Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

Özet

Birden çok araştıran, endojen translasyonel modifikasyonlar hedef protein için son derece zor olabilir. Burada açıklanan teknikleri belirli PTM hedeflemede, benzeşim matrisler bir hedef için asetilasyon, ubiquitination, SUMOylation 2/3 ve tirozin fosforilasyon değişiklikleri algılamak için geliştirilen bir en iyi duruma getirilmiş lizis tampon ve filtre sistemi kullanmak protein tek ve akıcı bir sistem kullanarak.

Özet

Şimdi iyi takdir translasyonel modifikasyonlar (PTMs) protein yapısı ve fonksiyonu, hem fizyolojik ve patolojik olarak verilen protein rol için gerekli olabilir düzenlenmesinde önemli bir rol oynamak. Zenginlik PTMs kez gerekli olduğunu ne zaman bir hedef protein PTM durumunu araştıran, çünkü PTMs çoğu kez geçici ve bolluk içinde nispeten düşük. Birçok tuzaklar bir hedef protein PTM için zenginleştirici zaman karşılaşılan arabellek uyumsuzluk gibi hedef protein antikoru değil IP uyumlu, PTM sinyal kaybı ve diğerleri. Zorluk derecesi asetilasyon, ubiquitination, SUMOylation 2/3 ve tirozin fosforilasyon belirli hedef protein gibi birden çok PTMs soruşturma zaman büyütülmüş olduğunu. Bu PTMs bir arada eğitim-ebilmek var olmak gerekli, crosstalk PTMs arasında yaygın ve protein düzenlemesine yönelik kritik olduğu gibi. Çoğu zaman, bu PTMs farklı lizis arabelleklerindeki ve benzersiz inhibitörü besteleri ile devam etti. Basitleştirmek için benzersiz bir denaturing lizis sistemi bu etkili bir şekilde geliştirilmiştir yalıtır ve bu dört PTMs; korur Böylece, potansiyel crosstalk incelenmesi bir tek lizis sistemde etkinleştirme. Bir benzersiz filtre sistemi arabellekleri denaturing, sorunlu bir yan ürün olan genomik DNA'sı lysate, kirletici kaldırmak için geliştirilmiş. Her dört PTMs bir hedefleme sağlam benzeşme matrisler zenginleştirme ve algılama bu dört PTMs endojen durumlarında en üst düzeye çıkarmak için tampon sistemi ile uyum içinde geliştirilmiştir. Bu kapsamlı PTM algılama araç grubu bir protein bir veya daha fazla bu PTMs tarafından değiştirilir hakkında kritik bilgi alma işlemi basitleştirir.

Giriş

Sayede değişiklik eklendiğinde veya kaldırıldığında belirli bir şekilde bir protein için son derece düzenlenmiş değişiklik translasyonel modifikasyonlar (PTMs) vardır. PTMs çoğu zaman önemli ölçüde değiştirme protein yapısı, en dinamik, geçici değişiklikler ortak proteinler ve kayma Yerelleştirme ve sonuçta farklı işlevler^1,2 gerçekleştirmek protein etkinleştirme ^{, 3 , 4}. PTMs onlar yaklaşık 30.000 gen Urun bir milyondan fazla proteoforms^5,-⁶benzersiz protein formları (veya proteoforms) sayısını artırmak bol. PTMs belirlenmesi ve bir hedef protein üzerindeki etkileri tanımlama protein'ın fizyolojik ve patolojik işlevleri^{7,8,9,10anlama doğru önemlidir, 11,12,13,14}. Tübülin, p53 ve epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) PTMs^15,16,17düzenleyici rol aydınlatılmamıştır gibi select proteinler üzerinde çalışır. Bu çalışmalar, düzenleme, bu proteinler tarafından birden çok PTMs oluşur ve birçok durumda bu değişiklikleri belirli bir işlevi tanıtmak için konserde çalışma Aslında ortaya çıkardı. Yeni çalışmalar bu kooperatif ve negatif PTM crosstalk birkaç farklı proteinler^{18,19,20,21,22,} oluşabilir göstermiştir ^23,24,25. Ancak, protein çoğunluğu PTM profilleri farklı modeller ve benzersiz koşulları-si olmak kullanılmış çeşitli çalışmalardan inşa edilir. Bir sistemde birden çok PTMs araştırmak için en iyi duruma getirilmiş bir sistemine sahip bir hedef protein için potansiyel PTM crosstalk anlayış kazanmak son derece faydalı olacaktır.

PTMs tek bir sistemde soruşturma ile bir özel PTMs ayrı lizis arabellekleri kullanarak incelenmiştir mücadeledir. Örneğin, fosforilasyon veya ubiquitination araştırmalar için yaygın olarak kullanılan arabellekleri RIPA-NP-40 gibi kullanımı küçük Ubikuitin benzeri değiştirici (SUMO) ylation²⁶gibi bir değişken PTM eğitimi için yetersiz olabilir. Ayrıca, Sigara denaturing arabellekleri protein etkileşimleri dissociating için yetersiz ve yanlış pozitif PTM kimlik²⁷için yol açabilir. Proteinler tüm hücresel kompartmanlarda²⁸üzerinden yalıtma önemli ölçüde daha iyi, çoğu protein etkileşimleri ayırmak ve PTM Birleşik, gibi alter proteaz yapılmasını engeller olarak PTMs bir denaturing lizis arabellekte soruşturma tercih edilen, olabilir deSUMOylases ²⁶; Ancak, arabellek denaturing belirli benzeşme reaktifler Ubikuitin etki alanı tabanlı araçları²⁷bağlama gibi bütünlüğünü tehlikeye atabilir. Bir benzeşme reaktif uyumlu sisteme birden çok PTMs bir protein çalışmaya denaturing benzeri lizis sistemi geliştirme PTM crosstalk araştırmalar için son derece faydalı olacaktır.

