Kardiyak hücre dışı Matriks (ECM) anahtar süreçlerinde doku ve organların fizyolojik hayatı boyunca remodeling kalıcı süre alacak moleküllerinin karmaşık bir ağdır. Fetal ve yetişkin kalplerin standart decellularization 3D bir bağlamda yerel mimari ve biyomekanik özellikleri yakalayarak karşılaştırmalı deneysel çalışmalar hem dokuların izin verir.
Geçerli hücre dışı Matriks (ECM) bilgisine-hücre iletişim çevirir büyük iki boyutlu (2D) tüp bebek kültür çalışmaları nerede ECM bileşenleri bir yüzey kaplama olarak sunulmaktadır. Bu kültür sistemleri biyokimyasal bileşimi, yapısı ve mekanik özellikleri kapsar ECM dokusunun karmaşık yapısı basitleştirilmesi oluşturmaktadır. Bütün fetal kalp decellularization için sağlayan bir protokol geliştirdiğimiz kardiyak microenvironment şekillendirme ECM-hücre iletişim daha iyi taklit etmek için ve yetişkin sol ventrikül doku aynı anda için karşılaştırmalı çalışmalar explants. Protokol Hipotonik bir arabellek, bir deterjan Anyonik yüzey aktif özellikleri ve Dnaz tedavi herhangi bir gereksinim olmadan kullanmak özel beceri ya da ekipman için birleştirir. Doku örnekleri arasında aynı decellularization stratejisi uygulamadan konularda çeşitli yaş karşılaştırmalı çalışmalar gerçekleştirmek için alternatif bir yaklaşımdır. Mevcut iletişim kuralı benzersiz yapısal farklılıkları tanımlaması fetal ve yetişkin kalp ECM mesh ve biyolojik hücresel yanıt izin verir. Ayrıca, burada daha geniş bir uygulama başarıyla diğer dokulara ve küçük ayarlamalar, bu türe gibi insan bağırsak biyopsisi ve fare akciğer uygulanan metodoloji gösterir.
Hücre dışı Matriks (ECM) önemli hücresel süreçler, yani kader-karar, yayılmasını önleme ve farklılaşma1,2düzenleyen molekülleri dinamik bir ağdır. Hücre-ECM etkileşimlerin incelenmesi esas olarak iki boyutlu (2D) in vitro kültürlerde ECM bileşenleri ile kaplı, hangi vivo içindebulunan yerel ECM özellikleri basitleştirilmesi teşkil yapıldı. Decellularization büyük ölçüde hücre dışı mimarisi ve kompozisyon yerel doku ve organları3,4korumak acellular 3D benzeri ECM bioscaffolds oluşturur. Doku Mühendisliği için biyoaktif iskele olarak görev ek olarak, decellularized 3D ECM Biyomalzeme roman platformlar hücre-ECM Biyoloji değerlendirmek için o paralel içinde vivo ortamda ortaya çıkıyor.
ECM bileşenleri farklı dokular, organlar ve yaş fark rolünün değerlendirilmesi ile yerel bioscaffolds üretme benzer iletişim kurallarının kullanımını yararlanacaktır. Kalbinden, decellularization örnekleri, fetal ve yetişkin türetilmiş için çok yönlü bir iletişim kuralı organ microenvironment, karşılaştırmalı çalışmalar gerçekleştirmek için alternatif bir yaklaşım geliştirdik. Bu yöntemi kullanarak, biz yerel kardiyak microenvironment yakalanan ve fetal ECM kalp hücreleri5yüksek repopulation verimi teşvik gösterdi. Decellularization daha fazla lif kompozisyon5arasında fetal ve yetişkin ECM Bodrum lamina ve pericellular matris kafes düzenlemenin düzeyinde ikamet yapısal farklılıklar tanımlaması sağlanmıştır. Önce bu çalışmaları, aynı decellularization yaklaşımı kullanarak farklı ontogenic aşamalarında dokuların kafa kafaya karşılaştırma yalnızca al yanaklı maymun böbrekler ve kemirgen kalpler için bildirilmiştir. Buna ek olarak, sınırlı sayıda çalışmalar fetal doku/organ decellularization başına5,6,7rapor. Bu SDS benzersiz decellularization Aracısı olarak kullanarak elde edilmiştir; Ancak, farklı SDS konsantrasyonları fetal ve yetişkin kalp dokusu7,8decellularization için kullanıldı. SDS en etkili iyonik deterjanlar için izni sitoplazmik ve nükleer malzeme biridir ve yaygın olarak kullanılan farklı doku ve numuneler9,10decellularization içinde. Yüksek SDS konsantrasyonları ve uzun süreli maruz kalma içeren çözümler proteini denatürasyon, glikozaminoglikan (gag) kaybı ve kollajen liflerinde10,11, bozulma ile ilişkili ve bu nedenle bir ECM korunması ve hücre kaldırma arasında denge gereklidir. Fetal ve yetişkin kalp dokusu ile aynı yordamı uygulamak için burada açıklanan protokol üç sıralı adımları ayrılmıştır: hücre lizis ozmotik şok (Hipotonik arabellek); solubilization lipid-protein, DNA-protein ve protein-protein etkileşimlerinin (% 0,2 SDS); ve nükleer malzeme kaldırma (Dnaz tedavisi).
