Yöntem makalesi

Evreleme pupa dönemi ve ölçüm kanat pigmentasyon Drosophila guttifera yöntemleri

11.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56935

⸱

24 Ocak 2018

 ,  ,  , 
1Graduate School of Science, Kyoto University, 2Graduate School of Science, Osaka City University, 3The Hakubi Center for Advanced Research, Kyoto University, 4Graduate School of Environmental Science, Hokkaido University

Bu makalede

Özet

Pupa dönemi ve kanat pigmentasyon Drosophila guttifera ölçümü evreleme için protokol açıklanmıştır. Evreleme ve pigmentasyon miktar yetişkin özellikleri ile gelişimsel mekanizmaları eğitim için sağlam bir temel sağlamak ve özellik geliştirme interspecific karşılaştırma etkinleştirin.

Özet

Drosophila (meyve sineği) çeşitli türlerin gelişim ve genetik değişiklikler için evrimsel değişiklikler sorumlu mekanizmaları incelemek için fırsatlar sağlar. Özellikle, Yetişkin sahne Morfolojik özellikleri kanat pigmentasyon karşılaştırma da dahil olmak üzere interspecific karşılaştırma için zengin bir kaynağıdır. Türler arasında gelişimsel farklılıkları eğitim için detaylı gözlem ve uygun evreleme kesin karşılaştırma için gereklidir. Burada evreleme pupa dönemi ve bir polka noktalı meyve sineği Drosophila guttiferakanat pigmentasyon miktar için iletişim kuralları açıklar. İlk olarak, ayrıntılı morfolojik gözlem ve pupa aşamaları türleri üzerinde Morfoloji temel tanımını için yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem pupa türleri Morfoloji detaylı gözlem etkinleştirmek için pupa, dış chitinous durumda puparium kaldırmak için bir yöntem içerir. İkinci olarak, tanımlanmış pupa aşamaları süresi ölçme yöntemi açıklanmaktadır. Son olarak, dijital görüntü ve ImageJ yazılım kullanarak görüntü analizi dayalı kanat pigmentasyon miktar için yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntemler ile yetişkin özellikleri ile gelişimsel süreçleri pupa evrelerinde karşılaştırmak için sağlam bir temel oluşturabilir.

Giriş

Drosophila morfolojik özelliklerin bazıları tür1,2,3,4,5arasında çeşitlendirilmiş. Soru yaklaşım olabilir bu türleri Morfoloji nesil mekanizmaları karşılaştırarak nasıl morfolojik çeşitlilik ortaya çıkar. Böyle türleri Morfoloji larva trichomes, yetişkin sex taraklar, dış genital aparatı, karın pigmentasyon ve kanat pigmentasyon6,7,8,9, örnekler 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. yetişkinler arasında morfolojik farklılıklar çalışmaya, gözlem ve analiz pupa etap yetişkin özellikleri kaderi geç larva aşamalı olarak belirlenir ve sonraki morfogenez pupa döneminde gelirleri için önemlidir.

Drosophila melanogaster, gelişim biyolojisi çalışmalarında "saat APF" (pupa kuruluşundan sonra saat) bir pupa sahne16belirtmek için yaygın bir yöntemdir. Bu sistem ve pupa kuruluşundan sonra mutlak zaman istihdam rutin deneyler için çok uygundur. Ancak, gelişimsel hız pupa arasında farklı olabilir ve küçük genetik, epigenetik veya microenvironmental farkları tarafından etkilenebilir ve bu nedenle aynı sahip mutlak zaman pupa kuruluşundan sonra pupa aynı anda olduğunu garanti etmez gelişimsel sahne. Birçok durumda, Morfolojik özellikleri tarafından tanımlanan aşamaları birden çok kişiye karşılaştırmak için tercih edilir. Özellikle, türler arasında bir karşılaştırma kesin evreleme ve karşılık gelen (homolog) aşamaları arasında karşılaştırma gerektirir.

