Yöntem makalesi

Otomatik ölçüm Cryptococcal türler polisakkarit kapsülü ve hücre vücut

7.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56957

⸱

11 Ocak 2018

 , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

Bu makalede

Özet

Bu teknik polisakkarit kapsülü ve vücut yarıçaplarını ölçmek için tasarlanmış bir otomatik batch Image processor açıklar. Başlangıçta Cryptococcus neoformans kapsül ölçümleri için tasarlanmış iken otomatik görüntü işlemci dairesel nesneler diğer dayalı kontrast tespiti için de uygulanabilir.

Özet

Bu teknik amacı polisakkarit kapsül ölçümleri çok sayıda için tutarlı, doğru ve yönetilebilir bir süreç sağlamaktır.

İlk olarak, bir eşik görüntü benzersiz olarak her görüntü için hesaplanan yoğunluk değerleri temel alınarak oluşturulur. Sonra daire nesne ve köklü daire Hough dönüştürme (CHT) algoritması ile arka plan arasındaki kontrast göre tespit edilir. Son olarak, tespit edilen hücre kapsül ve organları Merkezi koordinatları ve RADIUS boyutu göre eşleştirilir ve veri yönetilebilir elektronik tabloda kullanıcıya verilir.

Bu teknik avantajları basit ama önemli. İlk, çünkü bu hesaplamalar bir insan yerine bir algoritma tarafından gerçekleştirilir doğruluk ve güvenilirlik arttı. Doğruluğu veya güvenilirliği kaç örnekleri analiz edilir ne olursa olsun hiçbir düşüş vardır. İkinci olarak, bu yaklaşım potansiyel Standart prosedür Cryptococcus alanı yerine nerede kapsül ölçüm lab tarafından değişir mevcut durum için kurar. Üçüncü olarak, el ile kapsül ölçümler yavaş ve monoton göz önüne alındığında olduğuna göre otomasyon sırayla yüksek üretilen iş veri analizi ve giderek güçlü istatistik kolaylaştıran çok sayıda Maya hücreleri üzerinde hızlı ölçümler sağlar.

Bu tekniğin önemli sınırlamaları nasıl gelir algoritması işlevleri. İlk olarak, algoritma yalnızca daireler oluşturur. Cryptococcus hücreleri ve onların kapsül üzerinde dairesel bir Morfoloji alırken, Sigara-daire nesne algılama için bu tekniği uygulamak için zor olurdu. İkinci olarak, daire nasıl algılanır nedeniyle CHT algoritması büyük sözde çevrelerin birkaç kümelenmiş daire dış kenarlarına dayalı algılayabilir. Ancak, yanlış tanıtılmış hücre cesetler sahte daire içinde yakalanan kolayca algılanabilir ve elde edilen veri kümelerinden kaldırıldı.

Bu tekniği, çini mürekkebi parlak alan mikroskobu üzerinde dayalı Cryptococcus türlerin döngüsel polisakkarit kapsül ölçmek için içindir; için uygulanan olabilir rağmen diğer kontrast dairesel nesne ölçümleri dayalı.

Giriş

Cryptococcus neoformans ubiquitously insan hastalığında öncelikle baskılanmış nüfus ile ilişkili tüm dünyada bulunan patojen bir mayaymış. C. neoformans özellikle Sahra Güneyi Afrika bulaşıcı hastalık1nedeniyle toplam yıllık ölümlerin önemli bir çünkü hesapları. Önemli klinik cryptococcal enfeksiyon olarak enfekte makrofajlar (Truva atı şekilde) Ulaştırma merkezi sinir sistemi işgali aşağıdaki meningoensefalit tezahürüdür veya kan - beyin bariyerini doğrudan geçiş. C. neoformans insan vücudunun sıcaklığı, üreaz aktivitesi, melanization ve bir polisakkarit kapsül2oluşumu çoğaltmak için yeteneği dahil olmak üzere birkaç virülans faktörleri ifade eder. Polisakkarit kapsülü yinelenen glucuronoxylomannan ve glucoronoxylomannangalactan Polimerler ve işlevleri olarak çevresel stres ve ana makine bağışıklık yanıtı2gibi etkenlere karşı koruyucu bir bariyer oluşur.