Denaturing arabellek PTMs soruşturma için arabellekleri sigara denaturing anahtar avantajları olmasına rağmen onlar daha az yaygın olarak geleneksel protein deneyleri, önemli uyumsuzluk gibi onların önemli sakıncaları nedeniyle kullanılan genomik Deoksiribonükleik asit (DNA) kirlenme ve bozulma immunoprecipitation (IP) reaktifler²⁹. Bu sakıncaları genişletilmiş hazırlama süresi ve potansiyel hasar hedef proteinler için genomik DNA kesme zaman neden olabilir. DNA yamultmak için iki yaygın olarak kullanılan yöntem şırınga lizis ve sonication²⁹içerir. Her iki yöntem geniş optimizasyonu gerektirir ve genellikle hassas tekrarlanabilirlik eksikliği. Genomik DNA kaldırmak için alternatif yöntemler DNAses ilavesi içerir; Ancak, bu ek iyileştirme ve arabellek oluşturma değişiklikler gerektirebilir. Sonuçta, ne zaman lizis arabellekleri PTM araştırmalar için denaturing ile çalışma genomik DNA kirlenme kaldırmak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem faydalı olacaktır.

Bu teknik yalıtmak ve daha iyi bir hedef protein için PTM crosstalk araştırmak için tek bir sistem içinde ubiquitination (Ub), tirozin fosforilasyon (pY), SUMOylation 2/3 (SUMO 2/3) ve asetilasyon (Ac) PTMs araştırmak için bir sistem geliştirmek için hedeftir. Bu PTM algılama sistemi hızla tek bir sistemde endojen PTM profil birkaç hedef proteinlerin araştırmak için kullanılmıştır. Yeni potansiyel crosstalk içgörü tanımlanmış^30,31oldu. Genel olarak, burada açıklanan tekniği PTMs ve PTM araştırmak için mevcut yöntemler geliştirir üç farklı şekilde crosstalk: 1) benzersiz bir denaturing arabellek hala ile uyumlu olurken proteinler üzerinden tüm hücresel kompartmanlarda, yalıtan geliştirilmiştir PTM benzeşme reaktifler, 2) benzersiz filtre sistemi hızla genomik DNA kirlenme denatüre lysates ile yüksek tekrarlanabilirlik kaldırır ve hiçbir özel ekipman ve 3 gerektirir geliştirilmiştir) sağlam benzeşme boncuk, lizis sistemi ve inhibitör reaktifler uyumludur; Böylece, PTM zenginleştirme en üst düzeye çıkarmak ve verimli bir şekilde potansiyel crosstalk incelemek için bu dört PTMs bir hedef protein için yalıtım basitleştirme.

Protokol

1. örnek hazırlama: Hücre kültürü

1. Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) % 10 fetal sığır serum ile desteklenmiş A431 hücrelerinin dört 150 mm plakalar büyümek.
   1. A431 hücreleri % 50 confluency için büyümek.
   2. Serum A431 hücre serum-Alerjik DMEM 24 h ile dört tabak kısıtlayın.
   3. 1 h. bırakmak için tedavi edilmezse diğer iki tabak A431 hücreleri iki tabak 33,3 mg/mL epidermal büyüme faktörü ile tedavi.
      Not: Burada gösterilen hücre büyüme ve tedavi koşulları için bir örnek sağlar; Ancak, bu yöntem birçok farklı hücre tipleri ve tedavi koşulları geçerlidir.
2. BlastR lizis ve seyreltme arabellekleri inhibitörleri (Tablo 1) ile hazırlayın. BlastR lizis arabelleği 2.895 mL tirozin fosfataz inhibitörü, deubiquitinase ve deSUMOylase inhibitörü, Histon deacetylase (HDAC) inhibitörü 30 µL ve proteaz inhibitörü kokteyl 30 µL 30 µL 15 µL ile birleştirin.
   1. BlastR seyreltme arabelleği 9.65 mL tirozin fosfataz inhibitörü, deubiquitinase ve deSUMOylase inhibitörü, Histon deacetylase (HDAC) inhibitörü 100 µL ve proteaz inhibitörü kokteyl 100 µL 100 µL 50 µL ile birleştirin.
      Not: Tablo reçetesi arabellek kompozisyon ve inhibitörü bilgiyle bakın.
3. Kültür basına dökün ve hücreleri Buza koyun. Sonra iki kez 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 10 mL içeren hücreleri yıkayın.
   1. Hücre lizis en üst düzeye çıkarmak için blastR lizis tampon eklemeden önce mümkün olduğu kadar PBS kaldırın.
      Not: Tablo reçetesi arabellek oluşturma için bkz.
4. BlastR lizis arabelleği her 150 mm plaka için 600 µL ekleyin. Arabellek miktarı beklenen protein verim (Tablo 2) dayanmaktadır.
   1. Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri parçalayıcı. Lysate nedeniyle nükleer lizis viskoz hale gelecektir.
5. Snipped 1 mL pipet ucu içine yerleştirilen bir 15 mL toplama tüp (şekil 1) bir blastR filtre ham lysate aktarmak için kullanın. Burada, bir 15 mL Şahin tüp kullanılır.
6. Sağlanan filtre pompası tamamen blastR filtre sıkıştırmak ve lysate akış herhangi bir kabarcıklar, dahil olmak üzere bir 15 mL tüp (şekil 1) aracılığıyla, toplamak için kullanın.
7. İsteğe bağlı: Transfer lysate 1.5 mL microcentrifuge tüp ve 4 ° C'de 1 dk santrifüj lysate yaklaşık 10.000 x g de açıklık
   1. Süpernatant yeni bir 15 mL Şahin tüp aktarın.
8. Açıklanan seyreltik blastR seyreltme arabelleğe her 150 mm plaka için 3 mL son hacmi ile lysate. Son hacim beklenen protein verim (Tablo 2) temel alır.
   Not: Bu son arabellek oluşturma IP tepki sıkılık etkileyecek gibi önemli bir adımdır.
9. Protein konsantrasyonu (Bölüm 2) quantitate.

