dibekler kullanarak jel eziyet. DNA 20 mM Tris-HCl pH 7,0 300 µL ile elute ve 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
    8. Örnek 4 ° C'de 5 min için 12.000 x g, santrifüj kapasitesi, süpernatant toplamak ve NaOAc (pH 5.5), ekleme 1/10 hacimce glikojen (10 mg/mL) hacmi 1/100 ve % 100 etanol 2.5 miktarda çökelti. -20 ° c en az 1 h için kuluçkaya.
    9. 20.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de örnekler santrifüj kapasitesi, etanol kaldırın. Spin 30 s maksimum hızda jel-yükleme bahşiş ile etanol geri kalanı kaldırın ve hava kuru Pelet. Son olarak, nükleaz ücretsiz su 20 µL kitaplıklarında resuspend ve miktar, kalite kontrol ve sıralama için devam edin.

    9. Kütüphane miktar ve yüksek işlem hacmi sıralama

    1. Örnekleri sıralama için göndermeden önce verim ve kalite PCR güçlendirilmiş kütüphanelerin belirler. Ayak izi ve mRNA sıralama kitaplıklar için temsilcisi profilleri Şekil 7' de gösterilir. Beklenen PCR güçlendirilmiş Kütüphane ayak izi örnekleri için 148-152 bp ve mRNA örnekleri için 170-190 bp boyutudur.
    2. Farklı barkod ile çeşitli örnekleri sıralama için havuza alınmış, kütüphanelerin bir qPCR tabanlı sıralama kitaplığı miktar tahlil kullanarak doğru miktar gerçekleştirin.
    3. Ekimolar oranları kitaplıklarda havuz. Havuzun hacmi x havuza alınmış örneklerinin toplam sayısı 3 µL olarak hesaplayın. Böylece kitaplıkları ekimolar oranlarının 10 nM nihai toplama havuzu elde etmek için karıştırılır eklenmesi gerekir her kitaplık hacmi belirlemek. Pipetting tarafından mix, her kitaplık hesaplanan miktarda yeni 1,5 mL tüp içine ekleyin. Hesaplanan toplam hacmi elde etmek için su ekleyin. Havuza alınan kütüphaneler-20 ° C'de depolayın
    4. Bir aliquot bir Illumina sıralama platformda çalıştırmak 50 bp tek taraflı kenar sıralama kullanarak sıralı için havuza alınan kitaplık gönderin. Biz düzenli olarak çalıştırın, hangi verimleri tek bir sıralama 12 örnekleri multiplex ~ 200 milyon sıralama lane okur.
      Not: Son okuma sayısı, her örnek toplanan ayak izi giriş malzeme miktarını ve rRNA bulaşma düzeyine bağlıdır.

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Sonuçlar

    Veri profil oluşturma ribozom bioinformatic çözümlenmesi için detaylı boru hatları-si olmak be daha önce açıklanan 8,9. Buna ek olarak, birçok araştırma grupları farklı gen ifade analizi ve ribozom yöntemi 10,11,12 profil oluşturma için özel sıralama veri işleme için Biyoinformatik araçlarını geliştirdik ,13<...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Tartışma

    Ribo Seq yaklaşım mRNA çeviri vivo içinde genom çapında düzey 3analizi için güçlü bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Çeviri ile tek-kodonu kararlılık izleme sağlar, bu yaklaşımı kullanarak çalışmalar translasyonel yönetmelik anlayışımızı katkıda bulunmuştur. Avantajları rağmen Ribo Seq bazı sınırlamaları vardır. Ribozomal RNA (rRNA) her zaman sırasında yalıtım Ribo Seq deneyler 9,25' elde edilebilir yararlı sıralama okuma veri...

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Açıklamalar

    Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

    Teşekkürler

    Bu eser sağlık hibe AG040191 ve AG054566 için VML Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. VML yaşlanma araştırma Amerikan Federasyonu AFAR araştırma bursu alıcıdan iken bu araştırma yapılmıştır.

