Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Ashutosh Pandey; Hamed Jafar-Nejad

doi:10.3791/56919

Yöntem makalesi

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

DOI:

10.3791/56919

⸱

2 Ocak 2018

Ashutosh Pandey¹ , Hamed Jafar-Nejad¹^,²

¹Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, ²Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vivo sistemlerinin karmaşıklığı trans- ve BDTtarafından harekete geçirmek ve çentik reseptör inhibisyonu birbirinden ayırmak zor yapar-ligandlar, anılan sıraya göre. Burada, vitro hücre toplama deneyleri için nitel ve yarı kantitatif değerlendirmesi Drosophila çentik transiçin bağlama dayalı bir iletişim kuralı mevcut-ligandlar vs CIS-ligandlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çentik sinyal geniş hayvan geliştirme ve yetişkin bakım ve kullanılan bir evrimsel korunmuş hücre-hücre iletişim sistemidir. Çentik reseptör hücreleri komşu gelen ligandlar ile etkileşimi sinyal aktivasyonu neden olmaktadır (trans-harekete geçirmek), sinyal ligandlar aynı hücreden ile etkileşim inhibe ederken (CIS-inhibisyon). Transarasındaki uygun dengeyi-harekete geçirmek ve BDT-inhibisyon yardımcı olur çentik bazı bağlamlarda hayvan geliştirme sırasında sinyal en uygun belirlemektedir. Üst üste gelen ifade etki alanları çentik ve birçok hücre tipleri içinde onun ligandlar ve geri bildirim mekanizmaları varlığı nedeniyle verilen translasyonel modifikasyon trans- CISkarşı üzerinde etkileri eğitimi-çentik etkileşimleri ve onun ligandlar vivo içinde zordur. Burada, Drosophila S2 hücrelerde hücre toplama deneyleri çentik bağlama trans ve CISher ligand için üzerinde bir çentik yol değiştirici aşağı vurma etkilerini değerlendirmek amacıyla kullanmak için bir iletişim kuralı açıklar. Stabil veya geçici bir çentik ifade vektör ile transfected S2 hücreleri her çentik ligand (S2-Delta veya S2 Serrate) ifade hücreleri ile karıştırılır. Trans-reseptör ligandlar arasındaki bağı heterotypic hücre toplamları oluşumuna neden olur ve oluşan mL başına toplamları sayısı açısından ölçülür > 6 hücreler. CISinhibitör etkisini incelemek için-ligandlar, çentik ve her ligand ortak ifade S2 hücreleri S2-Delta veya S2 Serrate hücreleri ile karıştırılır ve toplamları sayısı yukarıda açıklandığı gibi sayılabilir. CISvarlığı nedeniyle toplamları sayısı göreli düşüş-ligandlar CISölçüsü sağlar-ligand- transinhibisyonu aracılı-bağlama. Bu basit deneyleri genetik veya farmakolojik işlemler bağlama üzerinde çentik için onun ligandlar etkileri üzerinde yarı Nicel veri sağlayabilir ve in vivo etkileri altında yatan moleküler mekanizmaları deşifre yardımcı olabilir Çentik sinyal üzerinde böyle manipülasyonlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kurallı sinyal çentik çentik reseptörleri ve onların ligandlar¹arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak için hücreler komşu fiziksel temas gerektiren bir kısa menzilli hücre-hücre iletişim mekanizmasıdır. Çentik reseptör (sinyal alma hücrelerinin yüzeyinde mevcut) etkileşim ligandlar (sinyal gönderme yüzeyinde mevcut hücreleri) çentik sinyal başlatır ve transbilinen-harekete geçirmek². Öte yandan, çentik ve onun ligandlar aynı hücrede arasındaki etkileşimi çentik yolu inhibisyonu yol açar ve CISbilinmektedir-inhibisyon³. Trans- ve BDTarasındaki denge-etkileşimleri optimum ligand-bağımlı çentik⁴sinyal sağlamak için gereklidir. Drosophila vardır bir çentik reseptörü ve iki ligandlar (Delta ve Serrate) dört çentik reseptörleri ve beş ligandlar var memeliler aksine [1 (JAG1), JAG2, pürüzlü delta benzeri 1 (DLL1), DLL3 ve DLL4]⁵. Bu basitlik sahip, Drosophila model çentik-ligand etkileşimleri ve daha sonra üzerinde çentik sinyal yolu değiştirici etkilerini incelemek/çalışma için kolaylığı sağlar. (Kanat geliştirme Drosophiladahil olmak üzere), hayvan gelişimi sırasında belirli bağlamlarda CIS- ve trans-etkileşimleri çentik uygun sinyal elde etmek ve kader¹^,^{6 hücre için söz konusu}. BDT- transkarşı çentik yolu değiştiriciler Bu içeriklerde etkilerini ayırt etmek önemlidir-çentik etkileşimleri ile onun ligandlar.

