X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

Özet

Bu yöntem klonlama, ifade ve yapısal tayini için rekombinant Nsa1 arınma x-ışını kristalografisi ve küçük açı X-ray saçılma (SAXS) tarafından açıklar ve diğer proteinlerin hibrid yapısal analiz için geçerlidir her ikisi de içeren düzenli ve düzensiz etki alanları.

Özet

Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) elde ribozom derleme faktörü Nsa1 tam uzunlukta yapısını belirlenmesi zor nedeniyle düzensiz ve proteaz değişken C-terminus protein. Bu el yazması x-ışını kristalografisi ve SAXS göre yapısal analiz için S. cerevisiae üzerinden rekombinant Nsa1 arındırmak için yöntemleri açıklar. X-ışını kristalografisi Nsa1 iyi N-terminal WD40 etki alanı yapısını çözmek için kullanılmıştır ve sonra SAXS Nsa1, C-terminus yapısında çözüm çözmek için kullanıldı. Çözüm saçılma veriler çözüm tam uzunlukta Nsa1 üzerinden toplanmıştır. Teorik saçılma genlikleri WD40 etki alanı yüksek çözünürlüklü kristal yapısı hesaplanan ve C-terminus Nsa1, katı vücut ve ab initio modelleme bir arada ortaya koydu. Bu melez yaklaşımla tüm protein dördüncül yapısının yeniden. Burada sunulan yöntemleri genel olarak yapılandırılmış ve yapılandırılmamış etki alanları karışımından oluşan diğer proteinlerin hibrid yapısal kararlılık için uygulanabilir olmalıdır.

Giriş

Ribozom mRNA tüm canlı hücrelerdeki protein dönüştürerek httpd'ye temel rolü gerçekleştirmek büyük Ribonükleoprotein makinelerdir. Ribozom ribozom biyongenezi^1,2,3,4olarak adlandırdığı karmaşık bir süreç içinde üretilen iki altbirimden oluşur. Ökaryotik ribozom derleme gerekli ribozomal derleme faktörler^2,3,5yüzlerce yardımıyla dayanır. Nsa1 (Nop7 ilişkili 1) özellikle büyük ribozomal altbirimde⁶üretimi için gerekli olan bir ökaryotik ribozom derleme bir faktördür ve WD yineleme olarak bilinen 74 (WDR74) daha yüksek organizmaların⁷içeren. WDR74 fareler⁸blastosist oluşumu için gerekli olduğu gösterilmiştir ve WDR74 düzenleyici sık kanser hücreleri⁹' mutasyona uğramış. Ancak, işlev ve Nsa1/WDR74 kesin mekanizmaları ribozom derlemesinde hala büyük ölçüde bilinmeyen vardır. Nsa1/WDR74 rolü ökaryotik ribozom olgunlaşma sırasında ortaya çıkarmak başlamak için birden çok yapısal analiz, x-ışını kristalografisi ve küçük açı X-ray saçılma (SAXS)¹⁰gibi yapıldı.

X-ışını kristalografisi, Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, elektron mikroskobu ve SAXS makromoleküllerin yapısı eğitim için tüm önemli teknikler vardır. Boyut, şekil, kullanılabilirliğini ve kararlılığını belirli bir makromolekül en iyi olacak Yapısal Biyoloji yöntemi uygun oluştururlar etkiler, ancak bir çok teknik bir sözde "melez" yaklaşımla birleştirerek haline geliyor bir giderek daha faydalı aracı¹¹. Özellikle x-ışını kristalografisi ve SAXS yapısal oluştururlar¹²tespiti için güçlü ve tamamlayıcı yöntemler vardır.

Kristalografi ribozom gibi büyük hücresel makine küçük moleküller arasında değişen yüksek çözünürlüklü atomik yapıları sağlar ve proteinleri ve diğer biyolojik fonksiyonların anlamada çok sayıda devrimler yol açmıştır oluştururlar¹³. Ayrıca, uyuşturucu yapısı tabanlı tasarım hesaplama yöntemleri, ilaç bulma ve geliştirme¹⁴için kritik bir boyut ekleme tarafından Moleküler yerleştirme için kristal yapıları gücünü. Onun geniş uygulanabilirliği rağmen esnek ve düzensiz kristal ambalaj engel veya elektron yoğunluğu eşlemeleri tamamlanmamış olabilir beri kristalografisi, ya da düşük kaliteli değerlendirmek için zorlu sistemlerdir. Tersine, SAXS çözüm tabanlı ve düşük çözünürlüklü yapısal yaklaşım düzensiz döngüler ve termini özünde düzensiz proteinler^12,15,16' kadar esnek sistemleri açıklayan yeteneğine sahip olduğunu. Parçacık boyutları¹²geniş bir yelpazesi ile uyumlu olduğunu düşünürsek, SAXS sinerjik kristalografisi yapısal çalışmaları tarafından ele alınması biyolojik sorular aralığı genişletmek için çalışabilirsiniz.

