Yöntem makalesi

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

16.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56960

⸱

18 Aralık 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Infectious Disease, University of Michigan

Bu makalede

Özet

Bu iletişim kuralı insan bağırsak organoids floresan mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı aşağıdaki farmakolojik tedavide epitel bariyer geçirgenliği ölçümü açıklar ve cep mikroskobu canlı.

Özet

Biyopsi ile elde edilen veya pluripotent kök hücreler yönlendirilmiş farklılaşma yoluyla üretilen bağırsak dokuların 3D kültür gelişmeler bağırsak mukoza sofistike vitro modellerinde sonuçlandı. Ortaya çıkan bu model sistemleri yararlanarak araçlar ve teknikler 2D kültür sistemleri ve hayvanlar için geliştirilen uyum gerektirir. Burada, gerçek zamanlı olarak insan bağırsak organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçüm tekniği tarif. Bu mikroenjeksiyon fluorescently etiketli dextran ve görüntüleme epifluorescent filtre ile donatılmış bir ters mikroskop Tarih tarafından gerçekleştirilir. Bu teknik aynı zamanda yaklaşımlar Imaging sabit timepoint birlikte gerçek zamanlı bağırsak organoids bariyer geçirgenliği ölçümü insan bağırsak epitel dokusu, yüksek çözünürlüklü zamansal veri nesil kolaylaştırır. Farmakolojik ajanlar, bakteriyel ürünler veya toksinler veya canlı mikroorganizmalar maruz kalma takip epitel bariyer geçirgenliği ölçümü için kolayca uyarlanabilir bir protokoldür. Küçük değişikliklerle bu protokolü de bağırsak organoids mikroenjeksiyon genel bir astar olarak hizmet verebilir ve kullanıcılar bu protokolü mikroenjeksiyon aşağıdaki ek veya alternatif aşağı akım uygulamaları ile tamamlamak tercih edebilir.

Giriş

Bağırsak epitel besinler, H2O, iyonlar ve atık ürünler yönlü taşımacılığının diğer parçacıklar Lümen arasında Difüzyon-aracılı nonspesifik alışverişini en aza indirerek aracılık eder seçici bir bariyer oluşturur ve Mezenkimal doku veya kan kaynağı1,2. Bağırsak epitel bariyer nonspesifik geçirgenliği uzun oranı yansıtan sağlık ve hastalık3,4,5,6, bir anahtar işlev parametre kabul edilmiştir Difüzyon yolu ile paracellular alan epitel boyunca küçük moleküllerin. Epitel bariyer geçirgenliği ölçümü içinde yürütülen hayvan modelleri7 ve insan hasta8 ' de laktuloz sindirim yoluyla, gastrointestinal sistem ve sonraki koleksiyonu belirli hiçbir ışınlama sahip olduğu ve laktuloz konsantrasyonlarda periferik kan ölçümü. Alternatif alınan işaretleri fluorescently etiketli karbonhidratlar gibi bariyer fonksiyonunun da mevcut9,10vardır. Bu yaklaşım Transwell destekler11, daha fazla deneysel kontrol için izin verir, ancak aynı zamanda içinde vivo zavallı bir tahmin eleştirilmiştir basitleştirilmiş bir yaklaşım üzerinde yetiştirilen bağırsak epitel hücre kültürleri için adapte edilmiş geçirgenliği farklılaştırılmış epitel alt türlerini ve doku yapısı12yokluğu nedeniyle. Chambers'ı kullanarak yeni bir yaklaşım temsil ve epitel bariyer fonksiyonu tüm bağırsak mukoza ex vivo13' te ölçümü için izin verir. Bu tekniğin uygulanması sık doku kullanılabilirlik durumu13,ve14tarafından sınırlıdır. Böylece tekrarlanabilirlik ve işlem hacmi fizyolojik alaka ile dengeleyen yeni yöntemler gereklidir.

Vitro organogenesis son gelişmeler 3D doku kültürü model sistemleri kabulü karmaşık doku15,16,17 dinamikleri recapitulating için sofistike bir platform olarak yol açmıştır ,18,19,20,21,22,23. Özellikle, insan pluripotent kök hücre (hPSC) elde edilen insan bağırsak organoids (HIOs)19,24 konak-mikrobiyal etkileşim incelenmesi için bir tekrarlanabilir ve deneysel olarak uysal modeli sistem olarak çıkmıştır ve epitel bariyer dynamics25,26,27,28. Benzer şekilde, insan doku kaynaklı organoids (enteroids olarak da bilinir) bir basit biyopsi yordamla elde ve uysal bir sistem olarak insan fizyolojisi ve hastalık15,29,30eğitim için kullanılabilir. İnsan bağırsak organoids mikroenjeksiyon deneysel bileşikler25 teslimi için izin verir veya mikropların25,31,32,33 ' e apikal epitel yaşamak organoid Lümen yüzeyine. Leslie ve Huang vd. 25 son zamanlarda bakteriyel toksinler maruz takip dextran etiketli floresein isothiocyanate (FITC) ile microinjected HIOs bariyer geçirgenliği ölçmek için bu tekniği adapte.

Bu iletişim kuralı hPSC elde edilen HIOs ve floresan mikroskopi kullanarak doku kaynaklı HIOs epitel bariyer geçirgenliği ölçüm için bir kılavuz olarak hazırlanmıştır. Küçük değişiklikler ile o da HIOs mikroenjeksiyon deneysel bileşikler ile genel bir astar olarak hizmet verebilir. Kullanıcılar bu iletişim kuralı ek veya alternatif aşağı akım uygulamaları ile mikroenjeksiyon sonra ek.

