Yöntem makalesi

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

DOI:

10.3791/56973

⸱

8 Mayıs 2018

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, University of Washington School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada fare embriyonik gelişim sırasında hematopoetik kök hücre öncüleri klonal analizi için metodoloji mevcut. Endotel hücre ortak kültür ve fenotipik özellikleri ve tek hematopoetik öncüleri potansiyelini engraftment karakterize nakli ile embriyonik aort-erbezi-mesonephros bölgesinden tek hücre dizin sıralama birleştirin.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetik kök hücre (HSC) genesis embriyonik gelişim sırasında çalışma özelliği erken embriyo HSC öncüleri nadir ve işlevsel olarak uzun vadeli multilineage engraftment potansiyelini belirlemek deneyleri eksikliği ile sınırlı bireysel sözde HSC öncüleri. Burada, yalıtım ve işlevsel olarak doğrulanmış HSC öncüleri tek hücre düzeyinde karakterizasyonu sağlar metodoloji açıklayın. İlk olarak, biz kesin fenotipik parametresi, tek tek sıralanmış her hücrenin katalog için dizin sıralama kullanmak deneysel analizi için ek işaretçileri olan HSC öncüleri için zenginleştirmek için fenotipik işaretçileri kullanarak. İkinci olarak, her dizin sıralanır hücre vasküler niş stroma sigara engrafting HSC öncüleri multilineage, uzun vadeli engraftment içinde potansiyel ile fonksiyonel HSC için olgunlaşma destekler aort-erbezi-mesonephros (AGM) bölge ile ortak kültürlü. nakli deneyleri. Bu metodoloji korelasyon klonal hemogenic öncüleri ile fonksiyonel engraftment potansiyellerini fenotipik özellikleri veya transkripsiyon profil, HSC habercisi ayrıntılı bir analiz için bir araç sağlayan gibi diğer özellikleri sağlar tek hücre düzeyinde geliştirme.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonal çalışmalar heterojenite yetişkin HSCs, yaşlanma1sırasında HSC alt türlerini ve HSC davranış değişiklikleri yeni bilgi sağlayan uzun vadeli engraftment özelliklerini ortaya koymuştur. Ancak, embriyonik HSCs benzer çalışmaları ve onların öncüleri daha zor olmuştur. Erken embriyonik gelişim sırasında geçici bir süreç içinde hemogenic endotel anılacaktır olarak bilinen öncüleri nüfusu HSCs kaynaklanan olarak endotel hematopoetik geçiş2. Sağlam, uzun vadeli multilineage engraftment şartına yetişkin alıcılar nakli takip sağlamak için onların yetenek tarafından tanımlanan ilk HSC değil embriyonik günün ardından kadar 10.5 (E10.5) fare embriyo çok düşük frekanslı3, tespit . Gelişimleri sırasında öncüleri hemogenic endotel doğan HSC (pre-HSC) için olgunlaşma nakli deneyleri4,5 verimli engraftment için izin yetişkin HSC özelliklerini edinme önce geçmeleri gerekir , 6. nadir HSC kökenli, hematopoetik ataları ile erythroid, çok sayıda çalışmanın engellemeyecek myeloid ve lenfoid potansiyeli zaten algılanır HSC ortaya çıkması pre-HSC7,8önce. Böylece, pre-HSC diğer hematopoetik ataları ayırt clonally hücreleri izole etmek ve onları kendi olgunlaşma için yeterli sinyallerle HSC nakli deneyleri engraftment özelliklerini tespit etmek, sağlamak için yöntemler gerektirir.

Yaklaşımlar bir dizi tarafından ex vivo veya vivo olgunlaşma HSC için pre-HSC tespiti için izin olan tarif edilmiştir. Ex vivo yöntemler kültür nerede ilk HSC geliştirme9' tespit AGM bölge gibi embriyonik dokuların bağlıydı. Bu yöntemler, ayrılma, dahil protokolleri bina sıralama ve AGM dokuların yeniden toplama sıralanmış nüfus içinde para aort E11.5 için E9.5 üzerinden geliştirme sırasında HSC öncüleri içeren karakterizasyonu izin splanchnopleura (P-Sp) / AGM bölgeleri4,5,10; Ancak, bu yaklaşımların öncüleri klonal analiz için gerekli tek hücre düzeyinde yüksek üretilen iş analizi için mükellef değildir. Microenvironment HSC öncüleri, daha önceki aşamalarında destek için daha uygun olduğu kabul edilir nerede benzer şekilde, in vivo olgunlaşma yeni doğmuş fare, içine nakli tarafından da sarısı sac ve AGM sıralanmış nüfus çalışmaları sağladı / P-Sp (P-Sp habercisi AGM için bölgedir) pre-HSC, ama bu yöntemleri özellikleri ile de tek için sağlam bir platform sağlamak için başarısız hücre analizi11,12.