Her ne kadar cryptococcal polisakkarit kapsül boyutunu sürekli virülans ile ilişkili olduğu değil, ortada bir kanıt Patogenez2,3,4,5bir faktör olduğunu, 6,7. Kapsül boyutu menenjit patoloji6ile ilişkilidir, makrofaj Cryptococcus enfeksiyon5kontrol yeteneğini etkileyebilir ve8Eğer yok virülans kaybına neden olabilir. Bu nedenle, kapsül boyutu ölçüm cryptococcal araştırmada yaygındır, ancak kapsül ölçüm yöntemi için standart yok fieldwide.

Şu anda, C. neoformans polisakkarit kapsül ölçüm mikroskobu görüntüleri manuel ölçüm üzerinde temel alır ve görüntü ve ölçüm satın alma tam yöntemleri laboratuar9,10değişir, 11. Bir anında bu yöntemin bazı çalışmalar Bakımı doğruluk ve güvenilirlik zorlaştırır binlerce bireysel ölçümlerin edinimi gerektiren konusudur. Ayrıca, hatta sonuçları yayımlandığında, orada kez yetersiz ölçüm yönteminin açıklaması olduğunu. Birçok yayın nasıl onların ölçümler elde edilmiştir, açıklamak değil ne odak düzlemi kullanıldı, nasıl onlar belirlediğini eşik kapsül kimlik için bir ölçüm kullanılan veya birkaç veya diğer ortalama RADIUS veya çapı, kullanılan Ayrıntılar. Onların yöntemi hangi programı olarak kullanıldı, bazı yayınlar tek devlet Örneğin, "Adobe Photoshop CS3 hücreleri ölçmek için kullanılan"11. Standardizasyon ve ayrıntılı raporlama bu eksikliği tekrarlanabilirlik imkansız olmasa zorlaştırabilir. İnsan görme, bilgisayar parlaklık, mikroskop ayarları, farklılıkları slayt aydınlatma ve pixel yoğunluk değerleri oranları üzerinde dayanan hesaplamalar sabit kalır, ancak diğer faktörler sadece bireyler arasında ama örnek arasında değişebilir ve örnek arasında uygulanabilir. Bu teknik içinde yoktu önce bir alan için kapsül boyutları ölçmek için bir standart, doğru hızlı ve basit teknik sağlama bağlamında oluşturuldu.

Daha önce belirtildiği gibi CHT algoritmasıdır köklü ve daireler otomatik olarak algılamak üzere komut dosyaları önce yazdım. Bu yöntem diğer komut dosyaları nerede kısa düşeceği iki alanda geliştirir. Cryptococcal hücreleri ile iki ayrı daire birbirimizi ile ilgili olarak algılanması gerekir çünkü ilk, sadece daireler algılama, yetmez. Bu yöntem özellikle hücre organları kapsül içinde algılar, ikisi arasında ayrımcılık ve yalnızca ilgili vücut-kapsül çiftleri üzerinde hesaplamalar gerçekleştirir. İkinci olarak, hatta ne zaman takip aynı iletişim kuralını, farklı araştırmacılar farklı sona erecek görüntüleri elde. Her algoritma parametresini araştırmacı denetime olanak sağlayarak, bu araç edinme yöntemleri çok çeşitli eşleşecek şekilde ayarlanabilir. Standart kapsamı, amaç, filtre ve benzeri için gerek yoktur.