Protokol

Normal, de-tanımlanan insan yetişkin bağırsak dokusu vefat eden organ bağış Michigan hayat hediye yoluyla elde edildi. İnsan ES hücre satırı H9 (NIH kayıt defteri #0062) WiCell Araştırma Enstitüsü'nden elde edilen. Bu çalışmada kullanılan tüm insan dokusu olmayan yaşam bağış elde edildi, de-tespit edildi ve Michigan Üniversitesi'nde IRB (iletişim kuralı # HUM00093465 ve HUM00105750) onayı ile yapılmıştır.

1. microinjector Kur

  1. Malzemeler tablomalzemeleri alın.
  2. Micromanipulator, diseksiyon kapsam ve ışık kaynağı Biyogüvenlik kabini yerleştirin. % 70 etanol veya diğer dezenfektan deneysel kullanım öncesinde mikroenjeksiyon Kur'a temiz. Mikroenjeksiyon ekipman zarar çamaşır suyu içeren Dezenfektanlar güneşe maruz kaçının.
    Not: Tam microinjector derleme örneği şekil 1' de gösterilen.
  3. Diseksiyon kapsamı göz parça Shield erişim bağlantı noktası üzerinden Biyogüvenlik kabini için kullanılabilir şekilde konumlandırın.
    1. Alternatif olarak, temiz bir Bank pozitif hava akış sistemi yerine bir biyogüvenlik mikroskop erişim noktaları ile kabine ile kullanın.
  4. Mikroskop üreticinin talimatlarına göre sağ tarafında micromanipulator montaj ve denetimleri kolayca ulaştı ve düzeltilmiş ayarlayın. Micromanipulator bir demir tarlasına monte veya aksi halde stabilize.
    Not: Solak kullanıcılar micromanipulator kessin kapsam soluna yerleştirmek isteyebilirsiniz.
  5. Micromanipulator kol micropipette sahibine dağ ve analog boru micropipette yuvasına takarak bağlayın.
  6. 10 mL cam şırınga steril mineral yağ ile yaklaşık 5-7 mL doldurun.
  7. Radarı kilit mekanizmasını kullanarak analog boru açık sonuna mineral yağ ile dolu 10 mL cam şırınga bağlayın. Cam şırınga micromanipulator karşısında diseksiyon kapsamı, soluna yerleştirin.
  8. Yavaşça madeni yağ tüp yoluyla bastırıyor şırınga, bunalıma girmek. Mineral yağ yaklaşık 10 damla micropipette tutucu ucundan Temizleme ve bir Petri kabına veya benzer gemi toplama ve atma.
    Not: Bu adım tüm hava boru üzerinden kaldırır ve her mikroenjeksiyon seanstan önce gerçekleştirilmelidir.