Bir fonksiyonel ama esnek C-hangi x-ışını kristalografisi yöntemleri için müsait değildir terminus ardından iyi yapılandırılmış bir WD40 etki alanı içerdiği için Nsa1 bir melez yapısal yaklaşım için uygundur. Klonlama, ifade ve arıtma S. cerevisiae Nsa1 x-ışını kristalografisi tarafından hibrid yapısal tayini için ve SAXS için bir protokol aşağıdadır. Bu iletişim kuralı bir arada düzenli ve düzensiz bölgeler oluşmaktadır diğer proteinler yapılarının çalışmaya adapte edilebilir.

Protokol

1. rekombinant Protein üretimi ve Nsa 1 arıtma

1. Nsa1 ifade plazmid tasarım ve klonlama
   1. Elde etmek veya S. cerevisiae genomik DNA satın alın.
   2. PCR yükseltmek Nsa1 hedef dizisi (Nsa1_FL, artıkları 1-463) ve C-terminal kesildi Nsa1 (Nsa1_ΔC, artıkları 1-434) S. cerevisiae ve erime sıcaklığını izole genomik DNA'yı kullanarak uygun astar ile yaklaşık 1-2 dk bir uzantısı zaman ile 60 ° C. Aşağıdaki astar Nsa1 yükseltmek için kullanılmıştır:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1_ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1_ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
   3. Bir N-terminal içeren Escherichia coli (e.coli) ifade vektör pHMBP Nsa1 subclone 6 X-histidin etiketi ardından maltoz bağlayıcı Protein (MBP) ve standart klonlama teknikleri^{17 kullanarak bir tütün Etch virüs (TEV) proteaz site ekleyin} .
   4. DNA sıralama Nsa1 N-terminal MBP O'nun etiketiyle çerçevesindeki klonlanmış doğrulamak için kullanın.
2. Nsa1 Protein ifade
   1. İfade plasmid(s) uygun bir E. coli dönüşümü ifade gerilme T7 organizatörü tabanlı bir sistemin ile. Transformants 100 µg/mL Ampisilin içeren LB agar plakalar üzerinde plaka ve plaka gecede 37 ° C'de ters kuluçkaya
   2. 100 µg/mL Ampisilin dönüştürme plaka ile LB 50 mL kültürünü aşılamak ve gecede 200 devirde 37 ° C'de sallayarak ile büyür
   3. 3 x 1000 mL lb Fernbach şişeler 100 µg/mL Ampisilin ile yapılan gecede kültür 15 mL ile aşılamak ve 37 ° C'de 200 devirde sallayarak ile büyür
      Not: protein yapısı çözüm için selenomethionyl (SeMet) birleşme hücreleri ile SeMet ve bir amino asit karışımı metiyonin üretim indüksiyon, LB medya aksine önce etkisizleştirmek için takıma M9 en az orta büyüyen tarafından elde edilebilir ¹⁸.
   4. OD₆₀₀ ~0.8 Buna ek olarak izopropil β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) tarafından ulaştığında 1 mM gecede 200 devir / dakikada sallayarak ile kuluçka 25 ° c ve ardından son bir konsantrasyon, Nsa1 ifade teşvik.
   5. Santrifüjü 5,050 x g de 15 dakika 4 ° C'de tarafından hücre hasat.
      Not: Hücreleri uzun vadeli-80 ° C'de depolanan veya hemen protein arıtma için kullanılan.
3. Nsa1 Protein saflaştırma
   1. Bir EDTA ücretsiz proteaz inhibitörü tablet içeren 4 ° C'de önceden soğutulmuş lizis arabelleği (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, % 10 gliserol, 10 mM MgCl₂) 25 mL hücrelerde resuspend.
   2. 4 ° C'de sonication tarafından hücreleri Parçalayıcı (zaman 7 dk., 2 dönemi, 2 s s döngüsü kapalı; genlik: % 70).
   3. Santrifüjü 26,900 x g 4 ° C'de 45 dk için de tarafından lysate açıklamak
   4. Geçerli bir yerçekimi akışı sütuna immobilize kobalt benzeşme reçine 10 mL ile yüklenen lysate açıklık, önceden lizis arabellek ile dengelenmiş.
   5. Yerçekimi akımını 4 ° C'de reçine geçmek ve reçine lizis arabelleği 100 mL ile iki kez yıkayın süpernatant izin.
   6. Nsa1 20 mL elüsyon arabellek (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, % 5 gliserol ve 200 mM imidazole) ile elute.
   7. Eluate 15 μL al ve kaç protein benzeşme reçine (şekil 1A) eluted doğrulamak için bir 4-%15 SDS-sayfa jel üzerinde.
   8. MBP etiketi TEV proteaz sindirim tarafından kaldırın. TEV proteaz¹⁹ (1 mg/mL stok) 1 mL Nsa1 benzeşme reçine elüsyon için ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya.
   9. Konsantre MBP i ciddi Nsa1 için ~ 5 mL bir molekül ağırlığı ile santrifüj filtre kullanarak kapalı 10 kDa kes.
   10. MBP i ciddi Nsa1 geçerli bir jel-filtrasyon sütun için arabellek (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, % 5 gliserol ve 1 mM β-mercaptoethanol) önceden equilibrated (şekil 1B).
   11. Sütun kesirler MBP i ciddi ve Nsa1 15 μL örnekleri 4-%15 SDS-sayfa jel (şekil 1B) üzerinde çalıştırarak ayrılmış doğrulamak için jel filtrasyon üzerinden analiz.
   12. Nsa1 içeren kesirleri birleştirin ve 8 mg/mL 10 kDa uzakta-in kesmek bir molekül ağırlığı ile santrifüj filtre kullanarak için konsantre.
   13. 280 Absorbans ölçerek protein konsantrasyonu belirlemek yok olma katsayısı 42530 M^-1cm^-1' i kullanarak bir Spektrofotometre nm. Protein hemen proteolitik tarama ve kristalizasyon denemeler için kullanın.