2. protein Nefelometri tahlil

Not: protein Nefelometri belirlemek için bir standart Renkölçer protein Nefelometri tahlil kullanmaktadır. Burada, protein Nefelometri hassas kırmızı gelişmiş protein tahlil kullanılarak belirlenir.

1. 1 mL hassas kırmızı gelişmiş protein tahlil reaktif her iki 1 mL cuvettes ekleyin.
2. Mix 10 µL blastR lizis arabellek ve blastR seyreltme arabelleği bir temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp buz üzerinde 40 µL.
   Not: Bu boş protein örnek okumak için kullanılacaktır.
3. 20 µL lizis/seyreltme arabellek mix (Kimden adım 2.2) ilk küvet için iki ila üç kat ters çevirme tarafından ekleyip karıştırın.
4. 20 µL seyreltilmiş hücre lysate (deneme) eklemek için ikinci küvet, yukarıdaki gibi karıştırma.
5. Örnekleri, oda sıcaklığında 1 dk. için kuluçkaya.
6. Boş Spektrofotometre ile lizis/seyreltme arabellek mix örnek (Kimden adım 2.3).
7. Ölçmek Absorbans (Kimden adım 2.4) lysate örnek 600 nm.
8. Lysate protein konsantrasyonu aşağıdaki gibi belirlemek;
   örnek OD₆₀₀ x 5 okuma protein konsantrasyonu mg/ml =
   Not: OD 0,05 altına veya üstüne 0,5 protein tahlil doğrusal Aralık kapasite yakın okumaları. Okuma için > 0.5, örnekleri seyreltilmiş. Okuma için < 0,05, daha lysate hassas kırmızı gelişmiş protein tahlil reaktif (en fazla 50 µL) eklenebilir. Spektrofotometre okuma mg/mL lysate protein konsantrasyonu için dönüştürmek için Tablo 3 çarpanları için görmek. Bir tabak içinde yetersiz protein Eğer 2 veya daha fazla tabak IP başına kullanmak için tavsiye edilir. Bu durumda, tabak dizi, orijinal 300 µL lizis arabelleği plakalar arasında aktarma hasat edilecek.
9. Protein konsantrasyonu dayanarak, seyreltik bir arabellek karışımı ile örnek (1 yarı blastR lizis: 4 parça blastR seyreltme) istenen son konsantrasyonu (genellikle 1 mg/mL).
10. Ek aliquots hemen kullanılmaz örnekleri dondur.
    1. Örnekleri-70 ° C'de depolayın
    2. Bölüm 3'e geçin.

3. Immunoprecipitation (IP) tahlil

Not: Benzeşme boncuk konsantrasyonları, lysate konsantrasyonları ve kuluçka süreleri anahatları izlemeniz önerilir ve her hedef protein ve belirli PTM soruşturma için benzersiz olabilir.