Bainbridge ve Bownes17 tanınan 20 pupa etap (P1 P15(ii)) için Drosophila melanogaster pupa morfolojik özelliklerini temel alarak. Bu evreleme morfolojik gelişim hazırlama18en çok kullanılan sistemdir. Bir önceki çalışmada, Pupa Drosophila guttifera kanat pigmentasyon çalışmalar19için bir temel oluşturmak üzere evreleme yapılır. D. guttifera kanat üzerinde siyah puanlı desene sahip ve kanat pigmentasyon oluşumu20modeli türlerinden biridir. Her ne kadar biz açıklanan morfolojik ölçütlere anılacaktır Bainbridge ve Bownes'17araştırma, doğrudan seri gözlemler19sahne süreleri Bainbridge ve Bownes tahmini kullanmak yerine tarafından sahne süreleri ölçülen gözlenen frekansı. Burada pupa hazırlama yöntemi ve Fukutomi ve ark19' kullanılan Drosophila pupa aşaması süreleri ölçümü açıklayın.

Kanat pigmentasyon gelişimsel mekanizması çalışmaya, Pupa veya yetişkin aşamasında pigmentasyon ortaya çıktığında bilmemiz gereken. Fukutomi ve ark. 19 kanat görüntüleri görüntü analizi tarafından pigmentasyon pupa ve yetişkin aşamaları sırasında optik yoğunlukları (ODs) sayılabilir. Drosophila kanatları pigmentasyon siyah melanin21birikimi tarafından neden olduğu düşünülmektedir. ODs miktar için gri tonlama görüntüler ve ImageJ yazılım (https://imagej.nih.gov/ij/)22 kullanılmıştır. Tanımak ve nokta özel pigmentasyon (ΔOD) ölçmek için biz bir noktadan OD içinde bir nokta dışında OD çıkarın. Tekrarlanabilir ve objektif bu yöntemi kullanabilmek için aşırı doz ölçüm yerlerin kanat damarlar yerler kullanarak tespit edilmelidir. Bu makalede, biz bu yöntemi miktar Drosophila guttiferakanat pigmentasyon, ayrıntılı olarak tarif.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. stok fly

  1. Drosophila guttifera tüm aşağıdaki iletişim kuralları için kullanın.
  2. Plastik şişeleri kullanın (çapı 25 mm yükseklik x 96 mm) ve selüloz prizler (çapı 23 mm yükseklik x 26 mm) hisse senedi bakım için. Bu tür2diğer üç alternatif tariflerini takip bir yayın açıklanan ve standart bir Mısır unu/şeker/Maya/agar gıda kullanın.
    Not: D. guttifera (stok numarası 15130-1971.10) Drosophila tür stok merkezi San Diego Kaliforniya Üniversitesi tarafından sağlanır. Her ne kadar immigransiçin - uzaktan D. melanogaster için içinde cins23ilgilidir,tripunctata radyasyon D. guttifera ait ö melanogaster ile ortak birçok biyolojik özelliği vardır . Buna göre gerektirse de bazı türler özel gıda ve/veya teknik ipuçları2onları korumak için bu protokolü Drosophila türlerin için uygulanabilir.

2. pupa ve pupa aşamaları tanımını gözlem

Not: Pupa gözlem için bir 12:12 s açık/koyu döngüsü 25 ° C'de tutulan sinek hisse senedi alınır Bainbridge ve Bownes17 pupation üzerine ıslatılmış doku kağıt (946 taşınan pupa sağkalım % 97) orijinal yerine D. melanogaster pupa Taşınılan düşük riski nitelendirdi. D. guttifera pupa temelde aynı yöntemle hazırlanabilir.