2. kristalizasyon ve Nsa 1 proteolitik tarama

1. Seyrek matris kristal tarama Nsa1
   1. Nsa1 8 mg/mL stok vasıl 10 dk 4 ° C'de 16.000 x g 500 μL santrifüj kapasitesi.
   2. Kristalizasyon denemeler kristalizasyon robot ve seyrek matris kristal ekranlar kullanarak kurulum. Bireysel kristal ekran reaktifler seyrek matris kristalizasyon ekranlar üzerinden 30 μl ile 96 iyi tepsiler rezervuar doldurun. 250 karıştırılarak robot ile oturma damla kurulum nL 250 ile iyi çözüm nL protein çözüm.
   3. Kristalizasyon plakalarının bant ile ve onları 25 ° C'de kuluçkaya
   4. Tabakları her iki günde bir stereomicroscope ile ilk 2-3 hafta boyunca kontrol edin.
   5. Potansiyel kristalleri sayısı UV mikroskopla protein içerdiğini doğrulayın.
      Not: Nsa1 iki farklı kristal formlar için (kübik ve Ortorombik, şekil 2A) aşağıdaki ekranları 1 hafta içinde elde edilmiştir: JCSG + condition B11 (1.6 M sodyum sitrat Tribazik kurutmak, pH 6,5) ve Sihirbazı Precipitant sinerji ekran blok 2 C11 durumu (20.1%(v/v) 1500 PEG, 13.4%(v/v) 400 PEG, 0.1 M Tris HEPES/sodyum hidroksit, pH 7.5).
2. Proteolitik tarama
   Not: kristalizasyon en iyileştirme sırasında bu Nsa1 Ortorombik kristalleri proteolitik bölünme sonucu olarak ortaya çıktı ve tam uzunlukta protein kullanarak kristallerin çoğaltılamadı keşfedildi. Sınırlı proteolizis kütle spektrometresi ile birleştiğinde kullanarak, bu Nsa1, C-terminus proteolizis için hassas ve C-terminal kuyruk kaldırılması Ortorombik kristal formu (sonraki üreme için gerekli belirlendi Nsa1_ΔC).
   1. 1 mg/mL proteaz hisse senedi çözümleri aşağıdaki proteaz α-kimotripsin, Tripsin, elastase, papain, subtilisin ve endoproteinase Glu-C. hazırlamak
   2. 1:10, 1: 100 ve 1: 1000 dilutions her 1 mg/mL proteaz stokunun ile seyreltme tampon (10 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM Sodyum Klorür) oluşturun.
   3. Proteaz stokunun (1:10, 1: 100 ve 1: 1000) 1 μL pipet protein (1 mg/mL) taranması her proteaz için 9 μL aliquots içine.
   4. Çözüm için 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.
   5. Reaksiyon 10 μL 2 x SDS-sayfa örnek arabelleği ekleyerek durdurmak ve 5 min için 95 ° C'de tepki ısı.
   6. Özetler bir % 4-15 SDS-sayfa jel (şekil 2B) çalıştırarak analiz.
   7. Hedef protein proteaz dayanıklı etki alanlarına göre jel kütle spektrometresi analiz tanımlayın.
   8. Proteaz değişken bölgeler kesilmiş ifade yapılarını oluşturarak ve yukarıda açıklanan klonlama, ifade ve arıtma iletişim kuralı aşağıdaki hedef protein kaldırın.
3. Kristalizasyon en iyi duruma getirme