1. UB benzeşme boncuk, pY benzeşme boncuk, SUMO 2/3 benzeşme boncuk ve Ac benzeşme boncuk boncuk tamamen tüp resuspended emin olmak için birkaç kez içeren stok reaktif tüpler tersine çevirin.
2. Her IP tahlil için aliquot boncuk süspansiyon ayrı 1.5 mL microcentrifuge içine buz (IP tüp) tüpleri. Burada, 20 µL Ubikuitin benzeşme boncuk, phosphotyrosine benzeşme boncuk 30 µL, 40 µL SUMOylation 2/3 benzeşme boncuk veya 50 µL asetilasyon benzeşme boncuk bireysel 1.5 mL microcentrifuge tüpler buz ekleyin.
   Not: Tablo 4 boncuk süspansiyon her benzeşme boncuk için kullanmak için önerilen birim görmek.
3. Ubiquitination IP kontrol boncuk ve IgG denetim boncuk boncuk tamamen tüp resuspended emin olmak için birkaç kez içeren stok reaktif tüpler tersine çevirin.
4. Aliquot denetim boncuk non-spesifik bağlama (Denetim IP tüp) belirlemek için denetim tepki başına. Burada, 20 µL Ub denetim boncuk, pY denetim boncuk 30 µL, 40 µL SUMO 2/3 kontrol boncuk veya Ac denetim boncuk 50 µL bireysel 1.5 mL microcentrifuge tüpler buz ekleyin.
   Not: Tablo 4 boncuk süspansiyon benzeşme boncuk her türü için kullanılacak önerilen birim görmek.
5. (Batı bir leke lysate denetim giriş olarak çalıştırmak için lysate 20 µL) küçük bir miktarda tasarruf. 5 x örnek arabelleği 5 µL ekleyin ve 5 min için 95 ° C'de kaynatın.
   Not: Tablo reçetesi arabellek oluşturma için bkz.
6. Her IP tüp ve denetim IP tüp lysate ekleyin. Burada, lysate 1 mg başına toplam 8 IP reaksiyonlar sonucu IP ve denetim reaksiyon kullanıldı.
   Not: bir başlangıç noktası olarak tahlil başına lysate 1.0 mg önerilir. Lysate gerekli olacak miktarda değiştirilmiş hedef protein bereket bağlı olarak değişir.
7. Tüpler için 2 h 4 ° C'de bitti sıra dönen platformda kuluçkaya. Burada, bir ATR tüp rotator 22 hızda kullanıldı.
8. Santrifüjü 3000-5000 x g 4 ° C'de 1 dk. için de tarafından boncuk toplamak
9. Kadar süpernatant mümkün olduğunca, boncuk bozmadan Aspire edin.
10. 1 mL blastR (inhibitörleri bu aşamada gerekli değildir) yıkama arabellek platformu dönen 4 ° c 5 min için boncuk yıkayın.
11. Santrifüjü 3000-5000 x g 4 ° C'de 1 dk. için de tarafından boncuk toplamak
12. Kadar süpernatant mümkün olduğunca, boncuk bozmadan Aspire edin.
13. (Adım 3.10-3.12) yıkama adımı yineleyin iki kez daha.
14. Son yıkama sonra tamamen arabellek süpernatant kaldırmak. Boncuk Pelet en az düzeyde kesintiye uğraması (%5 kaybı kadar) kabul edilir. Para cezası kullanarak Kaldır artık süpernatant ipucu yükleme protein taşıyordu.
15. Boncuk elüsyon arabelleği 30 µL ekleyin ve hafifçe dokunarak/tüp tarafında flicking tarafından boncuk resuspend. Bir pipet bu aşamada kullanmayın.
    Not: Tablo reçetesi arabellek oluşturma için bkz.
16. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
17. Yavaşça her boncuk süspansiyon bir 1.5 mL microcentrifuge tüp yerleştirildi bir 1.5 mL microcentrifuge spin sütun aktarın.
    Not: Bu kapalı transfer pipet ucu nazik transfer için sonunda makasla kesme için tavsiye edilir.
18. 9.000-10.000 x g IP örnek toplamak için oda sıcaklığında 1 dk. için de santrifüj kapasitesi.
19. 2-mercaptoethanol 2 µL her örnek için ekleyin ve iyice karıştırın.
    Not: Kapak kapatmak spin sütun dişlemek ve işlenmesi için toplama tüp kap için kullanma bu uygundur.
20. Örnekleri 5 dk. toplamak örnek için 95 ° C su banyosunda Santrifüjü RT., 1 dk. için 10.000 x g de yanına koyun
21. Gerekirse, örnekleri-70 ° C'de depolayın ve burada durdurmak veya SDS-sayfa, transfer ve western blot analizi (Bölüm 4) çalıştırmaya devam edin.

4. Western Blot analizi: Protein ilgi tanımlaması

1. Sodyum Lauryl tarafından ayrı örnekleri polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) sülfat ve polivinilidin florid (PVDF) membran için standart laboratuvar protokolleri³²göre transfer.
2. Birincil bir antikor protein ilgi post-translationally değiştirilmiş sürümlerini algılamak için kullanır. Burada, PD-L1 antikor post-translationally değiştirilmiş PD-L1 algılamak için kullanıldı.
3. Vericiyi Kemiluminesan algılama reaktif algılaması için kullanabilir.
   Not: Chemiluminescent reaktif bir HRP etiketli ikincil antikor birincil antikor tespit yetenekli ile birlikte kullanılmalıdır.
4. 2 mL mini gel ölçekli transfer membran (yaklaşık 8 x 7 cm) başına chemiluminescent reaktif hacmi kullanın.
   1. Kuluçka uygun ikincil antikor ile sonra (60dk, RT önerilir), leke 6 x 10 dk ara-20 (TBST) tris arabelleğe alınmış serum 30 mL yıkayın.
      Not: Tablo reçetesi arabellek oluşturma için bkz.
   2. Kullanımdan hemen önce chemiluminescent Reaktif A 1 mL 1 mL chemiluminescent Reaktif B (bir 8 cm x 7 cm membran için yeterli) ile karıştırın.
   3. Chemiluminescent reaktif membran için ekleyin ve nazik RT 1-5 dk önce röntgen film ya da şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera görüntüleme kullanarak protein sinyali görselleştirme için sallanan ile kuluçkaya.
      Not: Kısa kuluçka süreleri chemiluminescent reaktif içinde son derece bol proteinler için gerekli olabilir.

Sonuçlar

Bu 4 PTMs etkili bir şekilde tespit ederek PTM crosstalk araştırmak için bu araçların kısmen benzersiz lizis tampon sistemi üzerinde bağımlı yeteneğidir. BlastR denaturing arabellek benzer şekilde diğer denaturing arabellekleri, protein tüm hücresel kompartmanlarda üzerinden tam protein profil (şekil 2A) sağlayan etkin bir şekilde izole ediyor. Ayrıca, son derece değişken PTM sinyalleri SUMO 2/3, hangi hızla radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) (şekil 2B) gibi sigara denaturing arabelleklerindeki azalır gibi korur. Önemlisi, ne zaman uygun şekilde seyreltilmiş, bu diğer denaturing arabellekleri (Örneğin, Laemmli arabellek) gibi benzeşme reaktifler bütünlüğünü etkilemez.