Rafii ve ark. çalışmalardan o Akt aktive endotel hücre (EC) stroma bir niş substrat yetişkin HSC kendini yenileme vitro13,14,15desteği sağlayabilir gösterdi. Biz son zamanlarda Akt aktif EC AGM bölgesinden (AGM-EC) elde edilen hemogenic öncüleri, gibi erken E9 geliştirme, HSC, Yetişkin engrafting için hem de sonraki izole olgunlaşma için uygun vitro niş sağlar tespit kendini yenileme oluşturulan HSC16. Bu sistemi basit bir 2-boyutlu ortak kültür istihdam olduğunu göz önüne alındığında, tek tek izole hemogenic öncüleri HSC potansiyelini klonal analiz için kolayca uyarlanabilir.

Son zamanlarda bir yaklaşım bireysel hemogenic öncüleri AGM-AB ortak kültür ve sonraki fonksiyonel analiz Ekiminde fare embriyo gelen dizin sıralanması birleştirerek klonal hemogenic öncüleri HSC potansiyelini tahlil bildirdin 17deneyleri. Dizin sıralama olduğunu Floresans aktif bir mod hücre (FACS) bu kayıtları (dizinler) sıralama her tek tek sıralanmış hücre böyle fenotipik parametreleri (Yani, ileri dağılım (FSC-A), yan dağılım (SSC-A), floresan parametreleri) tüm bu özellikleri geriye dönük olarak sıralama takip sonraki fonksiyonel analiz için ilişkili olabilir. FACS yazılım her hücre ve pozisyonu/kuyunun yerleştirildiği 96-şey plaka için her iki fenotipik bilgileri kaydeder. Bu teknik daha önce zarif kullanılmış olan yetişkin HSC heterojenite tanımlamak, daha fazla HSC uzun vadeli engrafting alt için zenginleştirmek ve fenotipik HSC parametrelerinin transkripsiyon ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir fenotipik parametreleri belirlemek için özellikleri tek düzey18,19hücre. Burada, benzersiz fenotipik parametreleri tanımlaması ve pre-HSC katkılarıyla lineage embriyonik gelişme erken aşamalarında sağlar bu yaklaşımın detaylı metodoloji sağlamak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi tarafından onaylanmıştır.

1. ortak kültür için AGM-EC Monolayers hazırlanması

  1. 24 saat önce AGM diseksiyon ve sıralama, AGM-EC kültür medya ve filtre sterilize yapmak.
  2. 96-şey plaka her şey için su (100 µL/de) % 0,1 jelatin ekleyin ve 15 dk. aspiratı jelatin için oda sıcaklığında kuluçkaya ve plaka bir doku kültürü mahallede kuyuları kuru olana kaldırıldı ve kapak ile bırakın.
  3. AGM-EC monolayers ve 96-şey plakaları plakasına ayırmak.
    Not: AGM-EC, yukarıda açıklanan16, AGM-EC kültür medya olarak hazırlanan korumak. Tutarlılık sağlamak için AGM-EC hücre hatları yeterli sayıda (genellikle geçiş 1-3) elde edilen en kısa zamanda donmuş olmalı ve tanımlanmış geçit numaradan (genellikle geçiş 5-12) ortak kültür deneyler için kullanılan. AGM-EC hücre hatları (CD45.2) AGM C57BL/6J türetilmiştir. Tüm medya besteleri için Malzemeler tablo görmek.
    1. 75 cm2 şişeye AGM-EC kültüründe medyadan Aspire edin ve 5 mL PBS ekleyin. PBS Aspire edin ve 3 mL tripsin çözüm ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).
    2. 2-4 dk 37 ° C'de en hücreleri tabağını kaldırma kadar kuluçkaya. AGM-EC kültür medya ve damlalıklı tek hücre süspansiyon hazırlamak ve bir 15 mL tüp aktarmak için 8 - 10 kez bir 10 mL pipet ile 7 mL ekleyin.
    3. 300 x g 5 min için de spin, süpernatant kaldırmak, 10 mL AGM-EC kültür medyada yeniden askıya alma ve telefon numarası ile bir hemasitometre tahmin ediyoruz. 1 x 105 hücre/mL AGM-EC kültür medya bir konsantrasyon hücrelere sulandırmak.
  4. 100 µL AGM-EC hücre süspansiyon (1 x 104 hücreleri) gelatinized bir 96-şey plaka her şey için ekleyin. Bir 37 ° C, % 5 CO2 doku kültürü kuluçka yerde gecede AGM-EC iliştirin ve Konfluent monolayer oluşturmak izin vermek için.
    Not: Bu nedenle sınırlı büyüme AGM-EC stromal hücreler veya hücre için en uygun ortak kültür topaklanma dağıtabilmenizi.
  5. AGM-EC monolayer AGM ortak kültürü için hazırlayın.
    1. Ertesi sabah, AGM serum serbest ortam hazırlamak.
    2. 12-şey çok kanallı pipet kullanarak, AGM-EC kültür medya AGM-EC kaldırın ve 200 µL/iyi AGM serum-Ücretsiz medya olmadan herhangi bir kalıntı serum içeren medya yıkamak için sitokinler ekleyin.
    3. Medyayı çıkarın ve 200 µL/iyi sitokinler ile AGM serum-Ücretsiz medya ekleyin. Hızlı bir şekilde iş ne zaman kaldırma ve endotel tabakası uzlaşma medya ekleyerek; örneğin, kaldırmak ve yeniden tek medya bir satır ekleyin. Embriyonik hücreleri sıralamak için hazır olana bir doku kültürü kuluçka 37 ° C'de 96-şey tabak koyun.