   1. Hazırlamak veya hisse senedi çözümleri aşağıdaki ilk kristalizasyon reaktifler, alın: 1.6 M sodyum sitrat Tribazik kurutmak pH 6,5, 100%(v/v) 400 PEG, 50%(v/v) 1500 PEG, 1 M HEPES/sodyum hidroksit, pH 7.5.
   2. Nsa1 stok çözeltisi hazırlamak_FL ve Nsa1_ΔC , 8 mg/mL yukarıda açıklandığı gibi.
   3. Nsa1 kübik kristaller optimize (Nsa1_FL).
      1. 1-1.6 m sodyum sitrat ile pH 6,5-1,6 M sodyum sitrat Tribazik hisse senedi bir çözüm pH 6,5 ile gradyan ile 500 µL içeren wells ile 24-iyi kılavuz ekran hazırlayın.
      2. Mix 1 µL 1 µL iyi çözüm ve yeri bir kapak silikonlu slayt üzerine karışımı ile protein. Dikkatli önceden yağlanmış üstüne kapak slayt iyi ve emin olmak ters çevir'i de kapalı ama değil damla rahatsız veya kapak slayt kırmak için özen gösterin. Tepsi doldurulur kadar bu işlemi yineleyin ve ardından 25 ° C'de depolayın
         Not: Küçük kübik kristaller 2-7 gün içinde görünmelidir.
      3. Bir microseed hisse senedi kübik kristaller hazırlayın. Bir monte naylon döngü ~ 10 küçük kübik kristaller küçük boncuk ve 1,6 M sodyum sitrat Tribazik zekâ pH 6,5 50 µL içeren 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü aktarmak için kullanın.
      4. Girdap 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü yüksek hızda (~ 3000 devir/dakika) 1 dk için.
      5. Karışım iyice 5 için 1,6 M sodyum sitrat Tribazik ve girdap ile tohum stokunun 10 kat seri dilutions bir dizi yapmak s.
      6. Her doldurmak iyi bir 24-şey tablo, 1,6 M sodyum sitrat Tribazik pH 6,5 500 µL ile ekran.
      7. Microseeding koşulları damla protein tohum stok Çözümleri (şekil 3A) ile değişen oranlara sahip ayarlayarak en iyi duruma getirme. Yüksek kırınım kalite daha büyük kübik kristaller (şekil 3 c) 2-5 gün içinde görünmelidir.
   4. Ortorombik kristalleri optimize (Nsa1_ΔC)
      1. 500 µL 24 farklı koşullar (şekil 3B) ile her iyi bir kılavuz ekran 50%(v/v) PEG 1500 ve 100%(v/v) PEG 400 hisse senedi çözümlerinden hazırlayın. Ek olarak degradeler PEG 1500 ve PEG 400 her şey aynı 0.1 M HEPES/sodyum hidroksit pH 7.5 içermelidir.
      2. Protein çözüm 1 µL silikonlu kapak Slayt üzerindeki iyi çözüm 1 µL karıştırın. Dikkatli önceden yağlanmış üstüne kapak slayt iyi ve emin olmak ters çevir'i de kapalı. Tüm belgili tanımlık tepsi dolu kadar bu işlemi yineleyin. Tepsiler 25 ° C'de depolayın
         Not: Nsa1 Ortorombik kristalleri 2-7 gün içinde görünmelidir.
      3. Kübik kristaller (Adım 2.3.3.3-2.3.3.7) açıklandığı gibi Ortorombik kristalleri microseeding tarafından daha fazla optimize 20.1%(v/v) 1500 PEG, 13.4%(v/v) PEG 400 ve 0.1 M HEPES/sodyum hidroksit pH 7.5 500 µL iyi çözüm olarak kullanarak.
         Not: Nsa1 SeMet kristalleri benzer şekilde yerel kristaller daha optimize edilmelidir.