Bu teknik, araştırmacı daireler bir görüntü içinde onların arka plan ile bu kontrast tespit gereken herhangi bir durum için kolayca uygulanabilir. Her iki daire açık ve koyu arka plan tespit edilebilir daha sayılır ve bu teknik kullanılarak ölçülür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. çini mürekkebi slayt hazırlanması

  1. Cryptococcal örnek bir slayda 10 µL pipet. Bu deneme için kullanılan tek zorlanma H99 oldu ama herhangi bir dairesel Maya zorlanma çalışacaktır.
    Not: doğrudan kültür ortamından örneğiyse, 1:2 PBS veya su ile sulandrarak çini mürekkebi topaklanma üzerinden önlemeye yardımcı olabilir.
  2. Hindistan mürekkep lekesi örnek üzerine 2 µL pipet ve fiziksel olarak pipet ucu örnek için bastırıyor ve çini mürekkebi düzgün dağıtılmış görünene kadar dairesel hareketlerle hareket ettirerek karıştırın.
  3. Bir coverslip örnek üzerinde coverslip sonra yavaşça ve eşit olarak örnek üzerinde coverslip karşı tarafına düşürücü slayt, yüzeye karşı sol kenarına basılı tutarak yerleştirin.
  4. Slayt hava kuru 5 min için izin.
  5. Yavaşça oje ışık tabakası bir mühür formu ve çini mürekkebi leke korumak için coverslip kenarlık uygulayın.

2. görüntüleme slayt

  1. Slaytlar bir fotoğraf makinesi eki ve bilinen piksel mikron dönüşüm parlak alan mikroskopla yerleştirin. Filtreler, amaçları ve kontrast hücre kapsül ve hücre organlarıdır odaklanmış, karanlık bantları net şekilde ayarlayın.
    Not: Çeşitli filtreler, amaçları ve kontrast ayarlarıyla çalışacaktır ancak bir 20 x amaç, Ph1 filtre ve 2 x 2 binning önerilir.
  2. Görüş alanı yoğun ama değil hücre kapsül arka plan arasında açık kontrastlı cryptococcal hücrelerle nüfuslu ve karanlık bir grup görüntülenmiştir hücre gövdeli düzgün odaklanmış olduğundan emin olun.
    Not: En iyi görüntü için tam sayısı örnek ve kullanılan objektif bağlı olarak değişir. Kümelenmiş veya örtüşen hücrelerdir değil emin olmak için önemli yönleridir, hücre odak uçaklar önemli ölçüde değişir değil ve önemli çini mürekkebi olduğunu açıkça (en az % 25 alanın) arka planda görünür leke.
  3. Ölçüm algoritması görüntüleri tek bir dizin içinde çalışır ve çıkış veri görüntü dosyalarının adlarını göre düzenlenecek açık başlıklar içeren tek bir dizin için görüntüleri kaydetmek.

3. algoritması kurulumu

  1. Python sürüm 2,7 üzerinden yüklemek
  2. Ek python kütüphaneleri "pip yüklemek yastık" komutlarını çalıştırarak ve "pip yükleyin openpyxl".
  3. MATLAB şu sayfadaki talimatları izleyerek yükleyin
  4. Yapı https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html sağlanan yönergeleri izleyerek MATLAB python Kütüphane.
  5. Bu el yazması'nın takıma giren malzemeler ("QCA.py", "Analysis2.m" ve "TestRun.m") üç gerekli dosyaları indirmek.
    Not: Bu dosyaları herhangi bir yere elde edilebilir, ama her üç aynı dizinde olması gerekir.