2. tek hücre süspansiyon fare embriyonik doku üzerinden hazırlanması

  1. Zamanlanmış matings üzerinden AGM incelemek.
    1. İstenilen yaş embriyonik dokular oluşturmak için zamanlanmış matings ayarlayın.
    2. Hasat embriyo 9.5-11,5 gün sonrası coitum (dpc), bağlı olarak çözümlenmesi için pre-HSC aşaması, hamile kadın üzerinden.
      Not: Yukarıda açıklanan ve tam olarak aşamalı temel alınarak somite sayısı16olarak C57BL/6J (CD45.2) fare embriyonik doku hasat. Embriyonik AGM bölgedeki nüfusun analiz odaklı olması ve onun habercisi, P-Sp, E11.5, E9.5 arasında somite evreleme üzerinde dayalı.
    3. AGM embriyo20incelemek.
      Not: Ayrıntılı iletişim kuralları AGM diseksiyon üzerinden fare embriyolar için olmuştur başkaları tarafından20yayınlandı. Alternatif olarak, sarısı sac veya pre-HSC etkinliğine sahip iddia edilen diğer dokularda da bu yöntemle analiz edilebilir.
  2. Disseke embriyonik doku ayırmak.
    1. 15 mL konik tüp 10 mL % 10 ile PBS içeren disseke dokularda toplamak FBS buz üzerinde. Yerçekimi doku yerleş, PBS/FBS Aspire edin, sonra hemen bir 37 ° C su banyosu için 25 dk 1 mL % 0,25 collagenase ve yer ekleyin.
    2. 1 mL PBS/10% FBS ve damlalıklı yaklaşık 20 - 30 kat bir tek hücre süspansiyon elde etmek için 1 mL pipet ucu ile ekleyin. PBS/10% FBS bir ek 8 mL ekleyin ve 300 x g 5 dakika süreyle santrifüj hücreleri süpernatant atın.

3. antikor fare embriyonik hücreleri boyama

  1. Engelleme arabellek antikor boyama için hazırlayın.
    1. 10 µg/mL Anti-fare CD16/CD32 (Fc reseptör (FcR) blok) ve 1 µg/mL DAPI (H2O hisse senedi 1 mg/mL) % 10 ile 1 mL PBS ekleyin FBS.
    2. 3 mL şırınga içinde çizmek ve sterilize etmek için bir 0,22 µm şırınga filtreden geçmek. Yeniden hücre Pelet 500 µL kapatmaktır Disosiye fare embriyonik dokulardan (Adım 2.2.2) dan tampon ve 5 min için buz üzerinde kuluçkaya askıya alma.
  2. Antikor mix17hazırlayın.
    1. 1 mL PBS % 10 ile 10 µg/mL FcR blok eklemek FBS ve her fluorochrome Birleşik anti-VE-Cadherin antikor 10 µL (CD144, Tablo reçetesigörmek) ve fluorochrome-Birleşik anti-EPCR antikor (CD201, Tablo reçetesigörmek). 1: 100 son seyreltme antikorların üreticinin önerilerini veya titrations göre göre belirtilmedikçe kullanın.
      Not: Bu antikor sıralama, gates tanımlamak için (Adım 4.2) açıklandığı gibi kullanılır. Sıralama VE-Cadherin co ifadeye dayalı ve EPCR HSC habercisi etkinlik, yukarıda açıklanan17olarak içeren hücreler AGM kaynaklı kısmı için önemli zenginleştirme sağlar.
    2. Ek fluorochrome-Birleşik antikorlar fenotipik analizinde bireysel dizin sıralanır öncüleri için ekleyin.
      Not: Bu antikorlar mutlaka gates sıralama tanımlamak için kullanılır. Bu örnek protokol için biz PE Birleşik anti-CD41 antikor ve pre-HSC hemogenic endotel4 üzerinden ortaya çıkması sırasında gelişmeye bu hematopoetik işaretlerinin göreli ifade analiz etmek için anti-CD45 FITC Birleşik antikor dahil ettik ,5,16,17. Diğer işaretleri ilgi istediğiniz gibi dahil edilebilir. Fluorochrome-Birleşik izotip antikor denetimleriyle lekeli örnekleri analiz negatif ve pozitif geçitlerini tanımlamak için kullanılır.
    3. 3 mL şırınga antikor karışımda çizmek ve sterilize etmek için bir 0,22 µm şırınga filtreden geçmek. Engelleme arabellek, mix ve en az 15-20 dk için buz üzerinde kuluçkaya pipet hücre süspansiyon için 500 µL antikor karışımı ekleyin.
  3. Lekeli hücreleri yıkayın.
    1. 8 mL PBS/10% FBS ekleyin. 5 dk, aspiratı ve yeniden askıya hücre ile 1 mL PBS/10% FBS cips için 300 x g de hücreleri santrifüj kapasitesi.
    2. Hücre kümeleri 35 mikron hücre süzgeç kap üzerinde 5 mL tüp yoluyla hücre süspansiyon pipetting tarafından kaldırın. Hücre süzgeç bir ek 3 mL PBS/10% FBS ile yıkayın. 300 x g 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi, Aspire, 500 µL PBS/10% FBS yeniden askıya alma ve buza FACS kadar yer.