2. mikroenjeksiyon için hazırlık

  1. 24 h mikroenjeksiyon öncesinde:
    1. FITC dextran çözüm FITC dextran 2 mg/mL steril PBS veya serum fizyolojik bir konsantrasyon, yeniden askıya tarafından hazırlayın. Toplam hacmi hazırlamak > 250 µL.
      Not: FITC dextran daha yüksek veya düşük konsantrasyonlarda, sıra--dan yaklaşık kullanılabilir 0.1 - 10 mg/mL. Nehrin aşağısında görüntüleme uygulama uygun FITC-dextran konsantrasyonu ayarlayın.
    2. Kur organoid kültürler 4 veya 8 iyi cam odası slaytlar veya diğer kültür gemi için uygun live mikroskobu, ile ilâ 50 µL hücre matris çözümü içinde gömülü ve kültürlü EGF, kafa ve R-Spondin (ENR) büyüme faktörü medya 19 ' şey, başına 4-6 HIOs ,24. Organoids (yaklaşık 5 mm apart) tek bir mikroskobik alanda birden çok HIOs gerçek zamanlı görüntüleme analizi sırasında yakalama önlemek için eşit aralamak için dikkat ediniz. A complete guide için HIO kültür ve bakım için bkz: McCraken vd. 24.
      Not: Bu protokol kök hücre elde edilen HIOs kullanılarak geliştirilen ve temsilcisi sonuçları (aşağıya bakın) bu doku kültürü modeli kullanımını göstermektedir. Ancak, aynı iletişim kuralını kolayca doku kaynaklı bağırsak epitel organoids15,29için uyarlanmıştır. Doku kaynaklı HIOs genellikle PSC kaynaklı HIOs ve eksikliği destekleyici Mezenkimal demiri hücre yapısı15,29,'30küçüktür. Doku kaynaklı HIOs mikroenjeksiyon teknik yeteneği daha büyük bir ölçüde gerektirir ve deneyim. Hangi epitel bariyer geçirgenliği veri doku kaynaklı HIOs kullanılarak elde hPSC elde edilen HIOs ile ilişkilendirmek derecesi bilinmemektedir.
    3. Standart hücre kültür kuluçka 42 ° C ve % 5 CO2 mikroenjeksiyon öncesinde HIOs kuluçkaya.
  2. 30 dakika kala mikroenjeksiyon, Biyogüvenlik üzerinde kabine açın ve en uygun çalışma yüksekliği için cam kalkanı açın.
  3. Tüm gereksiz öğeleri Biyogüvenlik kabini kaldırmak. Ne zaman çalışma sınırlı alanlarda yığılmayı sızıntıları veya diğer kaza riskini artırır.
  4. Sprey ve çalışma yüzeyinin % 70 etanol veya diğer dezenfektan ile iyice temizleyin. Bir kağıt havlu kullanarak silin.
  5. Microinjector için bağlı cam şırınga madeni yağ düzeyini kontrol edin. Mineral yağ kalan az 3 mL ise, şırınga sökün ve Biyogüvenlik dolap, kabarcıklar tanıtımı önlemek için dikkatli olmak içinde doldurma. 7 mL den fazla doldurmayın.
  6. Diseksiyon kapsam aydınlatmak için lambayı açın. Mercek kişisel konfor için ayarlayın.
  7. Micromanipulator kessin kapsam sağına yerleştirin. Micromanipulator manyetik bir stand kullanarak bir demir plaka için güvenli. Manyetik stand micromanipulator konumunu ayarlamak ve manyetik stand açık'a ayarlayarak bir demir tarlasına standına güvenli kapalı konuma geçin.
  8. Microcapillary yükleme
    1. Bir tek 1 mm cam filaman üretici tarafından sağlanan saklama kabı al.
    2. Micropipette çektirme bakır Isıtma bobin Merkezi aracılığıyla cam filaman yerleştirin.
      Not: Micropipette çektirme hazırlanması için bir rehber için Şekil 2 bakın.
    3. Böylece bakır Isıtma bobin yaklaşık cam filaman ortasında filaman getirin. Bu çektirme her cam filaman iki kullanılabilir mikroenjeksiyon iğneler oluşturur sağlayacaktır.
    4. Kelepçeler üst sıkılaştırılması tarafından ilk olarak, cam filaman çentikli grove içinde kırılma önlemek için güvenli hale getirildiğinden emin kelepçe cam filament kullanarak güvenli.
    5. En fazla dikey konumuna çektirme kol alt kelepçe sıkma önce genişletir.
      Not: Bu adım gereklidir. Tam çektirme kol genişletmek için başarısızlık cam filaman iki bölümden düzensiz ayrılması sonucu.
    6. Isıtma ve mekanizma çekme ayarlarını denetleyin.
Isı #1 geçiş (990) seçin ve çekme, 059 (Şekil 2) ayarlayın.
  • On/Off geçiş kullanarak araç üzerinde açın.
  • Koruyucu pleksiglas kalkan kapatın ve çektirme alt sağ yüzünde çekme düğmesine basın. Bakır bobin ısı başlayacak ve parlak turuncu kızdırma. Sıcaklık yükselir, cam filaman germek ve sonunda ayrı başlayacak. Cam filaman iki ucunun ayrılması, araç aşağı güç.
    Not: Bakır bobin birkaç dakika için son derece sıcak kalır. Çekti cam filaman bir 'microcapillary' iletişim kuralı bu aşamadan itibaren sevk edilecek.
  • Bakır bobin dokunmaktan kaçının, cam microcapillaries birini kaldırmak için dikkatli olmak. Microcapillary çok iyi bir nokta olmalıdır. Microcapillary lateks veya nitril eldiven ile dikkatli bir şekilde ele ve hemen microinjector kurulum içeren Biyogüvenlik kabini devam edin.
    Not: Cam microcapillary son derece keskin ve çok kırılgan. Özenle hallederim.
  • Micromanipulator kolunun son kapağı gevşetin. Künt çekti microcapillary sonuna micropipette sahibi açık uçlu yerleştirin ve durur kadar içe doğru itin.
  • Microcapillary micromanipulator kolu künt sonu son kapağı yeniden sıkılaştırılması tarafından güvenli.
    Not: microcapillary mikroenjeksiyon sistemde yüklerken keskinleşmiş sonunda dokunmaktan kaçının için özen gösterin. Bu bulaşma olasılığını azaltmak ve mikroenjeksiyon için iyi noktası korumak. Doğru microcapillary güvenli için hata istikrarsızlık veya cam filaman kırılma mikroenjeksiyon sırasında neden olabilir.
  • Cam microcapillary ucu açık. Çekti cam microcapillary hazırlanması sırasında uç noktasının büyük olasılıkla böyle bir şekilde sivri sonuna microcapillary mühür eriyecek. Bu blokajı kaldırmak için:
    1. Öyle ki microcapillary aşağı diseksiyon kapsam cam aşamasında bu yüzey dokunmadan verilir micromanipulator getirin.
    2. Steril plastik yüzey bulmak (kültür plaka kapak alt inşaat mükemmel) ve parçalanmış kapsam sahnesinde microcapillary iğne doğrudan altında mikroskop sahnede yerini.
    3. Görünüm alanının altında microcapillary ucu ortalayın ve o ne zaman altında 1,5 X büyütme mikroskop mercek ile seyir görünür olduğundan emin olun.
    4. Micromanipulator denetimleri kullanarak, yavaş yavaş micromanipulator kol ve microcapillary steril plastik kültür kapak doğru bağlantı ucu çok az plastik yüzey kurar ve microcapillary ucu ücretsiz tatili kadar ilerlemek.
      Not: cam filaman sıvı akış sırasında mikroenjeksiyon HIO hasarı en aza indirmek için olanak sağlar en küçük olası mola için nişan al.
    5. Devam etmeden önce kazara kırılması riskini en aza indirmek için steril yüzey uzak microcapillary geri.
    6. Microcapillary akışı için mineral yağ tüp yoluyla bastırıyor cam şırınga iç karartıcı tarafından kontrol edin. Microcapillary sonu açıldıysa sen-ecek görmek microcapillary uç--dan birkaç saniye sonra ortaya küçük damlacık mineral yağı. Bu oluşmaz, önceki adımı ve yeniden test işlemini yineleyin.

    • 3. steril mikroenjeksiyon

    Not: microcapillary hazırlanmış, yüklü ve test edilmiş bir kez microinjecting HIOs başlar. Şekil 3 başarıyla enjekte edilmiş doku kaynaklı HIO FITC dextran ile gösterilmektedir.