  1. Drosophila sağlıklı yetişkin taze gıda (Standart Mısır unu/şeker/Maya/agar Gıda) bir plastik şişe yerleştirin (çapı 25 mm yükseklik x 96 mm) ve onları yumurtlamak. 7 gün geç 3rd instars elde etmek için bekleyin.
  2. 1 mL standart Mısır unu/şeker/Maya/agar gıda her 1.5 mL microtube yerleştirin. 2 mm aralığı ile 3 iğne delikleri mikrotüpler kapaklar, bir itme-nefes izin vermek için iğne ile Penetran olun.
  3. Mikrotüpler gıda için 7 ile santrifüj kapasitesi mini microcentrifuge (860 x g) s.
  4. Ters çevir ve şişeleri tüm yetişkin şişe kaldırmak için dokunun.
  5. GKD2O 5-10 mL dökün (veya ters ozmoz su) şişe içine.
  6. Larvaları ile plastik bir Petri kabına suya dökmek (çapı 90 mm yükseklik x 15 mm). Büyük beden büyüklükleri (3-4 mm uzunluğunda) tarafından geç 3rd instars tanımlayın.
  7. Yavaşça geç 3rd INSTAR larva Forseps ile gıda ile mikrotüpler taşıyın (10 larva / microtube). Onları gecede 25 ° C'de kuluçkaya
  8. Yeni kurulan pupa GKD2tarafından O nemlendirilmiş ve bir plastik Petri kabına yerleştirilir doku kağıt parçası üzerine hareket (çapı 35 mm x Yükseklik 10 mm).
  9. Nemli bir odası (GKD2O içinde belgili tanımlık dip 10 mL içeren) Petri kabına yerleştirin ve pupa istenen Sahne Alanı'na geliştirmek kadar bekleyin.
  10. Pupa ıslatılmış bir doku kağıt parçası üzerine bir plastik Petri kabına hareket (çapı 60 mm yükseklik x 15 mm).
    Not: Aşamaları tanımını çoğunlukla D. melanogaster17Etaplar temel alınarak yapılabilir. Genellikle, her ne kadar bazı değişiklikler sahne tanımının kullanılan türler bağlı olarak gerekli olacaktır Drosophila pupa dönemi P1 - P15(ii), sınıflandırılabilir. Mümkünse, puparium kaldırma kesin ve ayrıntılı gözlem sağlar. (Adım 3) aşağıda ayrıntıları bakın.
  11. Stereo mikroskop altında pupa gözlemlemek. Stereo mikroskop bağlı bir dijital kamera ile fotoğraf çekmek.

3. puparium kaldırma

Not: Pupa Drosophila puparium denilen bir yapı tarafından karşılanmaktadır. Muscomorpha (uçar) bir böcek, larva kütikül pupation, döken değil; Bunun yerine, manikür apolysis sonra sertleşir ve pupa puparium24bir koruyucu kapak kullanır. Bir puparium içinde ikamet eden bir pupa çok yumuşak ve kırılgan bir doğru pupa kütikül vardır. Apolysis P4(ii) etrafında gerçekleşmesidir önce epiteli ve puparium birlikte eklenir ve bu nedenle zarar vermeden puparium kaldırma çok zordur. P5 sonra puparium zahmetli ama morfolojik gözlem ve pupa aşamaları tanımını için yararlı olabilir. İşlem aşağıdaki gibi yapılır.

  1. Bir parça kağıt havlu üzerinde çift taraflı bant parçası yapıştırmayın.
  2. Bir pupa (şekil 1A) çift taraflı bant ventral tarafa yerleştirin.
  3. Puparium ön tarafında ve iç pupa arasında boşluk bulun. Kavramak ve forseps kullanarak bu boşluğu çevresinde puparium kaldırmak ve pupa başkanı ön tarafında karşı karşıya.
  4. Ön-arka eksenine paralel hareket ettirerek bir pens ucu yerleştirin. Yerel olarak puparium kırmaya pens ucunu kaldır. Kırılma puparium posterior parçası ulaşıncaya kadar bu eylemi yineleyin. Bir boşluk da puparium ve pupa bacaklar arasında oluşturulur emin olmak ve puparium ventral tarafında break ve iç pupa (şekil 1B) zarar en aza indirmek.
  5. Puparium mümkün olduğunca kırdıktan sonra ince fırça (#5/0) (şekil 1 c) kullanarak pupa al.
  6. Pupa GKD2ile O nemlendirilmiş ve bir plastik Petri kabına yerleştirilen doku kağıt yerleştirin (çapı 60 mm yükseklik x 15 mm). Çünkü maruz pupa savunmasız ve kolayca kuru olur en kısa zamanda fotoğraflarını.
    Not: Pupa bir puparium olmadan çünkü pupa dönemi (Adım 4), sürelerini ölçmek için uygun değildir (kuruma gibi) stres ve fiziksel hasar ile normal gelişim engel.