3. x-ışını kırınım veri toplama ve Nsa 1 yapı çözüm

1. Cryo-kristaller ve x-ışını kırınım veri toplama korunması
   1. Ortorombik kristalleri (Nsa1_ΔC), 22.5%(v/v) 1500 PEG, 15%(v/v) PEG 400 ve 0.1 M HEPES/sodyum hidroksit pH 7.5 içeren 1 mL cryoprotectant solüsyon hazırlamak.
   2. Bir köpük Dewar sıvı azot ile doldurun ve kristal Pak önceden serin. Sıvı azot ile çalışırken dikkatli olun ve koruyucu eldiven ve gözlük.
   3. Dikkatle de içeren bir stereomicroscope sahneye kristalleri kristalleşme kapak slayt tersine çevirin.
   4. Yeni bir kapak slayt üzerine cryoprotectant çözümün 2 µL pipet.
   5. Bir monte naylon döngü kristal için uygun büyüklükte bir manyetik cryo değnek iliştirin.
   6. Stereomicroscope yardımıyla kullanarak, hızlı bir şekilde bir kristal takılı cryo döngü ile cryoprotectant çözüm aktarın.
   7. 5 dakika içinde cryoprotectant çözüm için equilibrate kristal ver.
   8. Stereomicroscope yardımıyla kullanarak, hızlı bir şekilde cryoprotectant çözüm ve Dalma-freeze gelen kristal sıvı azot döngüsü.
   9. Kaynama durdurmak için döngü etrafında sıvı azot bekleyin ve değneği üzerinden döngü kristal puck içinde belirli bir konuma bırakın.
   10. Kübik Nsa1_FL kristalleri cryoprotected olmak gerekli olmayan ve olmak doğrudan flaş dondurulmuş (adımları 3.1.8-3.1.9 yukarıdaki).
   11. Cryo araçlarını kullanarak kristal puck mühür ve bir nakliye baston önceden soğutulmuş dewar içinde transfer. Kristalleri adam/dewars veri toplama kadar saklayın.
   12. Eğer bir sinkrotron veri toplama, Kuru bir nakliyeci kullanarak sinkrotron kristal gemi.
   13. Aşağıdaki standart teknikleri²⁰x-ışını kırınım veri toplamak.
       Not: Nsa1 yerli ve SAD için (tek dalga boyu anormal dağılım) veri kümeleri 100 K 22-ID ve 22-BM Argonne Ulusal Laboratuvarı (Chicago, Il) gelişmiş foton kaynağının SER-kedi ışın satırlarındaki toplanmıştır. SAD Nsa1 veri kümesi λ toplanan 0.97911 Å =. Veri 1 s çekim hızı ve 0.5 ° salınımlarını kullanarak kaydedildi. Bu kristaller mosaicity genellikle yaklaşık 0.3 ° yapıldı.
   14. İşlem ve ölçeği x-ışını kırınım yansıma dosyaları her veri kümesi için uygun alan grubunda oluşturmak resimlerini.
       Not: HKL2000²¹Nsa1 Difraksiyon veri kümeleri işlendi. Nsa1 kübik kristaller uzay grubu P2₁3 işlendi ve Ortorombik kristaller içinde alan grup P2₁2₁2₁işlendi.
2. Nsa1 yapı çözüm.
   Not: Çözmek ve rafine Phenix ve CCP4^22,23dahil olmak üzere kristal yapılar için kullanılan birkaç kristalografisi yazılım paketleri vardır. Phenix yazılım Süiti²²kullanarak Nsa1 yapı çözüm için protokol aşağıdadır.
   1. Çözümlemek veri kümeleri phenix.xtriage²²ile yerli ve SAD ölçekli.
   2. ÜZGÜN tepe yansıma dosyası^22,24kullanarak Phenix.autosol ile Nsa1 yapısını çözmek. AutoSol programını çalıştırmak için selenomethionine sitelerin sayısı giriş (siteleri = 9), Nsa1_ΔC ve üzgün veri toplamak için kullanılan dalga boyu fasta sıra dosya (λ 0.97911 Å =).
      Not: Nsa1 SAD kümesinden phenix.autosol deneysel aşamada belirlemek ve çoğu model oluşturmak gerekir.
   3. Coot²⁵phenix.refine^22,26arıtma ardından, modeliyle manuel ayarlamalar.
   4. Yüksek çözünürlüklü yerli Ortorombik kristal ve kübik kristal yapısı moleküler yedek tarafından fazer^27,28kullanarak çözmek.
   5. Model ve elektron yoğunluğu başarılı yapı çözüm sonra incelemek harita Coot²⁵.
   6. Oluşturmak ve phenix.refine^22,26 , Sakarmeke²⁵bina modelini arıtma yinelemeli tur çalıştırarak yapılar rafine.