    1. Microcapillary enjeksiyon malzeme ile doldurun. Cam microcapillary microcapillary karşı tarafın veya tüp alt ucu bozulmaması için dikkatli olmak FITC dextran enjeksiyon süspansiyon ucu daldırın. Bir kez microcapillary ucu çözümde batık, yaklaşık 10 µL FITC dextran süspansiyon microcapillary çekmek için mineral yağ şırınga üzerinde geri çek.
      Not: 1,5 mL veya 0.5 mL tüpler bunlar-ecek var olmak yüklü microcapillary en kolay erişilmesini enjeksiyon çözümleri/kültürleri için kullanmadan önce önerilir. Alternatif olarak, bir steril Petri kabına veya bir tüp içinde tutmak gerek sınırlayarak "Sharps" yaralanma olasılığını azaltabilir steril parafilm çözümleri çizilebilir enjeksiyon microcapillary yakınlığı kapatın. Süspansiyon çok viskoz ise veya microcapillary açılışı son derece küçük ise, ikinci microcapillary doldurmak için birkaç sürebilir. Bu tüm mikroenjeksiyon sistem kontamine gibi mikroenjeksiyon süspansiyonlar plastik mikroenjeksiyon boru içine çekiyor mu.
    2. Mikroenjeksiyon süspansiyon cam microcapillary uzunluğu % 90'ı doldurduğunda microcapillary doldurma durdurmak. Şırınga biraz microcapillary microcapillary ucu hava cepleri içermediğinden emin olmak için mikroenjeksiyon eriyik--dan çekilmesi önce bunalıma girmek.
      Not: microcapillary incelenmesi hava cepleri ortaya koyarsa, boş ve yeniden doldurun.
    3. HIO kültür plate(s) hücre kültür kuluçka ve transfer Biyogüvenlik kabini ile microinjector çıkarın.
    4. HIO kültür plaka Biyogüvenlik kabini içinde kapağı kaldırmak ve böylece en düşük fiyat büyütme ayarı kapsamında mercek ile açıkça görülebilir ilk şey mikroskop sahnede Merkezi.
    5. Öyle ki microcapillary de belirli bir açıyla HIO kültür içine aşağı verilir micromanipulator kol açmak > mikroskop sahne göre 45°. Bu en kolay el ile iyi denetimleri (siyah aramalar) sınırlı bir dizi olduğundan yatay micromanipulator kol destek dikey stand buluştuğu noktada yatay ekseni micromanipulator kol derleme açarak gerçekleştirilir hareket. Yukarıda ilk kültür microcapillary ucu de yaklaşık 1 cm medya (şekil 3A) yüzey üzerinde konumlandırın. Bağırsak epitel organoids doku kaynaklı mikroenjeksiyon gösteren bir temsili resim şekil 3B' gösterilir.
    6. Her iki ucu cam filament ve HIO(s) mercek görünür olduğundan emin olun. Gerekirse yeniden konumlandırın.
    7. Microcapillary yavaş yavaş z ekseni kontrol düğmesi saat yönünde çevirerek ilerlemek.
      Not: microcapillary uç konumuna bakılırsa, özellikle derinlik, pratik gerektirir. İpucu medya yüzeyine ihlal, microcapillary ucunu hafif bir görsel bozulma fark.
    Bakım ile alt kültür plaka karşı microcapillary kırılma veya HIOs zarar önlemek için bu noktadan devam edin.
  • Microcapillary ucu HIO pierce. Microcapillary basınç uygulamak başlar ve ucu Lümen nüfuz olarak yeniden forma açılır gibi HIO dış yüzeyi biraz bunalıma girmek. HIO Lümen içinde microcapillary ucu belirlemek güç olabilir. Zorluk microcapillary görmek ise parçalanmış kapsam aydınlatma veya büyütme ayarlarını değiştirmek.
  • Microcapillary microcapillary HIO merkezine yakın ucu ile doğru şekilde konumlandırıldığında eller micromanipulator denetimler kaldırın.
  • Biraz mikroenjeksiyon çözüm microcapillary ve HIO Lümen içine itmek için mineral yağ şırınga düşürmek. HIO biraz enjeksiyon hacmi karşılamak için genişletmek.
    Not: Bu organoid patlamaya neden olur gibi HIO aşırı dolum önlemek için dikkat ediniz. Kural olarak durdurmak için zamanı HIO birim görünür herhangi bir genişleme anlamına gelir. Olgun HIO Lümen ortalama hacmi yaklaşık 1 µL, ancak önemli ölçüde değişebilir. Otomatik şırınga pompa yerine el ile bir şırınga enjekte ses daha iyi denetim için izin vermek için kullanılabilir.
  • Microcapillary z ekseni denetim ve medya yüzey yukarıda konumu kullanarak HIO geri alıyorum.
  • Kaza sonucu hasar vermemek için kartı HIOs manevra sırasında ve benzer bir şekilde enjekte medya yukarıda konumlandırılmış microcapillary ile sonraki HIO hedefe taşımak (bkz: adımlar 3.6-3.11).
    1. Yukarıda açıklanan yaklaşım kullanarak microcapillary tekrar doldur.
      Not: ucu mikroenjeksiyon sırasında herhangi bir noktada kırılırsa, enjeksiyon devam etmek çalışmayın. İpucu aşağıdaki talimatlara göre değiştirin.
  • Microcapillary tedaviler arasında veya kırılması durumunda değiştirin. Kelepçe micromanipulator kolun ucunda gevşetin ve microcapillary micropipette sahibinden kaldırın.
    Dikkat: microcapillary keskin sonuna yakın işleyemez. Microcapillary para cezası nokta son derece keskin ve kolayca eldiven ve cilt delik. Dikkatli olun ve tüm hareketleri, sadece ve asla el microcapillary noktasıyla HIO kültürler arasındaki yerleştirerek manipülatör kullanarak microcapillary işleme unutmayın. Enfeksiyöz ajanlar veya toksin içeren bir microcapillary bir iğne sopa durumunda hemen tıbbi tedavi ararlar.
    Not: bazı durumlarda, görsel olarak başarılı HIO mikroenjeksiyon onaylamak zor olabilir. Açık mikroenjeksiyon süspansiyonlar görünürlüğünü FITC dextran daha yüksek konsantrasyonlarda ilavesi kullanımı ile gelişmiş olabilir.