4. pupa aşamaları sürelerini ölçmek

  1. Pupa 2. adımda açıklandığı gibi pupa aşamaları sürelerini ölçmek için hazırlayın. 1-2, 2-3, ve 3-4 gün sonra pupa oluşumu (20 her pupa) pupa toplamak. Bireysel kimlik numaraları (1-60) pupa için için kimlik vermek. Yeni toplama pupa 20 daha fazla genç pupa elde etmek için aşağıdaki adımları sırasında oluşan devam edin. Bireysel kimlik numaraları (61-80) yeni kurulan pupa ver. Bir pupa GKD2O nemlendirilmiş doku kağıt 12-şey hücre kültür plaka (1 pupa/iyi, 12 pupa/plaka) iyi (3,9 cm2) yerleştirin. Nem korumak, kapakları giy ve 25 ° C, sürekli ışık (24:0 h ışık/karanlık) koşulları Plakayı yerleştirmek için GKD2O ile plakaların arası iyi boşluğu doldurmak.
    Not: Pupa bir puparium olmadan pupa dönemi sürelerini ölçmek için uygun değildir. Lütfen puparium kaldırmaz.
  2. Morfolojik özellikleri bir kez her 30 dakika ve kayıt (P1 - P15(ii), başvurular17,19tarihinde dayalı) aşamaları taksitli sayfa gözlenen gövde rengi, kıllar, Malpighi tübüllerin ve tüm pupa sarı gövdesi gibi gözlemlemek.
  3. Dört düz günü (96 h) üç (veya daha fazla) kişi dönen bir kayma tarafından kayıt devam etmek.
  4. Belirli her sahne alanı'nın kayıt sayıları saymak ve onları ortalama (ortalama gözlem sayısı / pupa). O zaman onları aşamaları (h) tahmini uzunluklarda kaynaklanan 0.5 (s) tarafından çarpın.

5. siyah noktalar bir kanat yoğunluğu ölçümü

Not: Siyah noktalar bir pupa veya yetişkin kanat yoğunluğunu optik yoğunluk (OD) ölçerek sayısal. Bir cam filtre bilinen ODs (basamaklı yoğunluk filtresi) ile bir kanat dijital bir görüntüsünü belirli bir alandan OD hesaplayabilirsiniz kalibrasyon25için kullanılır. Bir noktada OD ve spot dışında OD ölçülür ve ikinci nokta (ΔOD) yoğunluğu elde etmek için eski çıkarılır. Burada, diseksiyon, ölçüm ve ΔOD hesaplanması yöntemi açıklanmaktadır. Bu yordamı, adım 2, adım 3 ve adım 4 bağımsız sonra yapılabilir. Bir kez bir adım 2 sahne aldı ve tüm pupa aşamaları anlar, bir doğrudan başlatabilir veya adım 5 tekrarlayın.