4. SAXS veri toplama, işleme ve modelleme

1. SAXS veri toplama
   Not: Tam uzunlukta S. cerevisiae için SAXS veri kaydedildi, Gelişmiş ışık kaynağında yüksek üretilen iş FALCILAR beamline 12.3.1 Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı, Berkeley, CA²⁹Nsa1.
   1. Nsa1 arındırmak yukarıda açıklanan protokol sonrası_FL . Nsa1 Sevkiyat öncesinde 24 h_FL beamline, protein bir jel filtrasyon sütun üzerinde çalıştırmak için önceden dengelenmiş bir arabellek A.
   2. Nsa1 içeren kesirleri havuz ve daha önce anlatıldığı gibi protein konsantrasyonu belirlemek.
   3. Toplama serisi 1 Nsa1 6,2 mg/ml arabellek c.kullanarak 30 μl aliquots hazırlamak
   4. Nsa1 her konsantrasyon dizi 20 μl etek net tam 96 iyi Mikroplaka arabellek A yalnız denetimleri ile birlikte aktarın.
      Not: SAXS veri toplama, arası parçacık itme ve radyasyon hasarı etkileri önlemek için saflaştırılmış örnek çeşitli konsantrasyonları kullanarak sulu çözümler üzerinde toplanır.
   5. Mikroplaka sızdırmazlık mat ve gemi gecede 4 ° c beamline ile bir silikon ile kapatın.
   6. 4 ° C'de Mikroplaka veri toplama kadar saklayın.
   7. Hemen veri toplama önce 3200 x g 10 dk 4 ° C'de potansiyel toplamları kaldırmak ve hava kabarcıkları için plaka döndür.
   8. Kayıt SAXS veri.
      Not: Nsa1 için SAXS veri arabelleği için önce ve sonra her protein konsantrasyonu serisi kaydedildi. Otuz üç ardışık s Nsa1 için toplanan 0,3 taranmasını_FL 10 ° C'de bir konsantrasyon dizi (1-6,2 mg/mL) üzerinden
   9. Arabellek çıkarma SAXS veriler için gerçekleştirme.
      Not: Nsa1 için arabellek çıkarma otomatik olarak beamline yapıldı ama arabellek çıkarma dağılım³⁰ ve³¹ATSAS Süiti gibi veri azaltma yazılımı kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Arabellek çıkarma SAXS veri analizi kritik bir parçasıdır ve çıkarma için kullanılan arabellek protein örnek arabellek için aynı olması için özen göstermelidir.
   10. Ortalama 33 ardışık her konsantrasyon için bir *ave.dat dosyası oluşturmak için tarar.
       Not: eğrileri karşılaştırmak için 33 ardışık kareyi yerleşimi. Saçılma eğrileri zaman içinde değişiklikler kez radyasyon hasar göstergesi. Bu kareler ortalaması üzerinden hariç. Nsa1 üst üste taranmasını ortalama FALCILAR beamline otomatik olarak gerçekleştirildi.
2. SAXS veri işleme ve konsantrasyon serisi karşılaştırılması
   Not: SAXS verileri çözümlemek için kullanılan çeşitli yazılım paketleri vardır. Nsa1 için RADIUS eylemsizlik ve pair-wise mesafe dağıtım işlevleri tespit PRIMUS³² ve Gnom³³ ATSAS 2.7.2 üzerinden kullanarak suite³¹ ve radyasyon yok olduğunu emin olmak için tüm protein konsantrasyonları arasında karşılaştırıldığında hasar veya konsantrasyon bağımlı arası parçacık etkileşimleri¹⁰.
   1. Bir terminal kabuğu'nu açın ve SAXS veri içeren dizine gidin.
   2. PRIMUS³² GUI üzerinden terminal kabuk içinde denize indirmek.
   3. PRIMUS GUI içinde saçılma eğrileri yüklemek (* ave.dat).
   4. Eylemsizlik yarıçapı (R_g) belirlemek ve saçılım yoğunluğu I(0), her saçılma Curve iletmek için AutoR_g kullanın (* ave.dat).
   5. Kratky araziler her saçılma Curve oluşturmak (* ave.dat), anlatım derecesini değerlendirmek için.
   6. AutoGNOM³³ pair-wise dağılım fonksiyonu hesaplamak için kullanın (her saçılma eğrisi için P(r)) olarak da bilinir (* ave.dat). Bir başlangıç D_max ≈ girin 3 * R_g ve D_max değeri düz bir P(r) eğri elde etmek için en iyi duruma getirme. D_maxgetirilmesi sırasında hesaplanan P(r) işlevi tarafından bildirilen χ² değeri denetleme ve görsel olarak saçılma eğriyi uydurmak genel değerlendirilmesi deneysel saçılma eğrisi ile tutarlı olduğundan emin olun.
   7. Nsa1 molekül ağırlığı korelasyon³⁴hacmi kullanarak saçılma eğriler üzerinden hesaplamak.
   8. Yapısal parametreleri yok radyasyon hasarı veya konsantrasyon bağımlı etkileri olduğundan emin olmak için her konsantrasyon için karşılaştırın.
      Not: Konsantrasyon etkileri artan R_g ve D_{en fazla} artan bir protein konsantrasyonu ile ilgili olarak meydana gelen. İleri I(0) örnek konsantrasyon tarafından bölünmüş saçılma da protein konsantrasyonu serisi arasında sabit kalmalıdır.