    • 4. farmakolojik tedavi HIOs

    1. Apikal epitel teslim bileşikler sınamak için 2 mg/mL FITC dextran içeren steril PBS resuspend ve (Bölüm 3) belirtildiği şekilde HIO Lümen içine microinject. Temsilcisi deneme için Clostridium difficile toksin TcdA 12,8 ng/µL adlı PBS FITC dextran içeren resuspend.
    2. Demiri bölmenin teslim bileşikler sınamak için 2 mM etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, içeren yeni medya ile N, N dış kültür ortamı değiştirin ', N'-tetraacetic asit (EGTA)(positive control), PBS araç yalnız (negatif kontrol ), ya da diğer deneysel bileşik FITC dextran mikroenjeksiyon sonra.
      Not: Dozaj ve uygulama farmakolojik bileşikleri, toksinler veya diğer ajanlar zamanlama deneysel soru göre değişebilir.

    5. Microinjected Organoids Imaging canlı

    1. Canlı görüntüleme hemen aşağıdaki mikroenjeksiyon başlar. Kültür plakaları 37 ° C ve % 21 O2 ve %5 CO2 otomatik bir canlı hücresi görüntüleme sistemi ile tutulan bir oksijen odası ile donatılmış floresan mikroskop aktarın. Çevre odası kapatın ve görüntüleme işlemini başlatın.
    2. Görüntü analiz yazılımı (örneğin, softWoRx) masaüstünden Başlat. "Dosya" ve "görüntüleme ve mikroskop kontrol yazılımı başlatmak için al (çözmek 3D)" seçin.
    3. Uyarma/emisyon FITC için ayarla (475 nm uyarma/523 nm emisyon), % 5 ve 4 X lens •Aktarım gücünü ayarla. Pozlama süresi 0.025 ms (şekil 4A) ayarlayın.
      Not: Floresan sinyal gücünü uygun pozlama süresi farklı olabilir. Genel olarak, FITC Floresans sinyal sadece azalacak. Kaydedilen floresan sinyal sadece doygunluk noktasına kamera ve düşsel bilgisayar yazılımı öyle ki bu nedenle, maksimum hassasiyet sağlamak için ilk pozlama süreleri ayarlanmalıdır.
    4. HIOs dijital denetleyici için mikroskop takılı kullanarak 4 X büyütme bulmak. HIO görüntüleme alanı (şekil 4A) içinde ortalayın.
    5. "Görünüm" araç çubuğunda tıklatın ve "liste gelin" seçin yeni bir pencereyi göstermek için. "Nokta işareti" tıklatın noktası listesi (şekil 4A) sahne alanı geçerli konumunu depolamak için.
    6. Tüm HIOs konumlarını kaydetmiş olduğunuz 5.4 ve 5.5 tamamlayana dek. Bir not defteri veya dijital kayıt kullanarak, her programlanmış mikroskobu pozisyon ve o konumda yakalanan görüntüleri atanmış benzersiz kimlik numarasını not alın. Görüntü dosyaları bu kimlik numarası ile öğesini ve veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra resmi kimlik numaraları belirli HIOs ve tedavileri ile ilişkilendirmek önemli olacaktır.
    7. Otomatik resim koleksiyonu kurulum için "Dosya" ve sonra "Deney" araç çubuğunda tıklatın. Adı Tarih veya başka bir benzersiz adı ile deneme.
    8. Sekmelerin her birinde seçeneği ile şekil 4B' gösterildiği gibi giderek resim koleksiyonu için parametreleri ayarlayın.
      1. Un-kontrol "Z kesit" sekmesi altında "Kesit".
      2. "Kanallar" sekmesi altında üst sol "çözümleme 3D" penceresinden parametrelerini girin. Zaman kazanmak için ilk satır içinde soldaki kutu işaretlendiğinde otomatik olarak yerleştirilecektir.
      3. Sekmesi altında ' hızlandırılmış ","zaman atlamalı"etiketli kutuyu işaretleyin ve"Hızlandırılmış"ve"Toplam süre"başlıklı satırda denemeye toplam süresi başlıklı satırda Albümdeki arasındaki zaman aralığını girin. Yazılım otomatik olarak zaman puan sayısını hesaplar.
      4. "Puan" sekmesi altında "Ziyaret noktası listesi" etiketli kutuyu işaretleyin.
    Metin kutusuna yazarak denemeye dahil edilecek belirli nokta numaraları el ile de girebilirsiniz.
  • Belgili tanımlık tabs "Panelleri" veya "Eylemler" altındaki varsayılan seçenekleri değiştirmeyin.
  • "Çalıştır" sekmesini girin kutusunda denemenin tarihi tıklayın "resim dosyası adı" etiketli ve koymak belgili tanımlık veri kaydetme konumu "Ayarlar" altında.
  • Deneyi makroyu çalıştırmak için yeşil oku tıklatın. Zaman atlamalı sayacı deneysel ilerlemeyi izlemek.
  • Planlanan zaman ders sonunda verin ve tüm resim dosyalarını 24 bit RGB TIFF görüntüleri (şekil 4 c) kaydedin.
    1. Araç çubuğunda, görev Oluşturucu tarafından takip işlemi seçin.
    2. Görev Oluşturucu menüsü 5.9 içinde belirtilen veri klasörü giderek dosyaları ekleyin. ".Dv"-e sevketmek içinde "*.dv" yazarak biten tüm dosyaları vurgulayın. Tüm (Ctl + A) seçin ve "Ekle".
    3. + Altında "Görev." etiketli bölüm tıklayın "Export as.." seçin ve "Seçenekler" sekmesini tıklatın.
    4. "Verme biçimi" "TIFF görüntüleri" için ayarlamak ve bir "özel çıkış klasörü" eklemek için aşağıdaki kutuyu işaretleyin. Nerede TIFF görüntüleri dışa aktarılır yer burası. 24 bit RGB altında "TIFF çıktı türü" seçin ve "Bitti"'yi tıklatın.
    5. "Göndermek için verme makro çalıştırmak için sıra"'i tıklatın.
  • Sonrası görüntüleme analizi (Bölüm 6) sahne alacak eğer harici bir sürücü veya bir sunucuya 5.11 içinde dışa aktarılan TIFF görüntüleri farklı bir bilgisayara kopyalayın.
    Not: HIO doku ve medya Histoloji34için PCR35depolanabilir), Batı36veya diğer aşağı akım analizi leke.