  1. Görüntü hazırlama
    1. Odak bir sahne alanı'nın yeni bir pupa 2. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. Bir puparium ön kısmı Forseps ile kaldırın. Forseps kullanarak pupa alın ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS, Tablo 2) bir plastik Petri kabına yerleştirin (çapı 35 mm x Yükseklik 10 mm).
    2. Bir kanat Bazal eklem kesmek (Bazal eklem ise kanat dar proksimal parçası). Kanat katlanmış gibi o plastik bir Petri kabına yer (çapı 35 mm x Yükseklik 10 mm) ozmotik basınç (kanat izlerken kendiliğinden) tarafından genişletmek için GKD2O ile dolu.
    3. Yeni eclosed yetişkin bir kez her 10 min hisse senedi bir şişe toplamak. Bir sinek bir CO2 anesthetizing defterini kullanma CO2 ile anestezi, hareketsizlik tarafından anesthetization onaylamak ve bir kanat Bazal eklem kesti.
    4. PBS yer 10 µL bir cam slayt üzerinde yer kanat var ve bir kapak notu (18 x 18 mm) ile kapağı.
    5. Stereo mikroskop ışıkları. Işık maksimum düzeyde olması için ayarlayın. 11,5 X objektif lens ayarlayın. En açık devlet olmak için diyafram ayarlayın. Kamerayı açın. Set kamera olmak (ISO: 100, modu SHQ 3136 x 2352 piksel, Obtüratör Hız: 1/20 s). Örnek üzerinde mikroskop odak düğme hareket ettirerek odaklan.
    6. Uzaktan kumanda birimi bir görüntü çekmek için Obtüratör butonuna bas. Kanat, her biri bir campaniform sensillum, sol kanatta distal parçası ve kanat üst tarafındaki ön parçası konumlandırma boyuna ven spot veya posterior crossvein merkezli gerekir başına 3 resim al.
  2. Kalibrasyon
    1. Kanat görüntü elde etmek için kullanılan aynı kamera ayarlarını kullanarak bir basamaklı yoğunluk filtresi 9 bölümlerinin görüntü alabilir.
    2. ImageJ yazılım (https://imagej.nih.gov/ij/)22başlatın.
    3. Dosyasını tıklatın | Açık | ve basamaklı yoğunluk filtresi resimlerden birini seçin.
    4. Resmi tıklayın | Türü | 8-bit | Resim 8-bit görüntüyü dönüştürmek için.
    5. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Belirtmek | ve Oval ve merkezli sütununu kontrol edin. Sütun genişliği (piksel) 100, 100 (piksel) Yükseklik sütundaki, 1568 sütun X koordine ve 1176 Y Koordinat sütununda yazın. Tamam' ı tıklatın.
    6. Tıklayın analiz | Ölçü |. Seçili alanları "demek gri değeri" ölçülür.
    7. 5.2.3 yineleyin. 5.2.6 için. görüntüler kalan 8 için.
    8. Tıklayın analiz | Kalibre ve Rodbard25 işlev sütun seçin ve orta sağ sütunda aşağıdaki numarasını yazmak (0,04, 0,336, 0.632, 0,928, 1,224, 1.52, 1.816, 2,112, 2.408; bu numaraları bağlıdır yoğunlukları «««çıktı) yoğunluk filtresi.
    9. Küresel kalibrasyon sütununu kontrol edin ve Tamam' ı tıklatın.
      Not: Bu yordamı gerçekleştirerek, "gri değeri demek" "Rodbard işlevini kullanarak optik yoğunluğu (OD)" dönüştürülür. Bu adımdan sonra optik yoğunluk için ImageJ yazılım belirli bir seçili alanında hesaplanır.
  3. Ölçümlerin alanı seçme
    Not: Campaniform sensilla, boyuna ven ipuçları ve crossveins gibi simge yapılara ile genellikle ilişkili noktalardır. Bunlar ve diğer yerler bir kanat ölçüleri bölge seçmek için kullanılabilir. Burada, bir örnek olarakD. guttifera(Resim 2) açıklanmıştır.
    1. A noktası, campaniform sensillum nokta tanımı.