4. algoritma kullanımı

  1. Uygulamayı QCA.py üzerinde çift tıklayarak çalıştırın.
    Not: Uygulama başlatmak için birkaç dakika sürebilir. "QCA.py" dosyası gerçek algoritma çalıştırmak için "anladım" dosyaları çağıran program yapısı içerir.
  2. Programda anlatılan adımları izleyin.
    1. Görüntü dosyalarının uzantısı türü başına bir nokta koyarak ve noktalı virgüllerle ayrılmış Giriş (örn. ". TIF;. JPEG") sonra Enter düğmesini tıklatın.
    2. İçinde görüntü dosyaları Dizin Seç düğmesini tıklatarak ve görüntüleri içeren klasörü seçerek bulunduğu dizini seçin.
    3. Görüntü dosyaları listesini dizinde Resim listesi oluştur düğmesini tıklatarak oluşturun. Görüntüleri sağa metin kutusunda listelenir. Gözden geçirin ve listeden doğru ve eksiksiz olduğundan emin olun.
    4. Rasgele görüntü Seç düğmesini tıklatarak bir önizleme olarak kullanmak için listeden rastgele bir görüntü seçin.
      Not: bir "yanlış görüntü modu hata nedeniyle" açamıyor görüntüyse, algoritma hala görüntü görüntülenmiyor rağmen düzgün. 4.2.7 adımdan sonra sınama yansıması görüntülenmeye devam eder.
    5. Giriş mikroskop objektif ve ayarları binning. Varsayılan ayarları kullanılan mikroskop eşleşmiyorsa, "Özel piksel dönüşüm" seçin ve görüntü dosyaları için piksel-için-um dönüşüm giriş. Bir kez seçme, Dönüşüm hesapla düğmesini tıklatın ve dönüştürme metin kutusunun sağ göre doğru olduğundan emin olun.
      Not: şekil 1 ' de gösterilen temsili resim 40 x büyütme ve 2 x 2 seçili binning ile hesaplanır.
    6. Giriş daire algılama için algoritma parametreleri.
      1. Minimum ve maksimum yarıçapı tespit Min ve Max kapsül RADIUS giriş dış kapsül algılama için giriş. Küçük bir aralığı daha doğru sonuçlar sağlayacaktır.
      2. Minimum ve maksimum yarıçapı tespit hücre vücut algılama Min ve Max hücre vücut RADIUS giriş için giriş.
        Not: Bu girdilerin dört göre kaynak görüntüler ilgili değerlerini piksel cinsinden temsil eden sayılar olmalıdır.
      3. Duyarlılık eşik algoritma ayarlamak için kapsül ve hücre cisim hassasiyeti kaydırıcılarını hareket ettirin. Düşük duyarlılık sıkı olacak ve yanlış pozitif daire algılama azaltmaz, ama daha az gerçek daireler Ayrıca algılayabilir. Tersine, yüksek bir hassasiyet tespit oranı artacak ama yanlış pozitif çevrelerde de neden olabilir.
        Not: Temsilcisi sonuçları bir kapsül yarıçapında en az 7, 45 kapsül maksimum yarıçapı, en az vücut RADIUS 4, en fazla vücut RADIUS 30, 87 kapsül duyarlılık ve cisim hassasiyeti 87 ile elde edilmiştir.
    7. Parametreleri rasgele seçilen görüntü üzerinde Test çalışması düğmesini tıklatarak sınayın. Programın orijinal görüntü yerine, üst ortasında görüntülenir. Sonuçları doğru bakarsanız, bu da tüm seçilen görüntüler seçilen parametrelere uygun emin olmak denemek için ek rasgele görüntü seçmek için önerilir.
      1. Ceset sayısını en üst düzeye çıkarmak ve kapsül algılanır ve daireler doğru sığdırmak için görünür olup olmadığını kontrol edin. Tespit kapsül içinde ceset sayısı sağa metin kutusunda görüntülenir. Aksi takdirde, sonuçları doğru olana algoritma parametreleri değiştirmek.
        Not: Yalnızca görselleştirme ile yardımcı olmak için kalın renkli daireler vardır. Ölçüm için üretilen gerçek daireler HCT algoritması tarafından hesaplanan bir matematiksel eğrisi var.
    8. Algılama algoritması Başlar Analysis düğmesini tıklatarak görüntü dosyaları tüm dizin üzerinde çalıştırın. Her görüntü analiz edilecek ve tüm görüntüleri analiz programı "bitmiş" sağındaki metin kutusuna görüntülenir.
    9. Maç ve Temizleme düğmesini tıklatın. Bu tespit edilen hücre organları içinde bulundukları tespit edilen kapsül için maç ve gerçek kapsül RADIUS kapsül vücudundan çıkararak hesaplar.