Bizim grup daha önce ksiloz Drosophila çentik için olumsuz olarak adlandırılan bir karbonhidrat kalıntı ilavesi çentik kanat geliştirme⁷de dahil olmak üzere belirli bağlamlarda sinyal düzenleyen bildirdi. Şems kaybı (enzim o xylosylates çentik) için bir "kayıp kanat damarın" fenotip⁷açar. Daha yakın zamanlarda, gen dozaj deneyler ve klonal analiz shams kaybı Delta-aracılı çentik singling geliştirir göstermek için kullanılmıştır. Gelişmiş çentik shams mutantlar sinyal azalmış CISbir sonucu olup ayırt etmek için-inhibisyon veya artmış trans-harekete geçirmek, içinde larva kanat Imaginal diskler ligandlar çentik Ektopik overexpression çalışmaları dpp-GAL4 sürücüyü kullanarak uygulandı. Bu deneyler Shams transdüzenleyen kanıt düşündüren sağlanan-harekete geçirmek-in Delta tarafından çentik çentik CISetkilemeden-inhibisyon ligandlar⁸tarafından. Ancak, düzenlemeler geri besleme ve endojen ligandlar etkileri Ektopik overexpression çalışmalar¹^,⁶^,⁹yorumu karmaşık.

Drosophila S2 hücreleri¹⁰ kullanıldı, bu sorunu gidermek için hangi çentik-ligand etkileşim çalışmaları¹¹^,¹²için basit vitro sistem sağlamak. S2 hücreleri değil endojen çentik reseptör ve Delta ligand¹¹ hızlı ve çentik-ligand toplama deneyler⁸etkilemez Serrate¹³, düşük düzeyde ifade eder. Bu nedenle, S2 hücreleri stabil veya geçici çentik ve/veya bireysel ligandlar (Delta veya Serrate) sadece çentik reseptör veya onun ligandlar biri hızlı hücre oluşturmak için veya bunların bir kombinasyon tarafından transfected. Çentik ifade S2 hücrelerinin ligand ifade S2 hücreleri sonuçlarında heterotypic toplamları Reseptör-ligand bağlayıcı¹¹^,¹²^,¹⁴tarafından aracılı oluşumu ile karıştırma. Miktar toplam oluşumu sağlar bir ölçüsü trans-çentik ve onun ligandlar¹⁵ (şekil 1) bağlama. Benzer şekilde, S2 hücreler çentik ve Delta veya Serrate ligandlar ile ortak transfected olabilir (Yani CIS-ligandlar). BDT-bu çentik ifade S2 hücrelerde ligandlar iptal etmek çentik bağlama ile trans-ligandlar ve sonucu azalmıştır toplama oluşumu⁸^,¹²^,¹⁴. Toplama oluşumu CIStarafından neden göreli düşüş-ligandlar CISinhibitör etkisini ölçüsü sağlar-ligandlar üzerinde çentik ve transarasında bağ-ligandlar (Şekil 2). Buna göre hücre toplama deneyleri xylosylation kaybı trans- ve BDTüzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır-çentik ve onun ligandlar arasındaki etkileşimler.

Burada, çentik bağlama ile transdeğerlendirmek için hücre toplama deneyleri amaçlayan için detaylı bir iletişim kuralı mevcut-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar Drosophila S2 hücreleri kullanarak. Örnek olarak, biz bize çentik ve transarasında bağ çentik xylosylation etkisini belirlemek izin verilen veri sağlar-Delta⁸. Bu basit deneyleri çentik-ligand etkileşimleri vitro yarı nicel bir değerlendirme sağlar ve çentik yolu değiştiriciler vivo içinde etkileri altında yatan moleküler mekanizmalar belirlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Şems nakavt için çift telli RNA (dsRNA) hazırlanması