      1. Bir campaniform sensillum nokta görüntünün merkezinde olduğu bir resim açın. Resmi tıklayın | Türü | 8-bit | Resim 8-bit görüntüyü dönüştürmek için.
      2. Alan seçim araçları Dikdörtgen ' i tıklatın ve bir dikdörtgen çizin. Bu bir campaniform sensillum nokta üçüncü boyuna ven arka hattına bağlı ve daha distal dikdörtgenin üst sol köşe olarak. Böylece campaniform sensillum spot sağında yer alan dikdörtgenin sağ tarafında ayarlayın.
      3. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Yöneticisine Ekle |. Tümünü göster sütununu kontrol edin.
      4. Satır seçim araçları açı aracını tıklatın. İlk satır üçüncü boyuna ven arka çizgi üzerinde çizin. 1. adımda çizilen dikdörtgen izdüşümü satırının sol bitiş noktaları ayarlayın. İkinci satır dikdörtgenin üst tarafında çizin. Bu adımda çizilmiş iki satır arasındaki açı ölçmek için "m" tuşuna basın. Bilgisayarın ekrandaki görüntü penceresini tıklatın.
      5. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Yöneticisine Ekle |.
      6. Alan seçim araçları Dikdörtgen ' i tıklatın ve yaklaşık 1/9 bir dikdörtgen çizin Görüntü penceresinin boyutu. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Döndürme |. 5.3.1.4 adımda ölçülen açı eksi derecelerde yazmak. açı sütun ve bu adımda çizilen dikdörtgen döndürmek için Tamam düğmesini tıklatın.
      7. Adım 5.3.1.6 çizilmiş dikdörtgeni taşımak. ok tuşlarını kullanarak. Dikdörtgenin sol tarafında ve üçüncü boyuna ven arka satırına iliştirilmiş dikdörtgenin alt tarafında ikinci boyuna ven arka çizgisinin bitiş noktası ayarlayın. Bu yordamda üçüncü boyuna ven arka satýr ikinci boyuna ven bitiş noktası arasında dikey bir çizgi çizilir onaylayın. Dikey çizgi ayak (şekil 2A) A noktası tanımlayın.
      8. X ve y koordinatları nokta a, imleç noktası A. üzerinde yerleştirirken Alan seçim araçları belirtilen kayıt
    2. B noktasını, boyuna ven uç nokta tanımı
      1. Bir boyuna ven uç nokta görüntünün merkezinde olduğu bir resim açın. Resmi tıklayın | Türü | 8-bit | görüntü 8 bit görüntüyü dönüştürmek için.
      2. 5.3.1. adımda açıklanan aynı yordamı yineleyin. (A noktasının tanımı, campaniform sensillum nokta) noktasından bir görüntü bulmak için.
      3. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Yöneticisine Ekle |.
      4. Alan seçim araçları Dikdörtgen ' i tıklatın ve bir dikdörtgen çizin. Dikdörtgenin üst sol köşe üçüncü boyuna ven arka çizgisinin bitiş noktası ayarlayın.
      5. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Yöneticisine Ekle |.
      6. Satır seçim araçları açı aracını tıklatın. A noktası ve bitiş noktası üçüncü boyuna ven arka çizgisinin bağlanmak için ilk çizgi çizin. Bu satırı A. çizgi çizmek Adım 5.3.2.4 çizilen dikdörtgen üst tarafındaki ikinci satırı tanımlayın. İki çizgi arasındaki açı ölçmek için "m" tuşuna basın.
      7. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Yöneticisine Ekle |.