3. SAXS modelleme
   Not: C-terminus, Nsa1 konumunu belirlemek için_FL, Nsa1 kristal yapısı¹⁰ (PDB 5SUM) ve SAXS saçılma eğrileri bir arada katı vücut ve modelleme, grup ^{programları kullanarak ab initio taşımak için kullanılan 35} ve Ensemble optimizasyonu yöntemi (EOM)³⁶ ATSAS yazılım Süiti³¹. Deneysel SAXS verileri sığdırmak için C-terminus, Nsa1 ile birlikte çeşitli düzensiz döngüler WD40 etki alanından örnek alınarak iken Nsa1 WD40 etki katı bir organ olarak tedavi edildi.
   1. Giriş PDB dosya (lar) oluşturur. PDB dosyasını her zaman artıkları arasındaki ana zinciri eksik ve PDB dosyasını içeren birden fazla biçimler, ligandlar, ya da su molekülleri bölmeniz gerekir.
   2. Grup (pre_bunch.pdb) için giriş PDB dosyasını hazırlamak için Pre_BUNCH³⁵ programını çalıştırın. Hedef protein (*.seq), etki alanları/PDB 4.3.1 içinde oluşturulan sayısını dizisi giriş ve bireysel PDB dosyalarının her birinin yukarıda oluşturulan.
   3. Her bireysel PDB dosyasını programda CRYSOL³⁷saçılma genlikleri hesaplayın. CRYSOL çalıştırmak için bireysel PDB dosyasını ve deneysel SAXS saçılma eğrisi (*.dat) giriş. Bu bir genlikleri dosyası oluşturur (* .alm).
   4. Program grup³⁵ Nsa1 WD40 etki alanı karşı Birleşik bir katı vücut ve ab initio yaklaşım kullanarak SAXS veri modeli için çalıştırın. Girdi PDB dosyasını Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb) üzerinden, deneysel SAXS saçılma eğrisi (*.dat) ve bireysel genlik (* .alm) CRYSOL tarafından oluşturulan her kısmi PDB dosyası için dosyaları.
   5. Başlangıç PDB (5SUM) χ² değerinden modelinden deneysel SAXS verileri kullanarak grup tarafından oluşturulan ab initio bununla karşılaştırırsınız.
      Not: Başarılı bir grup model başlangıç modeli daha önemli ölçüde daha düşük χ² değeri olmalıdır. Grup modeli teorik saçılma Ayrıca de deneysel veriler arasında grup modeli SAXS verilere teorik saçılma ve χ² değerini (şekil 4, düzeninin görsel denetim tarafından karar olarak açıklamalıdır Merkezi boru hattı).
   6. Grup ve SAXS zarf (şekil 4, Merkezi boru hattı) tarafından oluşturulan modeli ile kristal yapısı yerleşimi için Pymol³⁸ grup üzerinden çıktı dosyalarında el ile kontrol edin.
   7. Grup 10 - 20 kez yeniden çalıştırın modelleri benzer olduğunu doğrulamak için bağımsız modelleri oluşturmak için.
      Not: Nsa1 için χ² değerleri ~ 1 3 20 bağımsız çalışan bir dizi vardı.
   8. Ensemble modelleme
      Not: bir isteğe bağlı bir yaklaşım grup EOM³⁶ veya Minimal Ensemble arama³⁹ (MES) çalıştırın. EOM ve MES proteinler ile birden fazla biçimler esnek etki alanları/bölgeler için uygundur ensemble yaklaşımları kullanın.
      1. EOM³⁶ ATSAS online server kullanarak programı çalıştırın. EOM çalıştırmak için 4.3.1, hedef protein (*.seq) ve deneysel SAXS veri (*.dat) dizisi PDB dosyalarından girdi.
      2. Başlangıç PDB (5SUM) χ² değerleri ile deneysel SAXS verileri kullanarak EOM tarafından oluşturulan topluluk karşılaştırmak.
         Not: Başarılı bir EOM topluluğu başlangıç modeli daha önemli ölçüde daha düşük χ² değeri olmalıdır. Teorik saçılma Ensemble Ayrıca de deneysel veri SAXS veri topluluk teorik saçılma ve χ² değerini (şekil 4, sağ arasında düzeninin görsel denetim tarafından karar olarak açıklamalıdır boru hattı). Bir de grup ve EOM hangi modeli en iyi deneysel SAXS verileri tanımlayan belirlemek için χ² değerleri karşılaştırmak gerekir.
      3. El ile EOM conformers Pymol³⁸ kristal yapısı ile EOM (şekil 4) tarafından oluşturulan conformers yerleşimi kontrol edin. Conformers toplam sayısı ve doluluk kısmını saçılma eğrisi için katkıda bulunan her conformer için dikkat edin. Nsa1 gibi daha sert molekülleri conformers sayısı küçük olmalıdır (1-5) (şekil 4, doğru boru hattı)³⁶.
      4. EOM yeniden çalıştırmak tutarlı sonuçlar sağlamak için birkaç kez.
         Not: Nsa1 için conformers sayısı genellikle 3-4 0,1 0,3 için değişen χ² değerleri ile oldu.