PCR güçlendirme ürünleri
1. Vahşi tipi sarı beyaz (y w) genomik DNA ve pAc5.1-EGFP dsRNA sentezinde kullanılan DNA parçalarının yükseltmek için şablon ve aşağıdaki astar çiftleri kullanın. Aşağıdaki PCR termal profili kullan: denatürasyon (95 ° C, 30 s), tavlama (58 ° C, 30 s) ve uzantı (72 ° C, 1 dk.).
  Yeşil flüoresan Protein gelişmiş (EGFP) dsRNA astar (5' - 3')-
  İleri astar-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
  Astar GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG ters
  Şems dsRNA astar (5' - 3')-
  İleri astar-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
  Astar TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA ters
  Not: EGFP dsRNA negatif kontrol kullanılır.
Jel-arındırmak Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürünleri üreticisinin protokolüne göre ticari jel arıtma seti kullanarak.
Vitro transkripsiyon ticari bir ürün üreticisinin protokolüne göre T7 organizatörü dan transkripsiyonu yetenekli kullanarak gerçekleştirin.
Bir RNA arıtma seti üreticisinin protokolüne göre kullanarak dsRNA arındırmak ve-80 ° C'de depolayın
Şems nakavt verimliliğini (1.5.1-1.5.5) aşağıdaki adımları kullanarak değerlendirmek.
1. Fetal sığır Serum (FBS) ve 100 U/mL penisilin-streptomisin plaka 1 mL/Schneider'ın ortamının iyi hemasitometre ve plaka 5 x 10⁵ S2 hücreleri de 6 her kuyuya kullanarak el ile hücrelerin % 10 ile desteklenmiş sayısı.
2. Her şey için EGFP- veya Şems dsRNA 7.5 µg ekleyin ve 25 ° c 24 h için kuluçkaya.
3. Hasat (EGFP dsRNA tedavi) denetim ve Şems dsRNA tedavi S2 hücreleri nazik Santrifüjü 1000 x g için 25 ° c 5 min ve bir RNA ekstraksiyon kiti göre kullanarak RNA izolasyonu için işlem tarafından aşağı peletleme tarafından takip pipetting tarafından üreticinin iletişim kuralı.
4. Spektrofotometre ve işlemi 100 kullanarak RNA ölçmek için 1-adım qRT-PCR ticari qPCR reaktifler ve astar/sonda ve aşağıdaki PCR termal profili kullanarak RNA'ın ng: denatürasyon (95 ° C, 15 s) ve TAV/uzantısı (60 ° C, 1 dk).
  Not: Lütfen astar/sonda setleri ve bu çalışmalarda shams , denetim qRT-PCR deneyleri için kullanılan alet Malzemeler tablo bilgi için bakınız.
5. 2^-^ΔΔCT yöntemi¹⁶kullanarak göreli shams mRNA düzeyleri hesaplayın.