      8. Alan seçim araçları Dikdörtgen ' i tıklatın ve yaklaşık 1/9 bir dikdörtgen çizin Görüntü penceresinin boyutu. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Döndürme |. 5.3.2.6 adımda ölçülen açı eksi derecelerde yazmak. açı sütun ve bu adımda çizilen dikdörtgen döndürmek için Tamam düğmesini tıklatın. Dikdörtgenin ok tuşlarını kullanarak hareket. Böylece dikdörtgenin sol tarafta a hattı ve dördüncü boyuna ven ön çizgisinin bitiş noktası için bağlı olduğu dikdörtgenin üst tarafında ayarlayın.
      9. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Yöneticisine Ekle |.
      10. Alan seçim araçları Dikdörtgen ' i tıklatın ve yaklaşık 1/9 bir dikdörtgen çizin Görüntü penceresinin boyutu. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Döndürme |. 6. adımda ölçülen açı sütununda açısı eksi derecelerde yazmak ve bu adımda çizilen dikdörtgen döndürmek için Tamam ' ı tıklatın. Dikdörtgenin ok tuşlarını kullanarak hareket. Adım 5.3.2.8 çizilmiş dikdörtgenin üst sol köşe olduğunu dikdörtgenin alt sol köşe ayarlayın., A. satırı tanımlamak için dördüncü boyuna ven ön çizgisi bitiş noktasının dikey çizgi elde elde edilen dikey çizgi ve nokta B (şekil 2B) olarak üçüncü boyuna ven arka çizgi kesişme noktası.
      11. X ve y koordinatları nokta b, imleç noktası b yerleştirirken Alan seçim araçları belirtilen kayıt
    3. C noktası, posterior crossvein nokta tanımı
      1. Posterior crossvein nokta görüntünün merkezinde olduğu bir resim açın. Resmi tıklayın | Türü | 8-bit | görüntü 8 bit görüntüyü dönüştürmek için.
      2. C noktası dördüncü boyuna ven arka crossvein kesişme alanında ve dördüncü boyuna ven (şekil 2C) ön çizgi arka en noktası olarak tanımlayın.
      3. X ve y koordinatları nokta c, imleç noktası c üzerinde yerleştirirken Alan seçim araçları belirtilen kayıt
    4. Nokta D, denetim alanı tanımı
      1. Bir campaniform sensillum nokta görüntünün merkezinde olduğu bir resim açın. Resmi tıklayın | Türü | 8-bit | Resim 8-bit görüntüyü dönüştürmek için.
      2. Düz çizgi seçim araçları tıklatın ve ikinci boyuna ven ön hat ve dördüncü boyuna ven arka çizgisinin bitiş noktası bitiş noktası bağlayan bir çizgi çizin. Nokta D Bu satırı ve posterior üçüncü boyuna ven (şekil 2B) hattının geçiş noktası olarak tanımlayın.
      3. X ve y koordinatları nokta d, imleç noktası d yerleştirirken Alan seçim araçları belirtilen kayıt
  4. Ölçümleri
    1. (Ölçüm noktası a, açmak için görüntünün merkezinde A noktası ile) kanat noktalar görüntülerden birini açın. Resmi tıklayın | Türü | 8-bit | Resim 8-bit görüntüyü dönüştürmek için.
    2. Alan seçim araçları Dikdörtgen ' i tıklatın ve boyutunun yaklaşık 1/9 görüntü penceresinde bir dikdörtgen çizin.
    3. Düzenle'yi tıklatın | Seçimi | Belirtmek |. Oval ve merkezli sütununu kontrol edin. 100 (piksel) genişlik ve Yükseklik sütunlar halinde yazmak, A noktası (veya noktası B veya C noktası) x koordinatlarını yazmak ve D X koordine sütun ve yazma y A noktasının koordinatları (veya noktası B veya C noktası) ve D Y Koordinat sütun. Tamam' ı tıklatın.
    4. Tıklayın analiz | Ölçü |. 5,2 açıklanan kalibrasyon zaten bitmiş, ODs demek sütununda belirtilir.
    5. ΔODs OD noktası D A, B ve c noktalarından ODs üzerinden çıkararak hesaplamak
      Not: Nokta D kanat şeffaf bir parçası ve pigmentasyon içermez ve bu nedenle bir arka plan kontrol için uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