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    0.45 μ M membran filtrelerMilliporeHVLP04700
    0,5 M EDTAInvitrogenAM9261
    0,5 mL santrifüj filtreler (100 kDa MWCO)MiliporeUFC510024
    1 M Tris-HCl, pH 7.0InvitrogenAM9850G
    1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 4 ° C; C)Invitrogen15567-027
    10X TBE tamponuInvitrogenAM9863
    %10 TBE-üre jeliInvitrogenEC6875BOX
    %15 TBE-üre jeliInvitrogenEC6885BOX
    2 M MgCl2RPIM24500-10.0
    2X TBE-üre numune tamponuInvitrogenLC6876
    3M NaOAc, pH 5.5İnvitrojenAM9740
    5' Deadenilaz (10 U/μ L)Merkez üssüDA11101K
    5X Nükleik asit numune yükleme tamponuBio-Rad161-0767
    %8 TBE jelInvitrogenEC6215BOX
    Asit-Fenol: Kloroform, pH 4.5 (IAA ile, 125: 24: 1)InvitrogenAM9722
    Mavi ışık transilluminatörüClare Chemical ResearchDR-46B
    Krom-çelik boncuklar, 3.2 mmBioSpec Ürünleri11079132c
    CryogrinderBiospec ürünü3110BX
    SikloheksimidRPIC81040-5.0
    Veri Toplama SistemiDATAQ InstrumentsDI-245
    Deoksinükleotid (dNTP) çözelti karışımı (10 mM)NEBN0447L
    GlikojenInvitrogenAM9510
    Gradyan fraksiyonlama sistemiBrandelBR-184X
    Yüksek kaliteli DNA polimeraz (2.000 U/mL)NEBM0530S5X Phusion HF Tamponu ile birlikte verilir
    Yeni nesil dizileme kitaplığı miktar belirleme kitiKapa BiosystemsKK4824
    Nükleik asit jel lekesiInvitrogenS11494
    Optima XE-90 ultrasantrifüjBeckman CoulterA94471
    Poli(A) mRNA izolasyon kitiInvitrogen61011
    Rec J eksonükleaz (10 U/μ L)Merkez üssüRJ411250
    Ters transkriptaz (200 U/μ L)İnvitrojen180800935X birinci iplikçik tamponu ve 0.1 M DTT
    RNA parçalanma tamponuNEBE6186A
    RNase I (100 U/μ L)İnvitrojenAM2295
    RNaz inhibitörü (20 U/μ L)InvitrogenAM2696
    Silikon kauçuk kapaklarBioSpec Ürünleri2008
    ssDNA ligaz (100 U/μ L)EpicentreCL9021K10X CircLigase II tamponu ve 50 mM MnCl ile birlikte verilir < alt > 2 < / alt >
    paslanmaz çelik mikroşişeler, 1.8 mLBioSpec Ürünleri2007
    SükrozRPIS24060-5000.0
    SW-41 Ti rotorBeckman Coulter331362
    Şırınga pompasıYeni Çağ Pompa SistemleriNE-300
    T4 polinükleotid kinaz (10.000 U/mL)NEBM0201S10X T4 polinükleotid kinaz tamponu ile birlikte verilir
    T4 RNA ligaz 2 kesik KQ (200.000 U/mL)NEBM0373S10X T4 RNA ligaz tamponu ve %50 PEG8000 ile birlikte verilir
    Termal döngüleyiciBio-Rad1851148
    İnce duvarlı poliallomer tüpler, 13,2 mLBeckman Coulter331372
    Triton X-100Sigma AldrichX100-100ML
    UV monitörüBio-Rad7318160
    Saccharomyces cerevisiae suşu BY4741Açık BiyosistemlerYSC1048

    Kaynaklar

    1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
    2. Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
    3. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
    4. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
    5. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
    6. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
    7. Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
    8. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
    9. Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
    10. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
    11. Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
    12. Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194(2016).
    13. Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
    14. Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309(2016).
    15. Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).
    16. Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
    17. Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
    18. Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
    19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
    20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
    21. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
    22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
    23. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
    24. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
    25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
    26. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
    27. Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
    28. Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
    29. Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
    30. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).
    31. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).
    32. O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915(2016).

    Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

    Yeniden basım ve izinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

    İzin iste

    Etiketler

    Translasyon NicelendirmesiSakkaroz Gradyan FraksiyonlamaNukleaz SindirimiRNA K t phanesi Haz rlamaDerin DizilemeTranslasyon Verimlili imRNA Bollu uGenom Boyutunda Analiz

    İlgili makaleler