Bizim iletişim kuralı birkaç avantajları gösterir: Ben) aynı decellularization strateji; uygulama tarafından yaş özgü kardiyak dokuların eşdeğer decellularization olasılığı II) özel yöntemler veya ekipman gereksinim yoktur; III) diğer doku ve tür olarak bu hazır adaptasyon ile insan bağırsak biyopsisi12 ve fare akciğer13‘ te küçük değişiklikler başarıyla uygulandı; ve önemlisi, IV) ECM biyomekanik özellikleri 3D benzeri organotypic kültürleri daha yakından yerel doku microenvironment moleküler özelliklerini taklit Meclisi etkinleştirilirken adresleyebilir.
Hücre dışı Matriks (ECM) çok sayıda biyoaktif peptidler ve sıkışmışlık büyüme faktörleri bir rezervuar oluşan lifli ve yapışkanlı glikoproteinlerin, son derece dinamik ve karmaşık bir meshwork var. Büyük modülatör hücre adezyon, sitoiskeleti dynamics, hareketliliği/geçiş, nükleer silahların yayılmasına karşı farklılaşma ve Apoptozis ECM aktif olarak hücresel fonksiyon ve davranış düzenlemektedir. Hücresel davranış 2D ve 3D kültürlerde farklı olduğunu bilmek, doğru bir şek…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar tüm üyelerine Pinto–Ó laboratuvar ilgili kritik tartışma için borçlu bulunmaktadır. Bu eser Programa MIT-Fundação para Ciência e teknoloji (FCT) “CARDIOSTEM-mühendislik kalp doku ve kök hücre tabanlı terapiler kardiyovasküler uygulamalar için” projesi kapsamında tarafından desteklenmiştir (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. FCT dostluk [SFRH/BD/88780/2012] bir alıcı ve M.J.O. bir FCT adam (FCT-araştırmacı 2012).
Equipment | |||
Incubated Benchtop Shaker | Orbital Shakers | IKA:3510001 | Recommended |
Fluorimeter | – | – | Equipment available |
Digital weight scale | – | – | Equipment available |
Inverted Microscope | – | – | Equipment available |
Cell culture incubator | – | – | Equipment available |
Fridge (4ºC) | – | – | Equipment available |
Deep freezer (-80ºC) | – | – | Equipment available |
Microtome | – | – | Equipment available |
Cirurgical Instruments | |||
Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 5000-08 | Recommended |
Dumont 5 Fine Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | Recommended |
Dumont 7 forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | Recommended |
Dissecting Scissors, straight | – | – | Tool available |
Forceps, serrated, curved | – | – | Tool available |
Materials | |||
24 well plates, individually wrapped | VWR | 29442-044 | – |
96 well plates, individually wrapped | VWR | 71000-078 | – |
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized | Millipore | SE1M179M6 | – |
Eppendorff | – | – | Material available |
15 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430791 | – |
50 mL Falcon tubes | Fisher Scientific | 430829 | – |
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid | Electron Microscopy Science | 70075-B | – |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 22-037-246 | – |
Tissue cryopreservation | |||
Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | – |
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) | Sigma-Aldrich | 277258-1L | – |
Dry ice | – | – | – |
Decellularization | |||
NaCl | BDH Prolabo | 27810.364 | – |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S-31264 | – |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-100g | – |
KCl | Sigma-Aldrich | P8041-1KG | – |
TrisBASE | Sigma-Aldrich | T6066-500G | – |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L-4390 | – |
MgCl2 | MERCK | 1.05833.1000 | – |
DNAse I | AplliChem | A3778,0050 | – |
Gentamicin | Gibco | 15710-049 | – |
Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
Deionized water (DI water) | – | – | – |
Histology | |||
10 % formalin neutral buffer | Prolabo | 361387P | – |
Eosin Y AQUEOUS | Surgipath | 01592E | Can be replaced by alcoholic eosin |
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | – |
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous | Aga | 4,006,02,02,00 | – |
Deionized water (DI water) | – | – | – |
Clear Rite 3 | Richard-Allan Scientific | 6915 | – |
Shandon Histoplast | Thermo Fisher Scientific | RAS.6774006 | – |
Kits | |||
PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | – |
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit | Invitrogen | P11496 | – |
Cell culture | |||
DPBS | VWR | 45000-434 | – |
Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Labclinics | L0022-100 | – |
Fungizone | Gibco BRL | 15290-026 | – |
Cell culture media of the cell of interest | – | – | – |