Bu makalede, DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak malzeme son derece kalitesiz DNA'ın kurtarma dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol gösterilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Herbaria biyolojik çalışmalar çeşitli kullanılan bitki materyali paha biçilmez bir kaynaktır. Sulak örnekler kullanımı zorlukları örnek koruma kalitesi, bozulmuş DNA ve nadir örneklerin yıkıcı örnekleme dahil olmak üzere, bir dizi ile ilişkilidir. Daha etkili bir şekilde sulak malzeme büyük sıralama projelerde kullanmak için güvenilir ve ölçeklenebilir yöntemi DNA izolasyon ve Kütüphane hazırlanması gereklidir. Bu kağıt bir sağlam, başına sonuna protokol değişikliği için bireysel örnekleri gerektirmeyen DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi Kütüphane yapımı için sulak örnekler üzerinden gösteriyor. Bu iletişim kuralı, Kütüphane boyutu seçimi değiştirme ve düşük verim kitaplıkları için bir isteğe bağlı reamplification adım tanıtımı doku kabuğu optimize ederek düşük kaliteli kurutulmuş bitki malzeme ve alır avantajı mevcut yöntemler için hazırlanmıştır. Reamplification düşük verim DNA kütüphanelerinin yeri doldurulamaz ve potansiyel olarak değerli sulak numuneler, ihtiyaç için ek yıkıcı örnekleme ve fark edilebilir sıralama önyargı için ortak tanıtımı olmadan inkâr türetilen örnekleri kurtarabilirsiniz Filogenetik uygulamaları. Protokol çim türleri yüzlerce üzerinde test edilmiştir, ancak doğrulama sonra diğer bitki soy kullanmak için adapte olması bekleniyor. Bu iletişim kuralı nerede parçaları istediğiniz boyuta aralığında var olmayan, son derece bozulmuş DNA ve temiz DNA izolasyon inhibe Sekonder metabolitler bazı bitki malzeme mevcut sınırlı olabilir. Genel olarak, bu protokol bırakmak için DNA izolasyon ve az 13 h, 24 örnekleri kitaplığı hazırlanması sadece 8 h minimal değişiklikler ile aktif uygulamalı zaman ile hızlı ve kapsamlı bir yöntem sağlar.
Giriş
Sulak koleksiyonları tür ve genomik çeşitlilik filogenetik1,2,3, Populasyon genetiği4,5, koruma çalışmaları için potansiyel olarak değerli bir kaynaktır Biyoloji6, istilacı türlerin Biyoloji7ve özellik evrim8. Zengin bir çeşitlilik türlerin, nüfus, coğrafi yer ve zaman puan elde etmek için yeteneğini sulak olduğunu "hazine sandığı"9 vurgulamaktadır. Tarihsel olarak, bozulmuş doğa sulak elde edilen DNA PCR tabanlı projeler g....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. başlangıç önce
- CTAB, polyvinylpyrrolidone (PVP) 40, 100,0 mL 1 M Tris pH 8.0, 0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 8.0, 280,0 mL 40 mL 5 10 g 20 g ekleyerek taze setil trimethylammonium bromür (CTAB) arabellek17 olun M NaCl ve 400.0 mL reaktif su birlikte, Toplam hacim 1 L reaktif sınıf kullanarak su getir. 8,0 pH ayarlayın.
Not: Ek reaktifler CTAB için bireysel takson olarak ikincil bileşikler bağlı olarak ilave edilebilir. Allen ve ark. görmek 18 katkı Kimyasalları kapsamlı bir listesi için. - β-mercaptoethanol 5 mL CTAB arabellek de başına 10 µL ekleyin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
DNA izolasyonu ve son Kütüphane verim
Bu çalışmada, sulak DNA izolasyonu ve yüksek kaliteli sıralama kitaplıkları kurtarılması için iletişim kuralı etkinliğinin 1920 en eski ve en küçük 2012 (Tablo 2) ile 50 farklı örnekleri kullanarak gösterilmiştir. Her örnek için yaklaşık 10 mg yaprak doku DNA izolasyon için kullanıldı. Yeşil yaprak dokusu varsa tercih ve hiçbir doku bariz mantar kirlenme ile seçilmiştir. Verim düşük olması beklenmelidir rağmen başa.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan Protokolü DNA izolasyon ve Kütüphane hazırlık kurutulmuş bitki örnekleri üzerinden sıralama için kapsamlı ve sağlam bir yöntemdir. Yöntemi ve bunu değiştirmek için çok az ihtiyaç örnek kalite make büyük sulak alan sıralama projeler için ölçeklenebilir temel. Düşük verim kitaplıkları için bir isteğe bağlı reamplification adım dahil düşük kaliteli, düşük miktar, nadir, ya da başka türlü sıralama için uygun olmaz tarihsel açıdan önemli örnekleri dahil sağlar.
İlk DNA verim .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.
Teşekkürler
Taylor AuBuchon-yaşlı, Jordan Teisher ve Kristina Zudock için örnekleme sulak numuneler yardım ve Missouri Botanical Garden erişim sulak numuneler için yıkıcı örnekleme için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı (DEB-1457748) bir hibe destek oldu.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 kuyu |
| Jel Görüntüleme Sistemi | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Serisi | Beckman Coulter | B30137 | |
| Dijital Kuru Banyo | Benchmark Bilimsel | BSH1001 | |
| Elektroforez Sistemi | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Ultra saf su) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA LoBind Tüpü | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini santrifüj | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Harç | Fisher Scientific | S02591 | porselen |
| Havaneli | fisher Scientific | S02595 | porselen |
| Santrifüj tüpleri | fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Mikrodalga | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Test Tüpleri | Invitrogen | Q32856 | |
| 0.2 ml PCR VWR | 20170-004 | ||
| Qubit 2.0 Florometre | Invitrogen | Q32866 | |
| Dengesi | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Sıvı Azot Kısa Süreli Depolama | Nalgene | F9401 | |
| Manyetik Halkalı Stand | ThermoFisher Bilimsel | AM10050 | 96 kuyu |
| Su Banyosu | VWR | 89032-210 | |
| Sıcak Plakalı Karıştırıcılar | VWR | 97042-754 | |
| Sıvı Azot | Hava Gazı | UN1977 | |
| 1 X TE Tampon | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERKAPTOETANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonükleaz A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml çözelti |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Sodyum Klorür | bio WORLD | 705744 | |
| İzopropil Alkol | bio WORLD | 40970004-1 | |
| Nükleaz İçermeyen su | bio WORLD | 42300012-2 | |
| İzoamil Alkol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Sodyum Asetat Trihidrat | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agaroz | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Merdiveni | Altın Biyoteknoloji | D003-500 | |
| EDTA, Disodyum Tuzu | IBI Bilimsel | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Test Kiti | Yaşam Teknolojileri | Q32854 | |
| TRIS | MP Biyomedikal | 103133 | ultra saf |
| Jel Yükleme Boyası Mor (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentaz | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II Illumina için DNA Kitaplığı Hazırlık Kiti | New England BioLabs | E7645L | |
| New England BioLabs | E7600S | Çift İndeksli Primer Seti 1 | NEBNext Multipleks Oligolar |
| NEBNext Q5 Sıcak Başlangıç HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure | Plus Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 X | Pheonix Araştırma | 41003-1 | |
| Fenol çözeltisi | SIGMA Yaşam Bilimleri | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Kloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Etanol | Koptec | V1016 | 200 Korumalı |
| Silika kumu | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplifikasyon primerleri | Entegre DNA Teknolojileri | metne | bakın |
| Sekizer v.5.0.1 | Gen Kodları |
Kaynaklar
- Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
- Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