Denaturing arabellek ile çalışırken önemli bir engel etkili genomik DNA kirlenme kaldırmak için yeteneğidir. Viskozite azaltmak için geleneksel yöntemler kullanarak bir şırınga iğnesi veya örnek sonicating DNA kesme etmektir. Şekil 3A genomik DNA kirlenme A431 hücreye lysate tedaviden sonra BlastR filtre, şırınga iğne veya sonication gösterir. İşte durum böyle değil BlastR filtresini kullanarak genomik DNA'ın neredeyse tamamen kaldırılması bir geleneksel şırınga iğne veya sonication kullanarak. Genomik DNA kirlenme protein geçiş bir SDS-Akrilamid jel ile önemli ölçüde etkiler; Bununla birlikte, BlastR filtre ile tedavi uygun protein geçiş (şekil 3B) kaynaklanan genomik DNA kaldırır. Değiştirilmiş geçiş genomik DNA kirlenme tarafından neden Batı lekesi yorumlanması önemli ölçüde etkileyebilir; Örneğin, filtre uygulanmamış görülen lekeli EGFR desen lysate yanlış filtre uygulanmış örnek (şekil 3 c) göre artan ifadesi olarak yorumlanmalıdır.

Bu en iyi duruma getirilmiş PTM zenginleştirme ve algılama sistemi kullanarak, kimse hızla bir hedef protein bir tarafından değiştirilir ya da daha fazla soruşturma PTMs. PD-L1 PTM profil son zamanlarda bu tekniği kullanarak gerçekleştirilmiş ve sonuçları PD-L1 olduğunu gösterdi belirleyebilirsiniz ubiquitinated, acetylated ve tirozin fosforile yanıt olarak EGF (şekil 4). Önemlisi, bu veriler toplam PD-L1 tespit küçük bir yüzdesini temsil endojen PD-L1 PTM değişiklikleri bildirdi.

Şekil 1: lysate hücreden genomik DNA BlastR filtre ile filtre. (A) BlastR görüntü filtresi. (B) Lysate bir 15 mL toplama tüp yerleştirildi filtre yüklenir. (C) dalgıç şırınga yerleştirilir ve lysate sıkıştırma tarafından filtreden geçirilir. (D) herhangi bir kabarcık tam sıkıştırma yoluyla dahil olmak üzere lysate toplayın. (E) filtre lysate.

Şekil 2: alternatif lizis arabellekleri BlastR lizis arabelleğe karşılaştırılması. Horita ve ark. adapte şekil 2A 2017. Biosci. Rep. ³¹ (A) A431 hücre lysed BlastR, RIPA, mPER, IP lizis, (% 1 SDS), Denaturing ve Laemmli lizis arabellekleri. Tüm denaturing lysates BlastR filtre kullanarak kaldırıldı genomik DNA vardı. Yalıtım membran, sitoplazmik, mitokondri, ve nükleer işaretleri proteinlerin kendi bölme işareti proteinler karşı antikor kullanarak tespit. (B) A431 hücre BlastR, RIPA ve % 1 SDS denaturing arabellek ile lysed. Lysates immunoprecipitated SUMO 2/3 veya kontrol IgG benzeşme boncuk ile vardı. Örnekleri SDS-PAGE tarafından ayrılmış ve bir SUMO 2/3-horseradish peroksidaz (HRP) antikor kullanarak western blot tarafından analiz. Temsilcisi bağımsız deneyler gösterilir N≥3 engelliyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: BlastR lizis filtredir genomik DNA etkin. (A) A431 hücreleri ile denaturing lizis tampon lysed. Genomik DNA kaldırılır veya BlastR filtre, şırınga iğne veya sonication için 5, 10, 20 veya 30 saniye ile sheared. lysate % 2 etidyum bromür, özel Jel Elektroforez tarafından analiz edildi. (B) Lysate A431 hücrelerden lysed ile denaturing bir tampon ya filtresiz veya filtre BlastR filtre ile. Örnekleri SDS-sayfa ile ayrıldık ve Coomassie leke kullanarak görüntülenir. (C) yinelenen örnekleri b SDS-sayfa, PVDF için transfer ayrılmış ve EGFR protein bir EGFR antikor kullanılarak incelenmiştir. N ≥3 bağımsız deneyler üzerinden temsilcisi lekesi gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: PD-L1 translasyonel modifikasyonlar EGF kaynaklı olarak algılanmasını. Horita ve ark. adapte şekil 2017. neoplazi³⁰(A). Serum sınırlı A431 hücreleri ya da unstimulated (UT) ya da bir saat önce BlastR lizis arabelleği ile lizis EGF ile uyarılmış. WCL PD-L1 düzeyleri (şerit 1,2) analiz edildi. Ubikuitin bağlama boncuk (UBA01) IP ubiquitinated proteinler (şerit 3,4) kullanılmıştır. Phosphotyrosine bağlama boncuk (APY03) IP tirozin fosforile proteinlerin (şerit 5,6) kullanılmıştır. SUMO 2/3 bağlama boncuk (ASM24) IP SUMOylated 2/3 proteinler (şerit 7,8) kullanılmıştır. Asetil lizin bağlaması boncuk (AAC01) acetylated IP proteinler (şerit 9,10) kullanılmıştır. Bağlama denetimi boncuk IgG IP non-spesifik proteinler için (şerit 11,12) kullanılmıştır. Örnekleri SDS-PAGE tarafından ayrılmış ve PD-L1 antikor kullanarak western blot tarafından analiz. Temsil edici bir leke N ≥3 bağımsız deneyler üzerinden gösterilir. Beyaz Yıldız PD-L1 pY ve Ac protein bantlar vurgulamak için kullanılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