    • 6. sonrası görüntüleme analizi

    1. ImageJ37 yüklü olduğundan emin olun ve çözümleme için kullanılacak bilgisayar üzerinde çalışır.
      Not: Fiji37 -ecek iş ImageJ çekirdek program alternatif bir dağılım şudur: Bu çözümleme için eşit derecede iyi.
    2. Toplu iş çözümlemesi "Süreci" sonra "Toplu" ve nihayet "Makro" ImageJ menüsünden seçerek başlayın.
    3. Deneysel saat boyunca toplanan TIFF görüntüleri içeren dizin girişe ayarlayın. "Thesholdmeasure.ijm" ImageJ makro dosyasını açın veya doğrudan Kopyala/makro kodunu cama Yapıştır. "İşlemi dosyaları işleme başlamak için"'ı tıklatın.
      Not: Minimum eşik değeri x (setThreshold(x,255);) ayarla herhangi bir sayı 0 - 255 ve arka plan Floresans ortadan kaldırmak için ayarlanmalıdır. Değerleri < 100 tavsiye edilir. Ampirik olarak uygun eşik değeri belirlemek için bir organoid floresan sinyal temsil eden tek bir görüntüyü görüntüleme makro çalıştırın. Bu görüntü ortalama yoğunluğu uygun eşik ayarlamak için bir rehber olarak hizmet verebilir. Aşağıda sunulan temsilcisi analizi için eşik "42" kuruldu.
    4. ImageJ eşik yoğunluk aralığı içinde tüm piksellerin alanını içeren büyük bir tablo üretecek ve ortalama, medyan, minimum ve maksimum (sınır) yoğunluk eşik şiddeti sınırları içinde alan için değer. Bu bir CSV veya XLS olarak kaydedin.
    5. Aşağıdaki hesaplama yapmak için veri tablosu işleyerek bir elektronik tablo39 yoğunluğu zaman içinde değişiklik hesaplanabilir veya otomatik bir uygun kullanarak dili programlama. R 40 içinde yazılmış bir örnek analysis komut dosyası bu el yazması ile sağlanır.
      Not: her HIO için göreli floresan yoğunluğu olarak sayısal figure-protocol-1 . Eleme saat 41 (t1/2) FITC dextran HIO Lümen içinde aşağıdaki gibi hesaplanır:
      1. İlk olarak, "alan" eğri altındaki hesaplar (AUC) Zaman (t) içinde tanımlayan göreli floresan yoğunluğu eğrisi üzerinden:
        figure-protocol-2
      2. Sonra "izni" hesaplamak (figure-protocol-3) t normalleştirilmiş floresan için 1 olarak tanımlanmış Kur dağıtım (Vd) hacmi ile = 0:
        figure-protocol-4
      3. Daha sonra "eleme oranı sabit" tanımlayın (figure-protocol-5) olarak:
        figure-protocol-6
      4. Ve son olarak, "eleme zaman" hesaplamak (t1/2) olarak:
        figure-protocol-7
        Böylece azaltılmış denklemdir:
        figure-protocol-8

    Sonuçlar

    HIOs insan pluripotent kök hücreleri ayrıştırılan ve hücre matris çözüm olarak daha önce açıklanan19,24kültürlü. Kültür 4 hafta sonra HIOs mikroenjeksiyon için izin vermek için yeterince genişletti. HIOs 4 kDa FITC Birleşik dextran PBS veya Clostridium difficile toksin TcdA içeren PBS askıya ile microinjected. C. difficile HIOs25epitel toksisite toksin-aracılı sergileyen bir fırsatçı gastrointestinal hastalık var. Pozitif kontrol, EGTA bir alt kümesini PBS ve FITC dextran ile enjekte HIOs HIO kültür medyada eklenmiştir. EGTA hızlı de-polimerizasyon aktin sitoiskeleti42neden olur bir kalsiyum şelatör var. FITC Floresans gerçek zamanlı canlı görüntüleme mikroskop içinde kontrollü bir çevre odası olarak izlenmeli ve görüntüleri 10 dakikalık aralıklarla ele geçirildi.

    Görüntüleme veri Post-hoc çözümlemesi FITC floresan (şekil 5) tutma önemli farklılıkları ortaya koydu. PBS ile enjekte HIOs muhafaza neredeyse tüm floresan sinyal t mevcut Ayrıca TcdA ile EGTA ile tedavi enjekte edildi HIOs 8 saat sonrası mikroenjeksiyon (şekil floresan yoğunluğu önemli bir düşüş sergiledi ancak = 0, 5A). görüntüleme veri göreceli değişiklik floresan yoğunluğu zamanla deneysel her durumda (şekil 5B) temsil eden yüksek çözünürlüklü bir veri kümesi oluşturmak tüm HIOs tüm zaman noktalarda için sayısal. Epitel geçirgenliği farklılıkları her tedavi grubu (Tablo 1) FITC (t1/2 ) ortalama eliminasyon zaman hesaplama ve t t1/2 gruplar arasındaki farkları karşılaştırarak değerlendirildi kullanarak öğrenci t-test. Denetimi değerlendirilmesi HIOs muhafaza FITC floresan sinyal 16 saatten fazla çoğunluğu (t1/2 = 17 ± 0,3 h). EGTA ile tedavi azaltılacağını FITC dextran eleme zaman denetime HIOs göre (t1/2 = 2.6 ± 0.2 h; P = 1.3 x 10-8). Daha önce yayımlanmış sonuçları25ile tutarlı, TcdA mikroenjeksiyon önemli ölçüde epitel bariyer geçirgenliği kontrol tedavi göre artar (t1/2 = 7,6 ± 0.6 h; P = 5.4 x 10-4). Böylece, dış (EGTA) ve microinjected (TcdA) bileşikleri HIOs epitel bariyer geçirgenliği içinde önemli değişiklikler inducing yeteneğine sahiptirler. Bu sonuçlar epitel bariyer fonksiyonu çok çeşitli farmakolojik ajanlar, metabolitleri, bakteriyel ürünleri, sitokinler, büyüme faktörleri ve diğer bileşikler etkileri bu yaklaşımı kullanarak değerlendirilecek öneririz.