2. değerlendirme arasındaki çentik reseptörü ve Trans-ligandlar

Sinyal alma hücreleri (çentik reseptör ifade S2) hazırlayın.
1. El ile bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve plaka 5 x 10⁵ S2 ve her şey bir 6-şey plaka 1 ml/Schneider'ın ortamının de istikrarlı S2-çentik hücrelerde FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin % 10 ile desteklenmiştir.
  Not: Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC) üzerinden kullanılabilir olan S2-çentik hücreler için 200 nM metotreksat medya ekleyin. 0,5 mM metotreksat hisse senedi çözüm hazırlamak için ilk 20 mM metotreksat çözümde 250 µL 1 M NaOH hazırlamak. Ardından, bu çözüm için 1 M fosfat tampon serum ve store-20 ° C'de 0,5 mM sulandırmak S2-çentik hücrelerde, çentik protein Drosophila metallothionein organizatörü DEVRESEL_ÖDEME vektör kontrolü altında ifadesidir.
2. Her şey için dsRNA 7.5 µg ekleyin ve 25 ° c 24 h için kuluçkaya.
3. 0.7 mM çentik ifade teşvik ve 25 ° C de 3 gün kuluçkaya CuSO₄ ekleyin.
  Not: CuSO₄ metallothionein düzenleyici tarafından kontrollü proteinlerin ifade ikna etmek için kullanılır.
Sinyal gönderme hücreleri (Delta veya Serrate ligandlar ifade S2 hücre) hazırlayın.
1. El ile bir hemasitometre ve plaka ~ 5 x 10⁶ istikrarlı S2-Delta veya S2 Serrate^Tom hücrelerde her şey 1 ml 6-şey plaka kullanarak hücreleri saymak/FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin iyi Schneider'ın orta % 10 ile desteklenmiştir.
  Not: S2-Delta hücreler için 200 nM metotreksat ve 100 µg/mL hygromycin S2 Serrate^Tom hücreler için medya ekleyin. Delta ve Serrate^Tomifadesi — Serrate¹²domates öğesini, işlevsel sürümü — Drosophila metallothionein organizatörü DEVRESEL_ÖDEME vektör altındadır.
2. 0.7 mM ligandlar ifade teşvik ve 25 ° c 3 h için kuluçkaya CuSO₄ ekleyin.
Sinyal gönderme ve sinyal alma hücreler arasında toplama gerçekleştirmek.
1. DsRNA tedavi edilen S2 hasat (kontrol) ve S2-çentik hücreleri tarafından yumuşak pipetting ve hemasitometre tarafından elle sayım sonra hücreler/iyi bir 24-şey plaka plaka 2.5 x 10⁵ .
2. 5 x 10⁵ istikrarlı S2-Delta veya S2 Serrate^Tom hücre Schneider'ın orta 200 µL toplam bir birim içinde eklemek (% 10 ile desteklenmiş FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin).
  Not: tüm S2 hücreleri (kaplama, indüksiyon ve dsRNA tedavisi de dahil olmak üzere) işleme altında bir biyogüvenlik kabini yapıldı.
3. Plaka bir orbital Çalkalayıcı 150 RPM (942.48 rad/dak) yerleştirin.
4. 1 dk sonra her şey içeriğini karıştırmak ve toplamları sayılması için 20 µL çıkar.
  1. Aynı anda ters bileşik 10 x büyütme (PLL 10/0,25 amaç) kullanma mikroskop altında temsilcisi bir görüntü çekmek.
  2. El ile agrega saymak (> 6 hücreler) bir hemasitometre kullanarak.
5. Bir shaker tabakta bir yer.
6. Resim alma ve 5 dk sonra ve 15 dak toplama sayma yineleyin.
Transmiktar gerçekleştirmek-bağlama.
1. S2 hücreleri ve S2-Delta veya S2 Serrate^Tom hücreler arasındaki mL başına toplamları sayısını bir arka plan denetimi olarak hesaplayın.
2. S2-çentik ve S2-Delta veya S2 Serrate^Tom hücreler arasındaki mL başına toplamları sayısını hesaplamak ( transbüyüklüğü-bağlama).

3.Çentik ve Transarasında bağ inhibisyonu değerlendirilmesi- CIStarafından ligandlar-ligandlar

Sinyal alma hücreleri hazırlayın.
1. Her şey bir 6-şey plaka 1 ml/de Schneider'ın orta plaka 5 x 10⁵ S2 hücrelerde % 10 ile FBS ve 100 U/mL penisilin-streptomisin desteklenmiştir.
2. Her şey için dsRNA 7.5 µg ekleyin ve 25 ° c 24 h için kuluçkaya.
3. DsRNA tedavi edilen hücreleri pBluescript ve Devresel ödeme-çentikile¹¹ (DGRC) tek başına veya DEVRESEL_ÖDEME-çentik ve Devresel ödeme-Delta¹¹ ile birlikte transfect (DGRC) veya DEVRESEL_ÖDEME Serrate¹⁷ toplam DNA toplama µg/iyi bir ticari transfection reaktif üreticisinin protokolüne göre kullanarak 2.
  Not: pBluescript bir denetim olarak kullanılır. Co transfected hücreleri S2-çentik adı verilecek & Delta^geçici veya S2-çentik & Serrate^geçici hücreleri bundan sonra.
4. 25 ° c 24 h için geçici transfected S2 hücreleri kuluçkaya.
5. 0.7 mM çentik ve ligandlar ifade teşvik ve 25 ° C de 3 gün kuluçkaya CuSO₄ ekleyin.
Hücreleri sinyal gönderme 2.2 içinde açıklandığı şekilde hazırlayın.
Sinyal gönderme ve sinyal alma hücreler arasında toplama 2.3 bölümünde açıklandığı gibi gerçekleştirmek.
Transinhibisyonu ölçmek- CIStarafından bağlama-ligandlar.
1. S2 hücreleri ve S2-Delta veya S2 Serrate hücreler arasındaki mL başına toplamları sayısını bir arka plan denetimi olarak hesaplayın.
2. CIStarafından inhibisyon büyüklüğü ölçmek-ligandlar gibidir.
  1. A toplamları S2-çentik^geçici ve S2-Delta hücreler arasındaki sayısını tanımlamak için kullanılır.
  2. Toplamları S2 hücreler arasında sayıda geçici çentik ve Delta ile birlikte transfected gibi B tanımlayın (S2-çentik & Delta^geçici) ve S2-Delta hücreleri.
  3. Göreli toplama C hesaplamak = (B x 100) /A
  4. BDT- ligand (Delta veya Serrate) 100-tarafından inhibisyon büyüklüğünü hesaplamak C.
    Not: göreli toplama ise % 45, o zaman CISbir örnek olarak-ligandlar transetkisizleştirmek için kabul edilir-55 oranında bağlama.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vivo gözlemlerimiz xylosyltransferase gen shams sonuçlarında çentik nedeniyle sinyal kazanç kaybı Delta-aracılı transartış önerdi- CISetkilemeden çentik aktivasyonu-inhibisyonu Çentik ligandlar⁸tarafından. Bu kavramı sınamak için vitro hücre toplama deneyleri gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, S2 hücre deyimde Şems Şems dsRNA kullanarak yere düştü. EGFP