4. dizin tek Hemogenic öncüleri 96-AGM-EC Stroma Wells'le için ortak kültürü için sıralama

  1. Plaka modu için FACS makineyi hazırlamak ve 96-şey plakaları üreticinin talimatlarına göre sıralamak için hizalayın. Tek hücre modu ve maksimal saflık maskesi ayarları ve dizin parametreleri sıralanmış her hücre için edinimi etkinleştirmek için yazılım modunda sıralama dizini seçin.
  2. Bir örneği örnekleri sıralama gates ayarlamak için lekeli antikor hücrelerden elde etmek.
    1. Lekeli hücre örnek FACS makine üzerinde yük ve hücreleri en düşük akış hızı elde etmek. FSC-bir ayet SSC-A ve select arsa hücreleri (Bu pre-HSC faaliyet farklı boyutu profilleri AGM17hücrelerdeki tanımlanır gözlem dayanır) büyüklüklerde (şekil 1B) içeren bir kapı. FSC-bir ayet FSC-W ve SSC-bir ayet SSC-W çizmek ve gates birini dışarıda bırakmak için seçin. FSC-bir ayet DAPI canlı hücreleri (DAPI için negatif) kapı Arsa (şekil 1B).
    2. PECy7 (veya ilgili fluorochrome VE-Cadherin leke için) PerCP (veya EPCR leke için ilgili fluorochrome) karşı çizmek. Bu VE-Cadherin (e nüfus endotel hücreleri gibi hematopoetik ataları ve pre-HSC AGM üzerinden olmak üzere) için olumludur ve (pre-HSC P-Sp/AGM17için zenginleştirir) yüksek EPCR ifadesi olan hücrelerin kapısı. Sıralama adım 4.3 (şekil 1B) Tek Kişilik hücrelerde dizinini oluşturmak için kullanılacak olan son kapıdır.
    3. Boyama için kullanılan ek fluorochromes arsa.
      Not: analiz edilebilir subpopulation bağlı olarak, ek gates hücreleri boyama için dahil diğer işaretleri algılamayı göre ayarlanabilir. Öyle ki bu parametreler geriye dönük olarak analiz edilebilir ancak, dizin sıralama sıralanmış her hücre için floresan parametreleri kayıt sağlayan. Böylece, hiçbir ek geçişi bu noktada gereklidir. Tüm FACS kurulumları için tek antikorlar ile lekeli örnekleri emisyon üst üste fluorochromes ve izotip kontrol antikorlar, arka plan boyama için hesap ve belirlemek için yayılma için hesap için tazminat, ayarlamak için kullanılmalıdır negatif/pozitif gates.
  3. Dizin AGM hücreleri sıralamak.
    1. AGM-EC stroma AGM serum-Ücretsiz medya (1.5.3. adımdaki) sitokinler FACs sıralama makinesine plaka blok ile hazırlanan bir 96-şey tabak koyun. Örnek yükleme ve örnek alma başlar. Dizin sıralama/tek hücre modu seçin ve bireysel 96-wells hücrelere sortingsingle başlar. Yamultma stres embriyonik hücrelerde en aza indirmek için en düşük akış hızını kullanın.
    2. Tüm olayları sırasında dizin sıralama kaydedilir sağlamak. Bu kaydedilmiş olan tüm olayları wells için sıralanır gibi gerçek sayı için tek tek sıralanmış 96-wells için göreli sıralama kapısı analiz toplam sayısı numaralandırılmasına olanak sağlar.
    3. Hücreleri tüm 96-şey plakasına sıralanmış sonra doku kültürü kuluçka %5 CO2adlı ayarla 37 ° C'de plaka yerleştirin. Deney için gerekli ek plakaları için yineleyin.
    4. Ortak kültür tek tek sıralanmış hücreleri 96-Wells için 7 gün (E10-10,5 embriyolar, E9-9.5 embriyo itibaren 7 gün 6 günden E11-11,5 embriyo göre hücreler için 5 gün) AGM-EC (Kimden adım 4.3) içeren. Hematopoetik kolonileri çeşitli boyutları ve türleri Morfoloji 100 X büyütme (şekil 2B), ters bir mikroskop ile ortak kültür döneminden sonra gözünün önüne getir.
      Not: Medya ortak kültür döneminde değiştirilmesi gerekmez. Hareketlenme öncesi ilk belirtiler başlangıçta bir EC-benzer görünümdeki AGM-EC katmanına entegre olabilir ve başlangıçta AGM-EC stroma (şekil 2A) ayırt edici olamaz hemogenic göre. Ancak, aşağıdaki 24-48 h ortak kültür, küçük, yuvarlak hematopoetik hücreler veya hücre kümeleri algılanabilir. Ortak kültür (5-7 gün) sonunda, hematopoetik hücrelerin bireysel kolonileri içinde sıralanmış bir hücre klonal hematopoetik potansiyeli ile alınan 96-kuyu alt kümesini görüntülenmeyecektir. Görsel olarak incelenen wells birden fazla farklı koloni içerir, daha sonra bu örnek iyi göre birden fazla hücre almış olabilirsiniz örnekleri dışlamak için aşağı akım çözümlemesi söz konusu değildir.