D. guttifera pupa dönemine 17 aşamaları (P1 - P15(ii); görüntüler üç temsilcisi aşamaları (P1, P5 - 6, P10) şekil 3ve tüm 17 aşamaları şekil 4' te gösterilmiştir gösterilir) ayrılmıştır. Bainbridge ve Bownes17 20 D. melanogasteraşamalarında kabul rağmen bu aşamaların bazıları D. guttiferaiçin uygulanamadı. İki gelişimsel olayların sırası, sarı vücudun (kitle içindeki midgut

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada pupa aşamaları, tanımını protokollerde pupa aşamaları sürelerini ve siyah noktalar üzerinde D. guttiferakanadında yoğunluğu ölçümü ölçme detaylı gözlem için puparium kaldırma açıklar. Bu protokoller için birçok Drosophila uygulanabilir ve sinek türleri, özellikle türler kanat pigmentasyon ile ilgili.

Daha da derinlemesine gözlem ve gelişimsel olaylarını daha ayrıntılı açıklamasını alt aşamaları sağlayacak. Birçok durumda, diseksiyon gerektiren veya bir pupa kesit geliş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Biz Sean B. Carroll ve Thomas Werner sinek hisse senetleri, Naoyuki sigorta donanımları için Byung Seok Jin filme, Kiyokazu rehberlik için Agata ve Elizabeth İngilizce düzenleme Nakajima'onun yardım sağlamak için teşekkür ederiz. Bu eser KAKENHI tarafından desteklenen 17K 19427 ve Takeda Bilim Vakfı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Drosophila guttiferaU.C. San Diego'daki Drosophila Tür Stok Merkezi15130-1971.10Drosophila guttifera, bu makalede kullanılan bir meyve sineği türü
Plastik şişeHightechMKC-30Sinek stoğu bakımı için plastik şişe
Cam şişeler için vızıltı bujileri şişesi ve şişe kapaklarıFisher ScientificAS-271Sinek stoğu bakımı için selüloz tapa
Beyaz yumuşak şekerMitsui SugarJ-500gBeyaz yumuşak şeker, standart mısır unu/şeker/maya/agar yemi için
Mısır unuNippon Un DeğirmenleriFMısır unu, standart mısır unu/şeker/maya/agar yemi için
Mısır ezmesi - CNippon Un DeğirmenleriGCMısır ezmesi - C, standart mısır unu/şeker/maya/agar yemi için
Agar tozuMatsuki Kanten SangyoNo.602Agar tozu, standart mısır unu/şeker/maya/agar gıdaları için
Kuru bira mayasıAsahi Food & SağlıkHizmetleri Y2AKuru bira mayası, standart mısır unu/şeker/maya/agar gıdaları için
Bütil p-hidroksibenzoatNacalai Tesque06327-02Bütil p-hidroksibenzoat, standart mısır unu/şeker/maya/agar gıdaları için
EtanolWako057-00456Etanol, standart mısır unu / şeker / maya / agar gıdaları için
Düz tabanlı mikrotüpIna OpticaCF-01501.5 mL mikrotüp, için pupa toplama
CAPSULEFUGETomyPMC-060Mini mikrosantrifüj, pupa toplamak için
Sterilize Edilmiş Schale NBSansei Medical01-013Plastik Petri kabı (çap 90 mm x yükseklik 15 mm)
Serum tüp rafıIwaki9796-050Pupa'nın gözlemlenmesi için nemli bir oda olarak kullanılır
Corning Falcon Easy-Grip doku kültürü kabıCorning353001Plastik Petri kabı (çap 35 mm x yükseklik 10 mm)
Falcon standart doku kültürü kabıCorning353002Plastik Petri kabı (çap 60 mm x yükseklik 15 mm)
Push-pinKokuyo51233709Mikrotüp kapağında iğne delikleri açmak için Stereomikroskop
OlympusSZX16Stereomikroskop, morfolojik gözlem için
Dijital fotoğraf makinesiOlympusDSE-330-ADijital kamera, görüntüleme için
NICETACK çift taraflı bantNichibanNW-15SFÇift taraflı bant, puparium
Dumont #5 forsepsleriniGüzel Bilim Araçları11252-20Forseps, puparium çıkarmak için
Van Gogh VISUAL Boya fırçasıTalens JaponyaGWVR-#5/0Puparium Greiner'ı çıkarmak için boya fırçası
CELLSTAR 12 kuyulu hücre kültürü plakasıMerck665-18012 oyuklu hücre kültürü plakası, pupa dönemlerinin sürelerini ölçmek için
NaClWako191-01665NaCl, PBS
KClNacalai Tesque285-14KCl, PBS
Na2HPO4· için; 12H2OWako196-02835Na2HPO4· 12H2O,
PBS için KH2PO4Nacalai Tesque28721-55KH2PO4, PBS
Kademeli Nötr Yoğunluk (ND) Filtresi 0.04 - 3.0için Edmund Optics64-384Kademeli yoğunluk filtresi, pigmentasyon ölçümünün kalibrasyonu için
ImageJ yazılımıNIH1.8.0-101ImageJ yazılımı, bir kanattaki siyah noktaların yoğunluğunun ölçümü için (https://imagej.nih.gov)
FINE FROST cam slaytMatsunami Glass IndFF-001Kanattaki siyah noktaların yoğunluğunun ölçümü için cam slayt
Kare mikroskop kapak camı 18 x 18Matsunami Glass IndC018181Bir kanat üzerindeki siyah noktaların yoğunluğunun ölçümü için kapak kayması,
çıkarmak için için

Kaynaklar

  1. Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. Hecht, M. K., Steere, W. C. , Springer (Meredith Corporation). New York. 437-543 (1970).
  2. Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: a guide to species identification and use. , Academic Press. New York. (2006).
  3. Patterson, J. T. The Drosophilidae of the southwest. 4313, University of Texas Publication. 7-216 (1943).
  4. Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
  5. Werner, T., Jaenike, J. Drosophilids of the Midwest and Northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester. (2017).
  6. Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
  7. Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136(2015).
  8. Gompel, N., Prud'homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
  9. Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
  10. Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
  11. Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
  12. McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
  13. Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
  14. Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
  15. Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
  16. Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
  17. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
  18. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
  19. Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
  20. Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. Sekimura, T., Nijhout, H. F. , Springer. New York. in press (2017).
  21. True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  23. Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051(2016).
  24. Resh, V. H., Cardé, R. T. Encyclopedia of Insects. , 2nd ed, Academic Press. Burlington. (2009).
  25. DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
  26. Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
  27. McKinney, M. L., McNamara, K. Heterochrony: the evolution of ontogeny. , Plenum Press. New York. (1991).
  28. Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners' guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
  29. Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Pupa EvrelemesiPuparyumun kar lmasG r nt AnaliziImageJ Yaz l mMorfolojik G zlemGeli im ZamanlamasEvrimsel Geli im BiyolojisiStereo Mikroskopi

İlgili makaleler