BlastR lizis arabellek için hesaplamaları
	1.0 mL	2.0 mL	5.0 mL	10.0 mL
BlastR lizis arabellek	965 ΜL	1930 ΜL	4.825 mL	9.650 mL
Tirozin fosfataz inhibitörü	5 ΜL	10 ΜL	25 ΜL	50 ΜL
de-ubiquitinase/de-sumoylase inhibitörü	10 ΜL	20 ΜL	50 ΜL	100 ΜL
HDAC inhibitörü	10 ΜL	20 ΜL	50 ΜL	100 ΜL
Proteaz inhibitörü kokteyl	10 ΜL	20 ΜL	50 ΜL	100 ΜL
BlastR seyreltme arabellek için hesaplamaları
	4.0 mL	8.0 mL	20.0 mL	40.0 mL
BlastR lizis arabellek	3,86 mL	7,72 mL	19.3 mL	38,6 mL
Tirozin fosfataz inhibitörü	20 ΜL	40 ΜL	100 ΜL	200 ΜL
de-ubiquitinase/de-sumoylase inhibitörü	40 ΜL	80 ΜL	200 ΜL	400 ΜL
HDAC inhibitörü	40 ΜL	80 ΜL	200 ΜL	400 ΜL
Proteaz inhibitörü kokteyl	40 ΜL	80 ΜL	200 ΜL	400 ΜL

Tablo 1: Lizis ve seyreltme tampon hazırlama grafik. Hazırlarken bir verilen lizis ve seyreltme arabellek birim hücre lizis için arabelleği için eklemek için inhibitörleri konsantrasyonları sağlayan grafik.

Plaka Protein içeriği	Önerilen BlastR lizis arabellek birim	Önerilen BlastR seyreltme arabellek birim
< 1 mg	Birden çok tabak protein birleştirmek	1.5 mL son hacim yapmak
1-2 mg	300 ΜL	1.5 mL son hacim yapmak
2-4 mg	600 ΜL	3 mL son hacim yapmak
4-6 mg	900 ΜL	4.5 mL son hacim yapmak

Tablo 2: BlastR lizis/seyreltme arabellek grafik. Grafik sağlayan lizis ve seyreltme arabellek birimleri lysate edinirken önerilir.

Hücre lysate hacmi 1 ml hassas kırmızı Protein tahlil reaktif (µL) eklendi	OD600 okuma örnek ile kullanmak için çarpanı
10	10
20	5
30	3.3
40	2.5
50	2

Tablo 3: Mg/mL Spektrofotometre okuma dönüştürmek çarpanları Lysate. Grafik dönüştürme numaraları protein konsantrasyonu hesaplama ile Yardımcısı sağlamak.

benzeşme boncuk	boncuk Bulamaç/IP (mL) hacmi
Ubiquitination	20
Phosphotyrosine	30
SUMOylation 2/3	40
Asetilasyon	50
Denetim boncuk	boncuk Bulamaç/IP (mL) hacmi
Ubiquitination denetim boncuk	20
Phosphotyrsoine denetim boncuk	30
SUMOylation 2/3 kontrol boncuk	40
Asetilasyon denetim boncuk	50

Tablo 4: Boncuk/IP grafik hacmi önerilir. Grafik sağlayan IP tepki kullanmak için benzeşme boncuk miktarda önerilir.

Tartışma

Bir hedef protein PTM tarafından değiştirilip belirlemek için kullanılan ilk yaklaşımlar PTM antikor ile Batı leke ve ardından IP için hedef protein spesifik antikor kullanılarak yapılabilir (örn., Anti-asetil lizin), veya IP için PTM antikor kullanarak Hedef protein spesifik antikor^30,31,33ile Batı leke izledi. Her iki yaklaşımın teorik olarak çalışırken, bir hedef protein özel antikor kullanan daha fazla potansiyel tuzaklar, antikor IP uyumlu olmayabilir veya büyük PTM değişiklikler hedef protein^{34 antikor tanıma ücreti engelleyebilir gibi vardır ,35}. PTM benzeşme boncuk avantajı antikor veya bağlayıcı etki alanında özellikle ilgi PTM tanımak olduğunu; Böylece, hedef protein değişiklikler tanıma benzeşme boncuk tarafından değiştirmek gerekir değil. Örnek olarak, PD-L1 Ub burada açıklanan tekniği ile tespit edildi ve her iki endojen mono - ve poli-Ub görülmektedir (şekil 4). Son bir yayın tarafından Lim ve ark. vitro Ub teknikleri PD-L1 Ub araştırmak için kullanılmaktadır ve sonucu şekil 4³⁶sonuçlar çok benzer. İlginçtir ki, onlar da IP PD nerede Ub overexpressed ve MG-132 sinyal artırmak için eklendi L1 lysate, hücreden zenginleştirmek için PD-L1 antikor ile seslendirdi. Ub desen değil sağlam ve vitro Ub desen çok farklıdır. Hücre kültür modellerinde endojen PD-L1 Ub incelenmesi Lim ve arkgerçekleştirilmedi. onların hücre kültür ve vitro veri arasındaki farkı açıklamak için raporu.