5. klonal hematopoetik döl ortak kültür aşağıdaki analizi

  1. Klonlar kuyudan her 96-FACS analiz için hasat.
    1. Şiddetle damlalıklı hematopoetik hücreler endotel katmanlardan 200 µL pipet ipuçları ile çok kanallı pipet kullanarak ayırmak için. Endotel tabakası ayırmak değil deneyin. Fenotipik hematopoetik döl FACS tarafından çözümlenmesi için 100 µL (örnek ~ %50) kaldırın.
    2. Bir 96-şey V-alt plaka aktarmak ve vasıl 300 x g hücreleri cips 2 dk santrifüj kapasitesi. Plaka ters sırada medya plaka tek bir hızlı hareket ile flicking medyayı çıkarın (fiske plaka).
    3. Kalan 100 µL hücreleri orijinal 96-şey plaka 37 ° C incubatorfor kullanımda sonraki engraftment tahlil (adım 6) yerleştirin.
  2. Hücreleri hematopoetik analiz için uygun antikorlar ile kuluçkaya.
    1. Hücre topakları bir 96-şey V-alt her iyi PBS/2% 10 µg/mL FcR blok ve 1 µg/mL DAPI içeren FBS 50 µL ile yeniden askıya alma. Plaka 5 min için 4 ° C'de kuluçkaya.
    2. PBS/2% 10 µg/mL FcR blok ve PE-Cyanine7-Birleşik anti-VE-Cadherin, PerCP Birleşik anti-CD45, PE Birleşik anti-EPCR, APC Birleşik anti-Sca1 ve FITC Birleşik anti-Gr1 içeren HSC analiz için bir antikor karışımı içeren FBS 50 µL eklemek ve Anti-F4/80 (1: 100 son seyreltme, her antikor dayalı üreticinin önerilerini veya titrations göre aksi belirtilmedikçe). Plaka için en az 20 dk 4 ° C'de kuluçkaya.
  3. Sıralı dilutions ile ilişkisiz antikor kaldırmak ve hücreleri çözümleyebilirsiniz.
    1. 200 µL/iyi PBS/2% FBS ve santrifüj 300 x g hücreleri cips için 2 dakika için ekleyin. O zaman, plaka süpernatant atmak ve her hücre Pelet 200 µL PBS/2% FBS ekleyin ve vasıl 300 x g hücreleri cips 2 dk santrifüj kapasitesi için hafifçe vur.
    2. Plaka süpernatant atıp 50 µL/iyi PBS/2% FBS analiz için eklemek için hafifçe vur. Hücreleri bir plaka okuyucu ile donatılmış bir Akış Sitometresi kullanarak FACS tarafından çözümlenecek devam edin.
      Not: sabit birim (örneğin, re-süspansiyon için kullanılan toplam 50 µL 35 µL) hücrelerinin elde hematopoetik döl kümelerine Numaralandırılacak.
  4. Her şey için ekran HSC potansiyel (şekil 3) içeren kolonileri hematopoetik döl içeren FACS verileri analiz.
    1. Myeloid işaretleri Gr1 ve F480 negatif CD45 olumlu nüfus ilk kapı. Hala VE-Cadherin seviyesinin düşük hızlı hücre kapı değil. Hematopoetik kolonileri hasat sırasında kesintiye AGM-EC katmandan VE-Cadherin pozitif ve negatif CD45 hücrelerdir.
    2. Kapı CD45+VE Cad- / düşükGr1-F4/80- hücreleri daha yüksek düzeyde EPCR ve Sca1 hızlı alt (şekil 3A -C).
      Not: yılında önceki çalışmalar, CD45 içeren hücreleri eksik koloniler+VE Cad- / düşükGr1-F4/80-Sca1MerhabaEPCRMerhaba fenotip (şekil 3D) tekrarlanarak tespit sağlamak başarısız oldu multilineage periferik kan engraftment radyoaktif alıcı fareler17 (veri) gösterilmez; Böylece, bu koloniler adım 6 sonraki nakli analize dahil değil.