    TedaviHalf-Life (h)SEM (h)% 95 CI (h) indir

    figure-results-1

    figure-results-2

    figure-results-3

    figure-results-4

    figure-results-5

    Tartışma

    Bu protokol, gerçek zamanlı olarak hPSC elde edilen HIOs ve bağırsak organoids doku kaynaklı mikroenjeksiyon ve epitel bariyer geçirgenliği ölçümü için genel amaçlı bir yöntem oluşturur. Biz de analiz ve bu yöntemleri kullanan oluşturulan verilerin yorumlanması bizim yaklaşım göstermiştir. Bağırsak organoids büyüyen kabulü model sistemleri verilen16,20,21,28 ve fonksiyonel bağırsak bariyer geçirgenliği gibi fizyolojik ilgili uzun süredir ilgi sonuç3,4,5,6, biz diğerleri bu alanda çalışan uygulamak ve bu yöntemler kurmak mümkün olacak tahmin.

    Bu teknik uygulama için kritik olan birkaç adım vardır. Yüksek kalite hPSC - veya türetilmiş HIO doku mikroenjeksiyon ile kapsamlı deneme önce kurulmalıdır doku erişim. Doku kimlik ve hücresel Morfoloji olmasına rağmen son derece tekrarlanabilir HIOs24üretmek için kurulan metodoloji kullanan zaman HIO macrostructure hànzú, her iki boyutu ve şekli, varyasyon ile olabilir. Tek bir yarı saydam Lümen oluşan ve yaklaşık 1 mm çapında ölçme küresel HIOs mikroenjeksiyon ve gerçek zamanlı olarak luminal Floresans ölçümü için idealdir. Bazı durumlarda, mikroenjeksiyon, HIO çöküşü enjekte malzeme açık kaçağı sonuçlanabilecek başarısız olur. Başarısız HIOs-ebilmek var olmak çıkarmak ile kültür de kullanıcının isteği doğrultusunda standart bir micropipette kullanarak. Objektif lensler bir görüntüleme platformu üzerinde kullanılabilir HIOs mikroenjeksiyon ve görüntüleme için seçerken göz önünde bulundurun. 10 X amaç düşük güç lensler kullanılabilir değilse veya mevcut HIOs varsa kullanılabilir, ancak genel olarak, 2-4 X objektif lens tam HIO floresan sinyal yakalamak için idealdir < 1 mm çapında. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı için tanımlanmış noktalarda floresan görüntülerin otomatik yakalama zaman içinde izin vermeniz gerekir.

    Bu protokol birçok değişikliği deneysel gereksinimlerine uymak için mümkündür. Örneğin, bariyer fonksiyonu testlerinin sonuçlarını kullanım43 bileşiklerin moleküler boyutu bağımlı olabilir ve değişen molekül ağırlığı dextran hazırlıkları test etmek uygun olabilir. Buna ek olarak, aydınlık alan görüntüleme Floresans görüntüleme doku25genel olarak yapısal bütünlüğünü bir göstergesi olarak ek olarak gerçekleştirilebilir. Canlı bakteri25,28,31,32,33,44mikroenjeksiyon işlemi sırasında penisilin eklemek gerekli olabilir ve streptomisin veya gentamisin önce veya sonra mikroenjeksiyon HIO kültür medyaya. Microcapillary dışına doldurma ile bakteri kültürü Süspansiyon sırasında kontamine ve bu HIO medyaya devredilebilir. Alternatif olarak, mikroenjeksiyon mikroenjeksiyon tamamlandıktan sonra medya ekleme medya, hücre dışı Matriks (örneğin, Matrigel) askıya HIOs üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu kirlenme hücre dışı matriks ve dış yüzü HIO sınırlayabilir. Mikrobiyal büyüme deneyleri planlarken, antibiyotik medyada yavaşlama veya microinjected organizmaların büyümesini engelleyerek önlemek için 1-2 h sonra kaldırmak gerekli olabilir.

    Son olarak, tüm araştırmacılar mikroskobu ekipman vitro görüntüleme için uygun erişimi kabul ederek, Floresans veri toplamak için bu protokolü bölümünde özetlenen yordamlar çekilen görüntülere uygulanabilir işaret etmek önemlidir otomatik görüntü yakalama veya çevresel kontroller standart epifluorescent mikroskobu kullanarak sabit timepoints. Bu yaklaşımın örnekleri raporlarda Leslie ve Huang vd tarafından bulunabilir C. difficile toksin aktivite bağırsak organoids hPSC elde edilen Karve ve Pradan ve ark. , muayene 25, epitel bariyer geçirgenliği ile canlı E. colimicroinjected benzer hPSC elde edilen bağırsak organoids içinde muayene 44. Ekipman görüntüleme el ile işlem daha fazla değişim ve floresan sinyal normalize zorluk neden olabilir. El ile görüntüleme FITC dextran performans HIOs enjekte edildiğinde sabit büyütme, floresan uyarma yoğunluğu ve pozlama süreleri floresan yoğunluk ölçümleri bozan önlemek için deney boyunca korumak için önemlidir.