Sonuçlar

Nsa1 S. cerevisiae genomik DNA'güçlendirilmiş ve ardından MBP ve TEV proteaz site bir N-terminal 6 x-histidin benzeşme etiketi içeren bir vektör içine subcloned PCR yapıldı. Nsa1 E. coli BL21(DE3) hücrelere dönüştü ve yüksek verim protein ifade aşağıdaki IPTG ile indüksiyon ve 25 ° c gece (şekil 1A) büyüme elde edilmiştir. Nsa1 benzeşme saf üzerinde immobilize kobalt benzeşme reçine, MBP bölünme TEV proteaz ile izledi ve sonunda boyutu dışla...

Tartışma

Bu iletişim kuralını kullanan, rekombinant Nsa1 S. cerevisiae gelen yapısal çalışmaları için x-ışını kristalografisi ve SAXS tarafından oluşturuldu. Nsa1 çözümde su kuyusu-davranmak ve kristal yükseltgen kristalize. Bu kristaller en iyileştirme sırasında C-terminus Nsa1, proteaz düşmesine duyarlı keşfedilmiştir. Yüksek çözünürlüklü Ortorombik kristal formu sadece çoğaltılamaz C-terminal kesme türevleri Nsa1, büyük olasılıkla ile esnek C-terminus Nsa1, kristal ambalaj engelledi çünkü. Nsa1 yapısını x-ışını krista...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
pMBP2 paralel vektörünün	Sheffield ve diğerleri, Protein Ekspresyonu ve Saflaştırma 15, 34-39 (1999)N-terminal		His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomik DNA	ATCC	204508D-5
Nsa1 değiştirilmiş bir versiyonunu kullandık>
SC_Nsa1_FLFw	IDT		CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG
SC_Nsa1_FLRv	IDT		AATGCAGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw	IDT		GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv	IDT		GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTTTGCTTCCC
Nsa1Escherichia
pMBP- NSA1'in Rekombinant Protein Üretimi ve Saflaştırılması ve çeşitli kesmeler	Lo ve diğerleri, 2017
IPTG, Dioksan İçermeyen	Promega	V3953
EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyl	Sigma-Aldrich	4693159001
Sodyum Klorür	Caledon Laboratuvar Kimyasalları	7560-1-80
Magnezyum Klorür hekzahidrat	Sigma-Aldrich	M2670
Tris Tamponu, 1 M pH 7.5	KD Tıbbi	RGF-3340
Gliserol	Invitrogen	15514-029
beta-merkaptoetanol	Sigma	M6250
1M İmidazol, pH 8.0	Teknova	I6980-06
Pençe Afinite	Reçinesi Clonetech	635503
Amicon Ultra 15 mL Santrifüj Filtre (MWCO 10K)	Millipore	UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Hazırlık Sınıfı Jel Filtrasyon Kolonu	GE-Healthcare	28989335
NIEHS Tarafından Hazırlanan TEV Proteaz Protein Ekspresyonu Çekirdek	Ekspresyon NCI tarafından sağlanan plazmid (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
%4-15 Mini-PROTEAN TGX Prekast Protein Jelleri	BioRad	456-8056
Kristalizasyon, Proteolitik Tarama
Kristal Ekran	Hampton Araştırma	HR2-110
Kristal Ekran 2	Hampton Araştırma	HR2-112
Tuz Rx	Hampton Araştırma	HR2-136
İndeks Ekranı	Hampton Araştırma	HR2-144
PEG / İyon Ekran	Hampton Araştırma	HR2-139
JCSG +	Moleküler Boyutlar	MD1-37
Sihirbaz Çökeltici Sinerji	Moleküler Boyutlar	MD15-PS-T
Swissci 96 kuyulu 3 damlalı UVP oturma damla plakaları	TTP Labtech	4150-05823
3 İnç Geniş Kristal Berraklığında Sızdırmazlık Bandı	Hampton Research	HR4-506
Proti-Ace Kiti	Hampton Research	HR2-429
PEG 1500	Moleküler Boyutlar	MD2-100-6
PEG 400	Moleküler Boyutlar	MD2-100-3
HEPES/sodyum hidroksit pH 7.5	Moleküler Boyutlar	MD2-011-Sodyum
Sitrat tribazik	Moleküler Boyutlar	MD2-100-127
22 mm x 0,22 mm Silikonize Kapak Kaydırakları	Hampton Research	HR3-231
Mastikli 24 Kuyulu Plakalar (VDX Plaka ile Mastik)	Hampton Research	HR3-172
18 mM Montajlı Naylon Halkalar (0,05 mm ila 0,5 mM)	Hampton Research	HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Tohum Boncuk Kiti	Hampton Research	HR2-320
Manyetik Kristal Kapaklar	Hampton Research	HR4-779
Manyetik Kriyo Değnek	Hampton Research	HR4-729
Kriyojenik Köpük Dewar	Hampton Research	HR4-673
Kristal Disk Sistemi	MiTeGen	M-CP-111-021
Tam Etek 96 kuyulu Şeffaf Plaka	VWR	10011-228
AxyMat Sızdırmazlık Matı	VWR	10011-130
Equipment
UVEX-m	JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spektrofotometre	Thermo-Fisher
Sivrisinek Robotu	TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000	Otwinoski ve Minor, 1997
Phoenix	Adams ve diğerleri, 2010
Coot	Emsley ve diğerleri, 2010
ATSAS	Petoukhov ve diğerleri, 2012		https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter	Rambo ve Tainer, 2013
Pymol	PyMOL Moleküler Grafik Sistemi, Sürüm 1.8 Schrö dinger, LLC.
BUNCH	Petoukhov ve Svergun, 2005
CRYSOL	Svergun ve diğerleri, 1995
PRIMUS	Konarev ve diğerleri, 2003
EOM	Tria ve diğerleri, 2015