6. analiz bireysel klonlar ve korelasyon Engraftment özellikleri ile dizin sıralayarak aydınlatılmamıştır fenotipik özellikleri

  1. Gün (Eğer mümkünse) veya adım 5, fenotipik analizde takip sabah yeniden kalan 100 µL hücreleri kolonilerden (Kimden adım 5.1) ortak kültür 200 µL pipet ucu kullanarak dinç pipetting tarafından takip her 96-şey içeren hematopoetik askıya.
  2. Hazırlamak ve congenic baskı B6 bütün kemik iliği kurtarma hücreleri ekleyin. SJL-PtprcbirPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) Yetişkin fareler16,17.
    1. Bir hemasitometre altında Türkler çözümde çekirdekli ilik hücreleri saymak. 5 x 10 bir konsantrasyon sulu5 hücre/mL PBS % 2 ile parçalanmayabilir FBS.
    2. Kurtarma kemik iliği hücrelerinin (5 x 104) 100 µL nakli analiz için hematopoetik döl içeren her şey için ve pipetting tarafından karıştırın.
  3. Organ nakli döl içine tek bir bireysel klonların öğrenirim alıcı congenic zorlanma B6 ışınlanmış. SJL-PtprcbirPepcb/BoyJ (B6 CD45.1) Yetişkin fare.
    1. B6 CD45.1 fareler aynı sayıda ayrı ayrı döl (1.000 cGy sezyum kaynağından kullanarak) tek bir klonu enjekte klonların sayı olarak ışınlatayım öğrenirim.
    2. 200 µL toplam hücre süspansiyon (Bu klon hücrelerden yanı sıra 5 x 104 B6 CD45.1 kurtarma kemik iliği hücreleri içerir) ½ mL insülin enjektör 29 G ½ inç iğne ile çizin.
    3. B6 CD45.1 Yetişkin alıcılar 2-24 saat öncesinde enjeksiyon ışınlatayım öğrenirim.
    4. Kuyruk erişimine izin veren bir plastik fare restrainer kullanarak, her klon hücrelerden ve alıcı hayatta yardımcı olmak için 5 x 104 B6 CD45.1 yetişkin kemik iliği kurtarma hücreleri içeren kuyruk ven 200 µL cilt yoluyla enjekte et.
    5. Kulak etiket ve alıcı fareler tartmak ve onların ağırlık/sağlık düzenli aralıklarla kontrol edin (örneğin, 3 - 4 kez / hafta post ışınlama/nakli, ya da bireysel kurumsal standart işletim yordamlar başına) iyi sağlık sağlamak için.
  4. Periferik kan engraftment, düzenli aralıklarla (örneğin, 2, 16, 24 hafta) analizini gerçekleştirmek nakli takip.
    1. 50-100 µL kan retro-orbital taşma payı ya da başka bir etik onaylı kan icar yöntemi aracılığıyla kaldırın.
    2. Kan için 3 mL lizis arabellek (16,6 g NH4Cl, 2 g için 2 L H2O NaHCO3 ve 74.4 mg EDTA) ekleyin ve 5 dk. santrifüj vasıl 300 x g 5 dk. aspiratı ve yeniden askıya Pelet 2 mL ile oda sıcaklığında PBS/2% FBS kuluçkaya. 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.
    3. Pelet 150 µL PBS/2% FBS taşıyıcı 10 µg/mL FcR blok ve 1 µg/mL DAPI ile yeniden askıya alma ve 1/3 bir de içeren 50 µL izotip denetimleri için donör ve soyu, 1/3'e bir de içeren 50 µL antikor lineage için donör ve izotip denetimler için birime dağıtmak ve 1/3 için donör ve soyu tespit etmek için 50 µL antikorlar içeren bir kuyu.
      Not: Antikor multilineage engraftment tespiti için: APCeFluor780 Birleşik anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-Birleşik anti-CD45.1, FITC Birleşik anti-CD3, PE Birleşik anti-F4/80, PerCP Birleşik anti-Gr1 ve APC Birleşik anti-CD19, veya ilgili izotip kontrol eder.
    4. Klonlar FACS periferik kan katkısıyla CD45.2 (donör) Zaman içinde değerlendirilmesi ile uzun vadeli engraftment tanımlamak-hematopoetik hücreler elde edilen Miyeloid (Gr1 ve/veya F4/80 olumlu olarak), B-hücre (CD19 pozitif) ve T hücre (CD3 pozitif) (şekil 4A -B).
      Not: Hematopoetik engraftment de CD45.2 (donör) tarafından çözümlenebilir-katkı kemik iliği, dalak, timus ve karın zarını veya kemik iliği hücrelerinin ikincil ekimi takiben hasat doku hematopoietik nüfusu elde B6 CD45.1 fareler seri engraftment özellikleri17analiz.
  5. Onun engraftment özelliklerle sıralama ilk tek hücre dizin bilgisi tarafından belirtildiği gibi her klonun fenotipik özellikleri aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Akış analizi yazılım kullanarak, dizin sıralanır (96-kuyuya hangi için sıralanmış korelasyon) her hücre için sıralama parametreleri yüklemek. Fonksiyonel çıktılarını (örneğin, uzun vadeli, multilineage engraftment) ilişkili oldukları sürece tek hücre fenotipik özellikleri değerlendirmek için akış araziler üzerine işlevsel veri eşleminin (şekil 4 c).