    Açıklamalar

    Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları ifşa etmek var.

    Teşekkürler

    Yazarlar Drs. Stephanie Spohn ve Basel Abuaita organoid mikroenjeksiyon birçok yararlı tartışmalar için teşekkür etmek istiyorum. Solumasını bağırsak kök hücre Konsorsiyumu (U01DK103141), diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim ve böbrek hastalıkları (NIDDK) ve Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar (NIAID) tarafından finanse edilen bir ortak araştırma projesi tarafından desteklenir. Solumasını ve VBY NIAID roman, alternatif Model sistemleri için enterik hastalıklar (NAMSED) Konsorsiyumu (U19AI116482) tarafından desteklenmektedir. DRH desteklenmektedir mikrobiyal Patogenez mekanizmaları eğitim hibe Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları (NIAID, T32AI007528) ve klinik ve çevirim Bilim Ödülü Michigan Enstitüsü Klinik ve sağlık için Araştırma (UL1TR000433).

    Tam veri dosyaları ve bu el yazması kullanılan veri analizi kodu https://github.com/hilldr/HIO_microinjection mevcuttur.

    Malzemeler

    Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
    AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
    EGTA 0.5 M steril (pH 8.0)Bioworld405200081
    Hücre matris çözeltisi (Matrigel)Corning354230
    Deltavision RT canlı hücre görüntüleme sistemiGE Yaşam Bilimleri29065728http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
    KameralıGE Yaşam Bilimleri29065728Deltavision sistemine dahildir
    softWoRx Görüntüleme yazılımıGE Yaşam Bilimleri29065728Deltavision sistemine dahildir
    Biyogüvenlik kabiniLabconcoCell Logic+http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
    1X PBSYaşam Teknolojileri10010-023
    Gelişmiş DMEM-F12Life Teknolojiler12634-010ENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24
    >B27 eki (50X)Life Technologies17504044ENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24
    L-glutamin (100X)Life Technologies25030-081ENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24
    HEPES tamponuYaşam Teknolojileri15630080ENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24
    ManipülatörNarshgeUM-3C
    MikromanipülatörNarshgeUM-1PF
    Pipet TutucuNarshgeUP-1Xenoworks pipet tutucuya alternatif
    Manyetik standNarshgeGJ-1
    Diseksiyon dürbünüOlympusSX61Önerilen dürbün, ancak diğer modeller muhtemelen uyumludur
    Olympus IX71 Floresan mikroskopOlympusIX71Deltavision sistemine dahildir
    CoolSNAP HQ2Fotometri29065728Deltavision sistemine dahildir
    Rekombinant C. difficile Toksin A/TcdA Proteini R& D Sistemleri8619-GT-020
    EGFAr-Ge D Systems236-EGENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24
    >R-spondin 1R& D Systems4645-RSENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24
    NogginR& D Systems6057-NGENR ortamının bileşeni; bakınız McCraken et al. 24
    Mineral yağSigma-AldrichM8410
    FITC-dextran (4 kDa)Sigma-Aldrich46944
    Mikropipet çektirmeSutter AletleriP-30
    Nunc Lab-Tek II Hazne KızaklarıThermoFisher Scientific154526PK
    Cam filamentlerWPITW100F-4
    Mikropipet tutucuXenoworksBR-MH2Tercih edilen cihaz
    Analog Boru kitiXenoworksBR-AT
    1/16 şeffaf yüksüklüXenoworks
    1-1,2 mm O-ringXenoworksV300450
    V001104

    Kaynaklar

    1. Standring, S., Borley, N. Gray's anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , Churchill Livingstone/Elsevier. (2008).
    2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).
    3. Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest. 84, 282-291 (2004).
    4. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
    5. Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterol. 14, 189(2014).
    6. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target? Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).
    7. Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat. Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).
    8. Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. Intestinal permeability tests in coeliac disease. Clin Lab. 47, 143-150 (2001).
    9. Salles Teixeira, T. F., et al. Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls. Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).
    10. Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).
    11. Donato, R. P., et al. Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells. Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).
    12. Balimane, P. V., Chong, S. Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique. Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).
    13. Vidyasagar, S., MacGregor, G. Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability. Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).
    14. Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).
    15. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
    16. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
    17. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).
    18. Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids. Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).
    19. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
    20. Aurora, M., Spence, J. R. HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue. Dev Biol. 420, 230-238 (2016).
    21. Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).
    22. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
    23. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).
    24. McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).
    25. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
    26. Leslie, J. L., Young, V. B. A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions. Anaerobe. 37, 25-28 (2016).
    27. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).
    28. Hill, D. R., Spence, J. R. Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).
    29. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).
    30. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
    31. Engevik, M. A., et al. Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).
    32. Forbester, J. L., et al. Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells. Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).
    33. Engevik, M. A., et al. Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).
    34. Bancroft, J., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. , Churchill Livingstone. (2008).
    35. Kennedy, S., Oswald, N. PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
    36. Kurien, B., Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
    37. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
    38. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
    39. Winston, W. Microsoft excel data analysis and business modeling. , Pearson Education. (2016).
    40. R Core Team. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2017).
    41. Rosenbaum, S. Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , Wiley. (2016).
    42. Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).
    43. Vojdani, A. For the assessment of intestinal permeability, size matters. Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).
    44. Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli. PLoS One. 12, e0178966(2017).

    Yeniden basım ve izinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

    İzin iste

    Etiketler

    Mikroenjeksiyon Tekni iFITC DekstranGer ek Zamanl G r nt lemensan Ba rsak DokusuGe irgenlik l mFloresan DekstranToksin MaruziyetiCanl G r nt leme

    İlgili makaleler