Bir protein PTM tarafından değiştirilip soruşturma, düşük bereket ve geçici doğa^37,38, nedeniyle zor olabilir ve genellikle IP üzerinden zenginleştirme gerektirir. PTMs etkili IP birkaç önemli adımlar ve Kimyasalları, lizis arabellekleri ve benzeşme Kimyasalları gibi duruma getirilmesi gerekir. Birden çok PTMs bir hedef protein araştıran, gerekli optimizasyonu olasılığı artar. Sağlam IP yeteneği, tek bir sistemde PTM algılama pY, SUMO 2/3, Ub ve Ac PTMs etkinleştirilirken tutar gibi blastR lizis sistemi kullanan bir kritik bu protokolü adımdır. Bu teknik zaman ve belirli hedef protein bu dört PTMs tarafından değiştirilir ve potansiyel olarak PTM çapraz karışma birden fazla lizis sistemi kullanılarak gerçekleştirilen PTM sonuçları karşılaştırarak göre daha iyi bir görüntü sağlar eğer belirlemek için gerekli kaynakları en iyi duruma getirir. Glikozilasyon gibi alternatif PTMs uyumlu blastR lizis sisteminin incelenmesi gerçekleştirildi; Ancak, bunu etraflıca PTMs tüm türleri için inceledi değil.

Bol genomik DNA kullanarak protein ölçümleri ile müdahale Renkölçer veya nanodrop yöntemleri, SDS Akrilamid jel proteinlerin geçiş etkiler ve protein ve benzeşme matris etkileşim IP deneyleri sırasında önlemek. Burada açıklanan yöntemi etkili başka bir kritik adım bu protokol genomik DNA kirlenme kaldırmak için özel bir filtre kullanır. Bu noktada vurgulamak için viskozite testleri blastR filtre işlemden önce ve sonra gerçekleştirilen ve yüksek viskozite su (veri gösterilmez) azalma viskozite için sonuçlar gösterdi. Bu değişikliği viskozite, neredeyse tüm genomik DNA çıkarmıştı gösterilen şekil 3, sonuçlarında tarafından desteklenmiştir. Yamultulmuş DNA (veri gösterilmez) filtre tarafından yakalanan değil gibi önemlisi, DNA bu yöntemle güdülmesini değil. Çünkü hiçbir özel ekipman gerektirir, son derece tekrarlanabilir ve bu kesme yerine DNA kaldırır Bu sonication veya şırınga-DNA-kesme, gibi geleneksel yöntemler daha üstün bir araçtır. Ayrıca, geleneksel yöntemlerle²⁹kullanarak ortaya çıkan protein lysate, aşağılamak değil. Filtre kullanan nerede etkili DNA dağılımı (Yani, Yamultma şırınga) birkaç dakika sürebilir ve DNA kirletici lysate içinde kalması gibi örnek heterojenite neden olabilir alternatif yöntemlere göre örnek başına 5-30 saniye sürer. Lysate öncesi ve sonrası blastR filtreleme geniş analizi gerçekleştirilmiş ve protein profil gözlemlenebilir hiçbir fark Coomassie, hedef özel Batı, veya toplam ve hedef özel PTM analizleri gözlenmiştir; Böylece, protein profil bütünlüğünü genomik DNA süzerek etkilenmiş olabileceğini değil. Sonuçta, bu filtre sistemi herhangi bir Batı veya nerede genomik DNA var ve protein analizi yorumu etkileyebilir IP uygulama için faydalıdır.

Yanlış negatif algılama kısmen benzeşme boncuk doygunluk, bağlama sitesi girişim veya PTM maskeleme için bağlı olabilir bu tekniği kullanmak için potansiyel olduğunu unutmamak gerekir. Örneğin, belirli hedef protein Ac çok düşük seviyelerde değiştirilebilir; Böylece, bu daha bol Ac-modified hedef proteinler tarafından doymuş pan-asetil lizin benzeşme boncuk tarafından izole değil. Devam eden çalışmalar bu protokol için kullanılan benzeşme reaktifler algılama sınırları değerlendirmek için gerçekleştirilir, ancak son yayınına bir çok sağlam algılama sınırı önerir. Verileri bu teknik teşhis edebilir 17 acetylated hedef protein molekülleri hücre³¹ücret olarak az gösterdi. Yine de, hücre gibi belirli koşullar özgüllük, belirli uyaranlara yanıt geçici PTMs yazın veya PTMs maskeleme protein etkileşim nedeniyle yanlış negatif sonuçlar tüm sonucu olabilir. Bu potansiyel tuzaklar bu tekniği yanı sıra çoğu PTM IP yöntemleri vardır. Böylece, birden fazla yaklaşımları kullanarak sonuçları onaylamak için tavsiye edilir.