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1A bir şematik deneysel tasarım gösterir. P-Sp/AGM doku disseke, havuza alınmış ve collagenase içinde ayrışmış sonra dizin sıralama için antikorlar VE-Cadherin ve EPCR ile lekeli. Pre-HSC VE-Cadherin+EPCRyüksek (şekil 1B) göre hücrelerdeki zenginleştirilmiş. Diğer fluorochrome Birleşik antikorlar geriye dönük olarak her hücre için dizin sıralama sırasında kaydedilir ek fenotipik parametreler analiz dah...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HSC genesis embriyonik gelişim sırasında çalışmanın HSC potansiyel henüz transplante yetişkin alıcılar uzun vadeli multilineage hematopoetik rekonstitüsyon sağlamak için yetki eksik hemogenic öncüleri olarak algılamak için araç gerektirir. Bu protokol için biz embriyonik hemogenic öncüleri klonal bir tahlil vasküler niş ECs stromal ortak kültür tarafından öncüleri HSC için olgunlaşma destekler, AGM fonksiyonel analizde sonraki nakli deneyleri ile mevcut. Dizin izinleri sıralama birleşmesiyle retrospektif fenotipik parame...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fred Hutchinson Akış Sitometresi temel yardım için FACS ile Andrew Berger, Stacey Dozono ve Brian Raden teşekkür etmek istiyorum. Bu eser yardımcı işbirlikçi Grant #HL099997 ve NIDDK #RC2DK114777 vermek #HL100395, ulusal kurumları sağlık NHLBI UO1 grant tarafından desteklenmiştir. Brandon Hadland Alex'in limonata standı Vakfı ve Hyundai umut üzerinde tekerlekler Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AGM-EC kültür ortamı
Endotel hücrelerinin kültürü için malzemeler
TrypLE ExpressGibco12605-028AGM-EC tek katmanlarını ayırmak için kullanın
Suda %0.1 JelatinKök Hücre Teknolojileri7903AGM-EC tek katmanlarını plastiğe
yapıştırmak için kullanın96 oyuklu doku kültürü plakalarıCorning3599AGM-EC tek katmanlarını birlikte kültürlemek ve sıralanmış klonları indekslemek için kullanın
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Gibco14190-144Diseksiyon ve FACS boyama için kullanın
500 ml filtre şişeleriFisher Scientific9741202Steril filtre için kullanın Endotel ortamı
AGM-EC kültür ortamı (500 mls)
Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium (IMDM)Gibco12440-053400 mls
Hyclone Fetal Sığır SerumuFisher ScientificSH30088.03100 ml
Penisilin StreptomisinGibco15140-1225 ml
HeparinSigmaH314950 mg 10 ml ortam
L-glutamin (200 mM)içinde çözülmüşKök Hücre Teknolojileri71005 mls
Endotelyal Mitojen (EKGS)Alfa AesarJ64516 (BT-203)Çözünmesi için 10 mls besiyeri ekleyin ve ekleyin
AGM indeksi için malzemeler sort
Kollajenaz (%0.25)Kök Hücre Teknolojileri7902Embriyonik dokuların ayrışması için kullanım
3ml şırıngaBD Biosciences309657için steril filtre antikor solüsyonlarında kullanın
; M şırınga tahrikli filtreKırlangıçSLGP033RSSteril filtre için kullanın FACS için antikor solüsyonları Hücre
süzgeç kapaklı 5 ml polistiren tüpCorning352235FACS DAPI'den önce hücre kümelerini çıkarmak için kullanın
(H2O'da 1 mg / ml stok olarak hazırlanır)Millipore268298Ölü hücreleri sıralamadan çıkarmak için kullanın
anti-fare CD16 / CD32 (FcR bloğu)BD Biosciences553141Fc reseptörlerine spesifik olmayan lekelenmeyi engellemek için kullanın
>
anti-fare CD144 PE-Siyanin7eBioscience25-1441-82Boyama
Sıçan IgG1 kappa İzotip Kontrolü, PE-Siyanin7eBioscience25-4301-81CD144 PE-Siyanin7
Anti-fare CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710için izotip kontrolüeBioscience46-2012-80Boyama
Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü, PerCP-eFlour710eBioscience46-4031-80CD201 için İzotip kontrolü PerCP-eFluor710
Anti-fare CD41 PEBD Biosciences558040Boyama
Sıçan IgG1 kappa İzotip Kontrolü, PEBD Biosciences553925CD41
PE Anti-fare CD45 FITCiçin izotip kontrolüeBioscience11-0451-85Boyama
Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü, FITCeBioscience11-4031-81CD45 için izotip kontrolü FITC
AGM-serum ücretsiz ortam (10mls)
X-Vivo 20Lonza04-448Q10 mls
rekombinant murin kök hücre faktörü (SCF)Peprotech250-0310 ml (100 mg/ml stok) Nihai konsantrasyon 100 ng/ml
rekombinant insan FLT3 Ligand (FLT3L)Peprotech300-1910 ml (100 mg/ml stok) Nihai konsantrasyon 100 ng/ml
rekombinant insan trombopoietini (TPO)Peprotech300-182 ml (100 mg/ml stok) Nihai konsantrasyon 20 ng/ml
rekombinant murin interlökin-3 (IL3)Peprotech213-132 ml (100 mg / ml stok) Nihai konsantrasyon 20 ng / ml
< güçlü > Ko-kültürlenmiş hücrelerin boyanması için malzemeler< / güçlü >
96 kuyucuklu plaka, V-altCorning3894FACS analizi için kullanın