      Not: algoritma Floresans algılamak için kullanılan veya bu adımı başka bir durum sadece bir daire olduğu tespit gereksizdir. Bunun yerine sırasıyla sadece mavi ya da sadece yeşil daireler için veri toplamak için Sadece çek organları veya Yalnızca çek kapsül düğmesini tıklatın. Kapsül veri alınır eğer sadece hücre vücut RADIUS değil düşülen gibi RADIUS hücre toplam RADIUS ile sevk edecektir olduğunu unutmamak gerekir.
    10. Tamamlanan Veri görüntü dizinindeki "CleanedOuput.csv" dosyasını bulun. Eğer sadece bir parça veri seçildi, dosyayı "CleanedBodies.csv" veya "CleanedCapsules.csv" etiketi olur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Görüntüleri ilk mikroskobu çini mürekkebi slayt bir kamera (şekil 1A) ile birleştiğinde bir parlak alan mikroskop kullanarak elde edilir. Hücreler ayrılmış ve görünümü, alan de hücreleri ve arka plan arasındaki kontrast oluşturmak için yeterli leke kullanın olarak bastırmak değil için yeterince düşük yoğunluklu olması önemlidir. İletişim kuralında belirtildiği gibi en iyi görüntü için tam sayısı örnek, mikroskop ve kullanılan amaç bağlı olara...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu tekniğin önemli adımlar çini mürekkebi slayt hazırlama ve mikroskop görüntüleri elde etme. Algoritma başarıyla çeşitli slayt ve görüntü teknikleri ile test ederken önerilen bir protokoldür bu el yazması açıklanmıştır. Polisakkarit kapsülü bu parçacıklar polisakkarit Fibriller ağ nüfuz için çok büyük olduğundan mürekkep parçacıklar dışlama kapsül etki alanından göre tespit edilmiştir. Çini Mürekkebi dışlama koyu arka plan üzerine bir daire sonuçlanır. Algoritma daireler üzerinde ne kadar iyi kendi arka plan ile kontras...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Anthony olan slaytlar ikinci insan yan yana karşılaştırma olarak kullanılan Bowen hem de Sabrina olan slaytlar bir üçüncü insan-yan yana ve ikinci mikroskop karşılaştırma olarak kullanılan Nolan kabul etmek istiyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hindistan MürekkepBecton, Dickinson ve Co.
Fisherbrand Superfrost Mikroskop SlaytlarıFisher Scientific12-550-14325x75x1
Fisherfinest Premium Kapak CamıFisher Scientific12-548-B22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear OjeSally HansenN/A109 görünmez
SAB MediaSigmaS3306
Cryptotoccus neoformansATCC208821H99 suşu
Olympus AX70 MikroskopOlympusAX70TRFDurduruldu ; Parlak Alan Mikroskobu
Qimaging Retiga 1300QimagingN/A Durduruldu; Kamera Mikroskobu Eklentisi
MATLABMathWorksN/A Enson sürüm önerilen
Python Programlama DiliPythonN/ASürüm 2 gerekli; 2.7 önerilen
Microsoft ExcelMicrosoftYokEn son sürüm önerilen
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)SigmaP3813
261194

Kaynaklar

  1. Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760(2014).
  3. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508(1985).
  4. Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007(2013).
  5. Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
  6. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  7. Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561(2012).
  8. García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
  9. Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
  10. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
  11. Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kriptokoksal Kaps l l mOtomatik Kaps l AnaliziCircle Hough D n mHindistan M rekkebi BoyamaH cre G vdesi TespitiPolisakkarit Kaps l AnaliziAyd nl k Alan MikroskopisiG r nt E iklemeKaps l G vdesi E le tirmeY ksek Verimli l m

İlgili makaleler