Glikozilasyon ve fosforilasyon gibi değişiklikler benzer amino asitler^39,40ve protein düzenleyen sırayla çalışmak gösterilmiştir ubiquitination ve fosforilasyon gibi diğer PTMs için rekabet gösterilmiştir ^17,41işlev. Neuropathological protein Tau son iş PTM crosstalk, nereye gelişmiş Tau hiper-fosforilasyon ve Tau SUMOylation birbirimizi⁴²önemi vurgulanır. Ayrıca, bu grup Tau SUMOylation Poli-Ub ve sonraki Tau bozulması, muhtemelen toplama için önde gelen engelledi olduğunu gösterdi. Bu da pek çok örnek düzenleyici PTM crosstalk biridir ve belgili tanımlık yarar bu tekniğin PTMs ve sağlık ve hastalığında anahtar protein düzenlenmesinde onların crosstalk önemini aydınlatmak için yardımcı olacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
<>Hücre lizisi/genomik DNA çıkarılması ve analizi
1x fosfat tamponlu salin (PBS)	ortak tampon		Tarifi: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4
BlastR lizis tamponu	Cytoskeleton Inc.	BLST01	Deterjanlar, tuzlar ve diğer tampon katkı maddelerinin tescilli karışımı
Radyoimmünopresipitasyon tahlil tamponu (RIPA)	ortak tampon		Tarif: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodyum Deoksikolat, Igepal
Memeli protein ekstraksiyon reaktifi (mPER)	Thermofisher	78503	Deterjanlar, tuzlar ve diğer tampon katkı maddelerinin tescilli karışımı
İmmünopresipitasyon (IP) Lizis	Pierce	87787	Deterjanlar, tuzlar ve diğer tampon katkı maddelerinin tescilli karışımı
%1 sodyum dodesil sülfat (SDS) denatüre edici tampon	ortak tampon		Tarif: PBS, SDS, EDTA, EGTA
Laemmli	ortak tampon		Tarif: Tris-HCl, SDS, gliserol, bromofenol mavisi
BlastR seyreltme tamponu	Cytoskeleton Inc.	BDB01	Deterjanlar, tuzlar ve diğer tampon katkı maddelerinin tescilli karışımı
Proteaz İnhibitörü Kokteyl Hücre	İskeleti A.Ş.	PIC02
N-Etilmaleimid (NEM) & N, N, N ve asal ;, N ve asal ;-Tetrakis (2-piridilmetil) etilendiamin (TPEN)	Hücre İskeleti A.Ş.
Trichostatin A (TSA) & Nikotinamid	Hücre İskeleti A.Ş.	TSA01
Aktif Sodyum Ortovanadat (Na3< / sub>VO 4)< / sub>	Cytoskeleton Inc.	PYI01
hücre sıyırıcılar	Costar	3008
BlastR Filtre	Hücre İskeleti A.Ş.	BLR02
BD İnsülin şırınga iğnesi	BD	08290-3284-11
sonikatör (Branson Sonifier)	Branson	Sonifier 450
Hassas Kırmızı Gelişmiş Protein Reaktifi	Hücre İskeleti, Inc.	ADV02
1 mL küvetler	Fisher	14955127
Spektrofotometre (Genesys20)	Thermofisher	4001	Protein konsantrasyonunu ölçmek için diğer spektrofotomerler kullanılabilir
Agarose	Fisher	BP1356-500
1kb Deoksiribonükleik asit (DNA) merdiveni	NEB	N3232L
DNA jel kutusu	Thermofisher	7312 B1A
Tris/Borat/EDTA (TBE) tampon	ortak tampon		Tarifi: Tris-HCl, Borik Asit, EDTA
güçlü>PTM İmmünopresipitasyon
Fosfotirozin boncuk	Hücre İskeleti A.Ş.	APY03-boncuk
Ubikitinasyon boncuk	Hücre İskeleti A.Ş.	UBA01-boncuk
SUMOylation 2/3 boncuk	Hücre İskeleti A.Ş.	ASM24-boncuk
Asetilasyon boncuk	Hücre İskeleti A.Ş.	AAC04-boncuk
Fosfotirozin kontrol boncukları	Hücre İskeleti A.Ş.	CIG01-boncuk
Ubikitinasyon kontrol boncukları	Hücre İskeleti A.Ş.	CUB02-boncuk
SUMOylation 2/3 kontrol boncukları	Cytoskeleton Inc.	CIG01-boncuk
Asetilasyon kontrol boncukları	Hücre İskeleti A.Ş.	CIG02-boncuk
BlastR yıkama tamponu	Hücre İskeleti A.Ş.	BWB02	Deterjanlar, tuzlar ve diğer tampon katkı maddelerinin tescilli karışımı
Boncuk elüsyon tamponu	Cytoskeleton Inc.	BEB01	Deterjanlar, tuzlar ve diğer tampon katkı maddelerinin tescilli karışımı
mikrosantrifüj	Eppendorf	5417	Diğer mikrosantrifüjler kullanılabilir
tüp döndürücü	ATR	RKVSD	Diğer uçtan uca tüp döndürücüler kullanılabilir
protein yükleme ipuçları	VWR	37001-150
spin sütunları	Hücre İskeleti A.Ş.	SPN22
ısı bloğu 95 &�; C	Benchmark	BSH1002
SDS-PAGE/Transfer/Batı analizi
5x numune tamponu	ortak tampon		tarifi: Bromofenol mavisi, ditiyotreitol (DTT), Gliserol, SDS, Tris-HCl
novex kama kuyusu %4-20 Tris-gly jeller	Invitrogen	XP04200BOX	kama kuyuları, büyük hacimleri
1x Çalışan tampon	ortak tampon		tarifi: Tris-HCl, Glisin, SDS
seeblue protein merdiveni	Yaşam Teknolojileri	LC5625
elektroforez hücresi	Invitrogen	Xcell surelock elektroforez hücresi	Diğer elektroforez hücreleri kullanılabilir, ancak bunlar novex wedgewell jelleri ile uyumludur;
güç kaynağı	Biorad	PowerPac HC	Diğer güç kaynakları kullanılabilir
1x Transfer tamponu	ortak tampon		tarifi: Tris-HCl, glisin, metanol
Transfer hücresi	Biorad	mini trans-blot hücresi	Diğer transfer hücreleri kullanılabilir
Immobilon-P membranları (PVDF)	millipore	IPVH 304F0
yağsız süt
	tampon		tarifi: Tris-HCl, NaCl, Tween 20
Kemilüminesan Tespit Reaktifi	Hücre İskeleti A.Ş.	CLRA/CLRB
Hücre büyümesi ve tedavisi
Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamı	ATCC	30-2002
Fetal sığır serumu	ATLAS	F-0500-A
Epidermal büyüme faktörü	Hücre İskeleti A.Ş.	CN02-A
150 mm hücre kültürü plakaları	Corning	430599