< güçlü > endotel hücreleri ile birlikte kültürlenmiş İndeks sıralanmış klonların analizi için antikorlar< / güçlü >
anti-fare CD45 PerCP-Siyanin5.5eBioscience45-0451-82Boyama
Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü, PE-Siyanin5.5eBioscience35-4031-80CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-fare CD201 (EPCR) PEeBioscience12-2012-82Boyama
Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü, PEeBioscience12-4031-81CD201 PE
Anti-fare Ly-6A/E (Sca-1) için izotip kontrolü APCeBioscience17-5981-83Boyama
Sıçan IgG2a kappa İzotip Kontrolü, APCeBioscience17-4321-81Ly-6A/E APC
Anti-fare F4/80 FITCeBioscience11-4801-81Boyama
Sıçan IgG2a kappa İzotip Kontrolü, FITCeBioscience11-4321-41F4/80 FITC
Anti-fare Ly-6G/C (Gr1) FITCBD Biosciences553127Boyama
Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü, FITCBD Biosciences556923Ly-6G/C ve CD3 için izotip kontrolü FITC
Nakil için kuyruk damarı enjeksiyonu için malzemeler< / 29G
1/2 ml insülin şırıngalarıBD Biosciences309306Transplantasyon için kuyruk damarı enjeksiyonu için kullanın
< güçlü>Translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCPBiolegend108426Boyama
Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü, PerCPBiolegend400629Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PEeBioscience12-4801-82Boyama
Sıçan IgG2a kappa İzotip Kontrolü, PEeBioscience12-4321-80F4 / 80 PE
Anti-fare CD3 içinBD Biosciences555274Boyama
Anti-fare CD19 APCBD Biosciences550992 Boyama
Sıçan IgG2a kappa İzotip Kontrolü, APCBD Biosciences553932CD19 için izotip kontrolü APC
Anti-fare CD45.1 (A20) PE-Siyanin7eBioscience25-0453-82Boyama
Sıçan IgG2a kappa İzotip Kontrolü, PE-Cyanine7eBioscience25-4321-81CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-fare CD45.2 (104) için izotip kontrolü APC-eFluor780eBioscience47-0454-82Boyama
Sıçan IgG2a kappa İzotip Kontrolü, APC-eFluor780 eBioscience47-4321-80CD45.2 APC-eFluor780 için izotip kontrolü
Equipment
BD FACSAria II, DIVA yazılımı ileBD Biosciences
BD FACSCanto II, plaka okuyuculuBD Biosciences
HemositometreFisher ScientificS17040Hücre saymak için
Çok kanallı pipetFisher Scientific14-559-417 dağıtım hücreleri
FACS analiz yazılımıFlowJo/BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo
FACS 0.22 ve mikro için antikorlar / için izotip kontrolü 1/2" iğneli güçlü> için İzotip kontrolü için Anti-fare analizi için antikorlar izotip kontrolü FITC

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
  2. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  3. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
  4. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  5. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
  6. Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
  7. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  8. Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
  9. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  10. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  11. Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
  12. Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
  13. Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
  14. Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
  15. Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
  16. Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
  17. Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
  18. Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  19. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
  20. Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
  22. Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
  23. Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156(2009).
  24. Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
  25. Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
  26. Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
  27. Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
  28. Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hematopoietic Stem CellSingle Cell Index SortingEndothelial Cell Niche Co cultureEmbryonic HSC PrecursorsAorta gonad mesonephros AGMFlow Cytometry AnalysisClonal Hematopoietic AnalysisVascular Endothelial CadherinEndothelial Protein C ReceptorLong term Engraftment Potential

İlgili makaleler