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kurallı sinyal çentik çentik reseptör ve onun ligandlar⁵arasındaki etkileşimler bağlıdır. Çentik yolu en çalışmaları, öncelikle çentik ve ligandlar komşu hücrelere (trans) bağlama dikkate rağmen çentik ve aynı hücre ligandlar etkileşim ve bu sözde CIS-etkileşimleri çentik bir inhibitör rol oynayabilir ³^,⁴sinyal. Buna göre kurallı çentik sinyal üzerinde bir değiştirici etkileri altında yatan mekanizmaları deşifre etmek içi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar NIH/NIGMS destek kabul (HJN R01GM084135) ve Glycoscience (hibe #110071 HJN) ve are minnettar Tom V. Lee için tartışma ve öneriler deneyleri, Mizutani Vakfı ve Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine ve Plazmidler ve hücre hatları için Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BioWhittaker Schneider' s Drosophila medium, Modifiye	Lonza	04-351Q
HyClone Penisilin-Streptomisin 100X çözümü	GE Sağlık yaşam bilimleri
CELLSTAR 6 kuyulu plaka	Greiner Bio-One	657 160
CELLSTAR 24 kuyulu plaka	Greiner Bio-One	662160
VWR mini çalkalayıcı	Marshell Sceintific	12520-956
Hemositometre	Fisher Sceintific	267110
FuGENE HD Transfeksiyon Reaktifi	Promega	E2311
MEGAscrip T7 Transkripsiyon Kiti	Ambion	AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA saflaştırma Kiti)	Zymo Research	R1054
VistaVision Ters mikroskop	VWR
9MP USB2.0 Mikroskop Dijital Kamera + Gelişmiş Yazılım	AmScope	MU-900	ToupView yazılımı kullanılarak görüntü alma
PureLink Hızlı Jel Ekstraksiyon Kiti	Invitrogen	K210012
Fetal Sığır Serumu	GenDepot	F0600-050
Metotreksat	Sigma-Aldrich	A6770-10
Higromisin B	İnvitrojen	HY068-L6
Bakır sülfat	Macron İnce Kimyasallar	4448-02
S2 hücreleri	Invitrogen	R69007
S2-Tırtıklı^Tomcells			R. Fleming'den Hediye (Fleming ve diğerleri, Geliştirme, 2013)
S2-Delta hücreleri	DGRC	152
S2-Çentik hücreleri	DGRC	154
pMT-Delta vektör	DGRC	1021	S. Artavanis-Tsakonas'tan Hediye
pMT-Serrate vektör			Hediyesi (Okajima ve diğerleri, JBC, 2003)
pMT-Notch vektör	DGRC	1022	S. Artavanis-Tsakonas'tan Hediye
pAc5.1-EGFP			Hugo Bellen'den Hediye
TaqMan RNA'dan Ct'ye 1-Step Kiti
	Uygulamalı Biyosistem	Dm02144576_g1	FAM-MGB boyası ile
CG7939 için TaqMan Gen Ekspresyon Testi (RpL32)	FAM-MGB boyası ile	Uygulanan Biyosistem	Dm02151827_g1
Uygulamalı Biyosistemler 7900HT Hızlı Gerçek Zamanlı PCR sistemi	Uygulamalı Biyosistem		4351405 96 kuyulu Blok modülü

SV30010Ken Irvine'den CG9996 (Shams) için TaqMan Gen Ekspresyon Testi 1611091 Uygulanan Biyosistem

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547(2013).
Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723(2017).
Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Notch Sinyal Yolu H cre Agregasyon Analizi Trans Aktivasyon Cis nhibisyon Drosophila S2 H creleri Hemositometre Say m Orbital alkalay c nverted Bile ik Mikroskop ift Zincirli RNA Bak r S lfat nd ksiyonu

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler