Yöntem makalesi

Hedeflenen 16S sıralama insan sütü örnekleri için bir yöntem

9.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/56974

⸱

23 Mart 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of California at Los Angeles

Bu makalede

Özet

Yarı otomatik bir iş akışı 16S rRNA insan sütü ve diğer düşük-biyokütle örnek türleri arasından hedeflenen sıralama için sunulmaktadır.

Özet

Çalışmalar mikrobiyal toplulukların nispeten ucuz, hızlı ve yüksek işlem hacmi sıralama gelişimi ile yaygın hale gelmiştir. Ancak, tüm bu teknolojileri ile gibi tekrarlanabilir sonuçlar birleştirmek uygun önlemler ve denetimleri bir laboratuvar iş akışı üzerinde bağlıdır. Bu özellikle düşük-biyokütle örnekleri ile nerede bakteriyel DNA kirletici yanıltıcı sonuçlar üretebilir önemlidir. Bu makalede mikroplar insan meme süt örneklerinden bir düşük - için orta - throughput ölçekte 16S ribozomal RNA (rRNA) V4 bölgesinin hedeflenen sıralama kullanarak tanımlamak için yarı otomatik bir iş akışı ayrıntıları. Tam yağlı süt de dahil olmak üzere gelen numune hazırlama protokolünü açıklar: örnek lizis, nükleik asit ayıklama, amplifikasyon 16S rRNA gen ve Kütüphane hazırlık kalite kontrol önlemleri ile V4 bölgesinin. Önemlisi, protokol ve tartışma belirgin hazırlama ve analiz düşük-biyokütle örnekleri de dahil olmak üzere çevre, reaktif tarafından uygun pozitif ve negatif kontrol eder, PCR inhibitörü kaldırma, örnek kirlenme konuları göz önünde bulundurun veya deneysel kaynakları ve tekrarlanabilirlik sağlamak amacıyla tasarlanan deneysel en iyi yöntemler. Açıklandığı gibi protokol insan sütü örnekleri için belirli ise, harika veya koruma arabellekte stabilize donmuş temizleme bezi, toplanan örnekleri de dahil olmak üzere çok sayıda düşük ve yüksek biyokütle örnek türleri için uyarlanabilir.

Giriş

İnsanlar kolonize mikrobiyal toplulukların insan sağlığı ve hastalığı etkileyen metabolizma, bağışıklık geliştirme, duyarlılık hastalık ve aşı ve ilaç tedavisi1, yanıt için önemli olduğuna inanılan 2. microbiota insan sağlığı üzerindeki etkisi şu anda anlamak için çaba vurgulamak ile tanımlanmış anatomik bölmeleri (Yani, deri, bağırsak, oral, vb), yanı sıra yerelleştirilmiş sitelerle ilişkili mikroplar tanımlaması Bu bölmeler3,4. Araştırmacı bu çabalarına destek hızlı ortaya çıkması ve mikrobiyal genetik içeriği (microbiome) analiz için bir örnek kitlesel paralel bir platform sağlayan yeni nesil sıralama (NGS) teknolojilerin artan erişilebilirlik olduğunu. Pek çok fizyolojik örnekleri için karmaşık ve bol ilişkili microbiome (Yani, dışkı), ancak, bazı örnekler için microbiome tarafından düşük mikrobiyal biyokütle (Yani, insan sütü, alt solunum yolu) nerede temsil edilir duyarlılık, deneysel eserlerin ve olası bulaşma önemli konular haline. Microbiome çalışmaları ve uygun deneysel tasarım ortak sorunları birden çok gözden makaleler5,6,7,8konu oldu.

Burada sunulan sağlam bir NGS deneysel boru hattı insan sütü microbiome karakterize rRNA 16S V4 bölge9 hedeflenen sıralama üzerinde temel alır. İnsan sütü Microbiome analizi değil karmaşık sadece bir doğal olarak düşük mikrobiyal biyokütle10, ama Ayrıca tarafından yüksek düzeyde insan DNA'sı11,12,13,14 arka plan ve potansiyel ertelenmiş ayıklanan nükleik asit PCR inhibitörleri15,16 . Piyasada bulunan ayıklama kitleri ve örnek hazırlama toplu işlemleri arasında değişkenlik en aza indirmeye yardımcı yarı otomatik platformlar bu protokolü kullanır. O örnekleri protokol her adımda doğrulamak ve boru hattı sağlamlık'bağımsız bir ölçü sağlamak için kalite kontrol işlenir iyi tanımlanmış bir bakteriyel sahte topluluk birleştirmek. İletişim kuralı olarak açıklanan insan sütü örnekleri özgü olsa da, bu tabure, rektal, vajinal, Cilt, areolar ve sözlü temizleme bezi10,17de dahil olmak üzere diğer örnek türleri kolayca uyarlanabilir ve için bir başlangıç noktası olarak hizmet verebilir microbiome analizleri gerçekleştirmek isteyen araştırmacılar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm iletişim kuralı adımlar için uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) takılmalıdır ve sıkı kirlilik önleme yaklaşımlar alınması gerekir. Kirlenme örneklerin en aza indirmek için sonrası amplifikasyon çalışma alanları için alanları iş akışını öncesi amplifikasyon işten gözlemlemek. Kullanılan tüm malzemeler steril, ücretsiz RNase, Dnaz, DNA ve pyrogen. Tüm pipet ipuçları süzülür. Bir akış protokolü adımlardan (şekil 1) sağlanır.

1. örnek lizis

Not: Örnek lizis ve nükleik asit ayıklama mühendislik ve yordam denetimleri yerine çevre bakteri giriş örnekleri en aza indirmek için nerede bir temiz oda ortamında bir DNA/RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir.

  1. Çalışma alanı hazırlama
    1. Temiz Biyogüvenlik Kabini (BSC) çalışma alanı herhangi bir nükleik asit kirlenme ortadan kaldırmak için uygun yüzey temizleyici ile.
    2. Isı kontrollü vortexer açın ve 37 ° C'ye ayarlayın
  2. Guanidinium thiocyanate lizis arabellek hazırlamak (tablo malzemeleri görmek)
    1. Lizis arabellek precipitates için kontrol edin. Precipitates 37 ° C'de ısınma tarafından yeniden dağıtılması
    2. 6 µL β-mercaptoethanol (β-ME) ile lizis tamponunun 600 µL her örnek için hazırlayın. Bir ekstra % 20 birim başına örnek göz önünde bulundurun.
  3. Numune hazırlama
    1. Tam yağlı süt donmuş, buz çözme. Aliquot 5 mL bütünün 15 mL veya BSC bir 5 mL steril tüp içine süt ve buz üzerinde tutun.
    2. 5-mL süt aliquot 5000 x g 4 ° C'de hücreler cips için de 10 min için spin.
    3. Yağ katman kaldırmak için şimdi tüp, plastik spatula ile veya büyük üst katmanda pipet ucu delik.
    4. Pelet bozmadan, tüm süpernatant 100 µL dışında kaldırın.
    5. Pelet 1 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) resuspending tarafından yıkayın.
    6. 1 negatif kontrol steril PBS 1 mL 5 mL tüp ekleyerek hazırlayın.
    7. Süspansiyon temiz 1.5 mL santrifüj tüpü aktarmak ve bir microcentrifuge 1 dk (oda sıcaklığında (RT) 5000 x g) için spin.
    8. 1000 µL steril süzülmüş pipet ucu tüm süpernatant/yağ katmanı iptal etmek için kullanın.
    9. Ayıklama aynı gün kendine değil dondurursanız hücre bir etanol/kuru buz Bulamaç koyarak cips ve hemen-80 ° C dondurucu transfer.
  4. Örnek bozulma ve homojenizasyon (Boncuk atan)
    1. β-ME için Pelet içeren lizis arabelleği 600 µL ekleyin ve süspansiyon bir boncuk tüp aktarın.
    2. Her ayıklama toplu 12 10 örnekler, 1 negatif kontrol (3.7 yukarıdaki hazır) ve (bir sonraki adımda hazırlanan) 1 olumlu denetim içerir.
      1. 1 pozitif kontrol lizis arabellek ve bakteriyel sahte örneği (kullanılan sahte bir kez hulâsa, bir konsantrasyon, DNA'ın yaklaşık 0.2 ng/µL kuran) 20 µL hazırlayın.
    3. Girdap tüm tüpler 15 için şiddetle boncuk s.
    4. 700-800 rpm'de sallayarak ile ısı kontrollü vortexer 10 dk, 37 ° C'de ısı örnekleri.
    5. Tüpler otomatik örnek topu bağdaştırıcı kümesi yükleyin.
    6. Boncuk 30 Hz değerinde 1 dk. için yendi.
    7. Adaptör seti sökmeye ve el ile geçiş adaptörü ile örnek plakalar sol robotik kol araç şu robot kol için ayarla.
    8. Boncuk için başka bir 1 dk 30 Hz'de yendi.
    9. Santrifüj tüpleri için 25 ° C'de 3 dk 17,200 x g de
    10. Tüm süpernatant değil almak birisi örnek veya boncuk üstündeki yağ tabakasının örnek dibinde kalan ve bir homogenizer sütun için geçerli için dikkatli olmak bir 200 µL pipet ile kaldırmak.
    11. Homogenizer sütun maksimum hızda, 17,200 x g, 25 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi
    12. DNA ve RNA (herhangi bir diğer tüp kullanmayın) arıtma için otomatik araç ile kullanmak için bir 2 mL üreticinin microcentrifuge tüp eluate 350 µL aktarın. Herhangi bir kalıntı yağlı katman aktarmak için dikkatli olun.
    13. Akış yoluyla birim daha az 350 µL ise, β-ME ile lizis tampon 350 µL son bir hacim için ekleyin.
    14. Örnekleri RT için en fazla 2 saat devam etmeden önce otomatik DNA arıtma aleti kullanarak nükleik asit yalıtım için terk veya-80 ° C'de dondurmak
  5. Çalışma alanını Temizleme
    1. Temiz tüm yüzeylerde enzimatik olmayan dekontaminasyon çözüm ile kullanın, 10 dakikadır bırakın sonra % 70 etanol ile sprey ve yüzey silin.

2. izole DNA/RNA

  1. Çalışma alanı hazırlama
    1. Isı blokta açın ve 70 ° c sıcaklık ayarlayın
    2. Isı kontrollü vortexer açın ve 37 ° c sıcaklık ayarlayın
    3. 10 mM Tris-Cl, pH 8,5, 50 mL tüp ile 70 ° c içeren elüsyon arabellek (EB) sıcak
    4. 350 ısınmak donmuş örnek lysates 2 mL tüpler 37 ° c kadar tamamen µL çözdürülen herhangi bir çökelti (yaklaşık 10 dakika).
  2. DNA arıtma
    1. Girdap ve 2 mL tüpler ile örnek kısaca santrifüj (3000 x g 10 için s).
    2. 2 mL tüpler otomatik DNA/RNA arıtma gerecin yükleme grafik, üreticinin yönergelerini başına takip shaker içine yerleştirin.
    3. Rotor adaptörleri almak ve onları örnek sayısına göre tepsi kurmak.
    4. Örnek'ın kimliği (ID) göre her rotor adaptör etiketleyin.
    5. Kapakları kesme ve DNA ve RNA için bireysel spin sütunları kenarlarını düzeltmek.
    6. DNA spin sütun koleksiyon tüp olmadan rotor adaptör yerleştirin. Toplama tüp atmak.
    7. Koleksiyon tüpler 1,5 mL etiketleyip rotor adaptör yerleştirin.
    8. Rotor adaptörleri otomatik DNA/RNA arıtma gerecin yükleme grafik takip santrifüj ayarlayın.
    9. Üretici 1000 µL filtre-ipuçları ipucu raflar yerleştirin.
    10. 2-mL üreticinin microcentrifuge Tube (başına belirli makine Protokolü yönergeleri) örnek sayısını temel alan RNase free su ekleyin.
    11. Tüp boru yuvaya microcentrifuge tüp Slots "A" takın.
    12. Reaktif şişeleri ve 10 mL minimum hacmi ile doldurun kalan herhangi bir reaktif atmak.
    13. Reaktif şişe raf (hariç EB şişe) Reaktif şişe takın.
    14. Sıcak EB reaktif şişe pozisyon 6 50 mL tüp sizden ekleyin.
    15. Onay 1,5 mL tüpler rotor adaptörleri sıkıca yerleştirilir.
    16. Cihazın kapağı kapatın ve seçin: "RNA" → "ekstraksiyon kiti" → "Hayvan, dokuları ve hücreleri" → "Kit'in adı 350 µL bölümü A özel DNA" → düzenlemek elüsyon birime 100 µL (varsayılan) veya düşük biyokütle örnekleri → için 50 µL "Start."
    17. Tamamlandığında, rotor adaptörleri santrifüj dışarı çıkarın ve onları tepsiye yerleştirin.
    18. Rotor adaptör pozisyon 3 DNA spin sütundan atmak.
    19. Rotor adaptörleri atmayın, RNA pozisyonu 2.
    20. Pozisyon 3 eluted DNA içeren 1,5 mL koleksiyonu tüpler kaldırın ve saklamak −20 ° C.
    21. Herhangi bir örnek üzerinde aksi takdirde atma bırakılırsa örnek içeren tüpler shaker ve −20 ° C, deposunda toplamak.
    22. Protokolü "Kit'in adı 350 µL Bölüm B RNA" RNA'ın daha fazla arıtma ile devam edin.
    23. RNA arıtma yaklaşık 350 µL akışı-rotor adaptörleri orta konumda olan aracılığıyla üzerinden yapılacaktır.
  3. RNA arıtma
    1. RNA spin sütun koleksiyon tüp ve kapak olmadan rotor adaptör yerleştirin.
    2. Yeni 1,5 mL tüpler koleksiyonu etiket ve el kitabında belirtildiği gibi rotor adaptör ekleyebilirsiniz.
    3. Rotor adaptörleri otomatik DNA/RNA arıtma gerecin yükleme grafik takip santrifüj ayarlayın.
    4. Cihazın kapağı kapatın ve seçin: "RNA" → "Üretici Kit" → "Hayvan, dokuları ve hücreleri" → "Standart bölümü B RNA" → "Başlangıç."
    5. Rapor tamamlandığında, rotor adaptörleri santrifüj dışarı çıkarmak ve tepsiye koyun.
    6. RNA spin sütun 3 konumdan atmak.
    7. 3 konumundaki 30 eluted µL RNA içeren 1,5 mL koleksiyonu tüpler kaldırın ve saklamak −80 ° C.
    8. Reaktif şişe kaldırın.
    9. Rotor adaptör içeriği uygun tehlikeli atık kanallar aracılığıyla atın.
  4. Temiz iş istasyonu
    1. Tüm otomatik DNA/RNA arıtma gerecin aksesuarları, reaktif raflar, tepsi ve diğer herhangi bir yüzey gibi enzimatik olmayan dekontaminasyon çözüm ile kullanın, 10 dakikadır bırakın ve ile durulayın sprey (DI) su deiyonize sonra koyup kuruyuncaya kadar bırakın.
    2. Enzimatik olmayan dekontaminasyon çözüm sprey otomatik araç ile sadece üretici onaylanmış, santrifüj ile birlikte kullanılan tüm yüzeyler içini silin, 10 dakikadır bırakın ve % 70 etanol ile silin. Araç zarar verebilir dekontaminasyon çözümlerin diğer türleri kullanmayın.

3. hedeflenen 16S PCR Set-up

Not: Kurulum 16S PCR için belirlenen ön amplifikasyon çalışma alanı temiz oda içinde bulunan gerçekleştirilir. Reaktifler ve örnekleri hazırlanan ve PCR nüsha (96 toplam nüsha gerçek örnekleri ve ayıklama pozitif ve negatif kontrolleri artı 2 PCR su kontrol dahil 30 örnekleri, her örnek için gerçekleştirmek için sıvı işleyicisi üzerine yüklenen kombine örnekleri ve denetimleri). PCR reaksiyonları toplandı ve kapalı sonra örnek plaka bisiklet için bir sonrası amplifikasyon bölgesinde yer alan bir termal cycler transfer edilir.

  1. Çalışma alanı hazırlama
    1. PCR iş istasyonunuzu temizledikten. Sprey bir RNase, Dnaz, DNA ile kullanılan tüm yüzeyleri decontaminant, DI su tarafından iki kez, takip ve sonunda % 70 etanol.
    2. 16S PCR çalışma hazırlama (bkz: hedefli 16S PCR çalışma) bir doğru örnek liste ve ata farklı barkodlu astar her örnek9. Çalışma sayfası ve (bkz: plaka 1) plaka haritalar yazdırın.
  2. PCR ana karışım hazırlama
    Not: 16S astar seçimi belirli çalışma için ilgi bölge dayanır ve çalışma veya örnek türüne göre değişebilir. Bu nedenle, astar siparişi vermeden önce bu 16S rRNA en iyi hangi alanda ilgi belirli çalışma için mikropların yükselterek onaylamak önemlidir. Yazılı olarak bu 16S V4 bölge amplifikasyon için iletişim kuralıdır. Farklı astar/bölge seçilmişse, termal Bisiklet tavlama sıcaklığı ayar gerektirebilir.
    1. Her şeyi hazırlamak için PCR iş istasyonu içinde çalışmak.
    2. 50-100 µL DNA örnekleri-20 ° c ve gerekli tüm Kimyasalları almak ve onları buz çözme. Girdap ve kısa bir süre spin aşağı.
    3. Astar 5 mikron 20 µL en küçük bir birim içinde çalışma konsantrasyonu için önceden seyreltilmiş.
    4. Yalnızca çalışma sayfasında hesaplama göre ileri astar ile belirli 5 mL tüp ana PCR karışımında hazırlayın.
  3. Robot sıvı işleyicisi otomatik PCR kurulum için hazırlanıyor
    1. Örnekleri, 32-şey gerecin örnek adaptörü almak ve 50-100 µL üretici yönergelerine göre 96-şey plaka haritaya göre DNA örnekleri yükleyin.
      1. Her PCR plaka için temiz örnek tüpte 30 µL PCR su koyarak 2 negatif denetimlerini ayarlayın.
      2. Tüm örnekleri açık konumda kilitli kapaklar ile 32-şey gerecin örnek bağdaştırıcısında yerleştirin.
    2. Ters astar9 için
      1. Belirli Bar kod içeren her ters astar kapağını çıkarın #'tek bir seferde (değişiklik eldiven arasında çapraz bulaşma önlemek için).
      2. En fazla 32 astar gerecin reaktif bağdaştırıcısında yerleştirin.
    3. 96-şey PCR tabak almak ve çalışma adı, örnek numarası, Tarih ve teknisyen baş harfleri ile etiketleyin.
    4. Robot sıvı işleyicisi yükleme
      1. Reaktif adaptör B1 bulunduğu yer. Bir kenar efekti önlemek için dikkatli bir şekilde bağdaştırıcı kavrama tarafına karşı bir kenarına yerleştirin ve yavaş yavaş diğer kenarına getirmek. Adaptörler tüm köşelerinde itmek için emin olun.
      2. Yer konum C1 örnek adaptör. Adaptörler tüm köşelerinde itmek için emin olun.
      3. Girdap 5 mL ana mix, kapağı açın ve pozisyon a cihazın ana mix ve reaktif blok üzerine yerleştirin.
      4. PCR plaka yarı etekli PCR plakaları tutma amaçlı 96-şey gerecin bağdaştırıcısında yerleştirin.
      5. Çalıştır başlatın ve yeni bir dosya olarak kaydedin.
      6. Yönergeleri izleyin ve onay işaretini her sorulduğunda: bir, ipuçları vardır, iki, atık kutusu kullanılabilir ve üç, başla.
    5. Çalışma tamamlandıktan sonra hata iletileri için makine kontrol ederek hiçbir hataları olduğunu doğrulayın.
    6. 12 veya 8 şerit kapaklar, girdap ile plaka şiddetle, mühür ve bir 96-şey plaka spinner kullanarak 1dk için spin aşağı ve buz üzerinde veya buzdolabında yerleştirin.
    7. Ters astar ve örnekleri içeren tüpler kaldırın.
    8. 96-şey plaka sonrası amplifikasyon odasına götürün ve termal cycler ve döngüsü (bkz. Tablo 1) termal Bisiklete binme koşullardan tabloya göre tabağa yükleyin.

4. hedeflenen 16S Post-PCR kalite kontrol Jel Elektroforez için teyp tabanlı platformu kullanarak

Not: Post-PCR kalite kontrol (QC) ve tüm sonraki adımları laboratuar bir belirlenmiş sonrası amplifikasyon alanda yapılmaktadır. DNA otomatik DNA/RNA parça Çözümleyicisinde analiz edilir.

  1. Çalışma alanı hazırlama
    1. İş istasyonu bir RNase, Dnaz, DNA ile kullanılan tüm yüzeyleri decontaminant, DI su tarafından iki kez, ardından püskürtme ve % 70 etanol tarafından nihayet temiz.
    2. Tüm malzeme ve ekipman gerekli toplamak.
  2. Reaktifler hazırlamak
    1. Örnek arabellek ve merdiven 30 dk en az 25 ° c ısı kontrollü vortexer yerleştirin.
  3. Reaktifleri ısınma iken, PCR örnekleri 3 PCR çoğaltır her örnek için bir tek tüp havuzu tarafından hazırlamak
  4. Cihazda örnekleri yükleyin.
  5. Kısaca girdap ve tüpler havuza alınan PCR ürünü ile aşağı spin.
  6. Cihazın 96-şey plaka RT bir raf yerleştirin ve etiketleyin.
  7. Kısaca girdap ve spin örnek arabellek ve merdiven aşağı.
  8. 3 µL örnek arabellek 96 iyi plaka (ihtiyacı en az 53 µL/ekran teyp) her şey için ekleyin.
  9. Örnekleri çift sayıda çalıştırın; Tek sayıda örnekleri, örnek arabelleği 4 µL boş bir kuyuya ekleyin.
  10. Merdivenin 1 µL bir merdiven için de ekleyin.
  11. Harita ekleyin 1 µL havuza alınan PCR ürününün belirlenen için de.
  12. Kapak plakasını folyo mühür ile
  13. Girdap gerecin vortexer ve adaptör 2.000 devir / dakikada 1 dakika kullanarak plaka.
  14. Örnek varsa tüp alt aşağı spin kabarcıklar konum aşağı tekrar çevir.
  15. Yazılımını başlatın.
  16. Ekran teyp ve yükleniyor İpuçları araç yükleyin.
  17. 96-şey adaptörle parçası analyzer içine örnekleri yükleyin.
  18. Koşuya denetleyicisi yazılımıyla ayarlayın.
  19. Hatta numaralı kuyu seçtiğinizden emin olun.
  20. Örnek kimliklerini yazın.
  21. Kontrol edin tüm kuyu ekran teyp gri renkle vurgulanır.
  22. Pipet ipuçları analyzer tanır emin olun.
  23. Başlat'ı seçin ve (ad, örnek numaraları ve Tarih çalışma) sonuçları kaydetmek için bir dosya adı belirtin.
  24. Daha fazla bilgi için üreticinin yönerge bakın.
  25. Çalışma tamamlandıktan sonra ipucu, ekran teyp ve tüpleri atmak.
  26. 16S tepe nM (315-450 bp V4 için arasında) verileri analiz. Bu zirve seçilen astar bağlı olarak değişir.

5. Kütüphane hesaplama, Havuzu, temizlik ve QC

  1. Amplicon boyutu ve Derişim tüm örneklerinin belirledikten sonra havuz son istenen hacim ve nM havuza alınan kitaplığı için elde etmek için kitaplıklarına (bkz. örnek hesaplama).
  2. Temizlik ve silis-zar bazlı bir saflaştırma kullanarak havuza alınan kitaplığı kit PCR ürünlerinin, üretici göre konsantresi ( Tablo malzemelerigörmek) iletişim kuralı.
    1. DNA 50 µL son hacmi ile elute.
  3. Temizlenmiş Kütüphane konsantrasyonu hemen bir yer için bir çift telli DNA yüksek hassasiyet kit kullanarak üreticinin protokole göre ölçmek.
    1. Havuza alınmış ve temizlenmiş Kütüphane 2 µL 198 µL seyreltme arabellek artı boya (1: 100 seyreltme) ile sulandırmak.
    2. Fluorometrik aygıttan ölçülen değeri kaydedin ve seyreltme faktörü göre dönüştürün.
  4. Havuza alınan kitaplığının (ng/µL) okuma konsantrasyon kullanarak, Kütüphane Derişim nm hesaplayın. 1 µL su katılmamış Kütüphane OD260/280 microvolume Spektrofotometre üzerinde ölçmek için kullanın.
    Not: Yeterli saflık kütüphanesinin 1.8-2.0 değeri gösterir.
  5. Sonraki nesil sıralama için hazır kadar son Kütüphane-20 ° C'de depolayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada sunulan Protokolü oluşturulan veri buluşma Protokolü duyarlılık, özgüllük ve kirlenme kontrolü için kriterler emin olmak için önemli kalite kontrol (QC) adımları içerir. Protokolün ilk QC adım PCR güçlendirme 16S V4 bölgesinin (Şekil 2) izler. Bir µL PCR ürününün her örnekten 315-450 bp (Şekil 2, kırmızı ok) beklenen boyut aralığı içinde olduğunu onaylamak için Elektroforez tarafından analiz edildi. Bazı insan sütü örnekle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

16S rRNA, hedeflenen yeni nesil sıralama microbiome karakterizasyonu18için yaygın olarak kullanılan, hızlı bir tekniktir. Ancak, toplu iş etkileri, çevresel kirlenme, örnek Çapraz bulaşma, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik dahil olmak üzere birçok faktör, olumsuz deneysel sonuçlar etkiler ve onların yorumu7,19 yıkmak , 20. en iyi sağlam 16S analizleri kolaylaştırmak için microbiome iş akışları birleştirmek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Helty Adisetiyo, doktora ve Shangxin Yang, doktora Protokolü gelişimi için teşekkür etmek istiyorum. Genel destek için uluslararası anne çocuk ergen AIDS klinik denemeler grubu (IMPAACT) tarafından Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar (NIAID) ulusal kurumları, Sağlık (NIH) Ödülü numaraları altında sağlanan UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) ve UM1AI106716 (IMPAACT LC), Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü çocuk sağlığı ve insan geliştirme (NICHD) ve Ulusal Akıl Sağlığı Enstitüsü (NIMH) ortak fon ile. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AllPrep RNA/DNA Mini KitiQiagen80204DNA/RNA ekstraksiyon kiti
EliminazFisher Scientific435532RNase, DNase, DNA dekontaminant
Termo KarıştırıcıFisher Scientificsıcaklık kontrollü girdap
Tamponu RLT artıQiagen1053393guanidinyum tiyosiyanat lizis tamponu/ Allprep kitinin
bir parçasıß-MerkaptoetanolSigma Aldrich63689-25ML-Fß-ME, disülfid bağlarını azaltarak RNazları geri dönüşümsüz olarak denatüre edecek bir indirgeyici ajandır
LME BoncuklarMP Biyomedikal116914050boncuk tüpü
QIAgen TissueLyzerQiagen85300otomatik numune bozucu adaptör seti
QIAshredder sütunuQiagen79654
QIAgen RB tüpüreticisinin kit içindeki mikrosantrifüj tüpü
QIAcube ve ilgili plastik eşyalarQiagen9001292otomatik DNA/RNA saflaştırma cihazı
DNA exitus plusApplichemA7089enzimatik olmayan dekontaminasyon çözeltisi
EB TamponuQiagen19086elüsyon tamponu
QIAgility ve ilgili plastik ürünlerQiagen9001532robotik sıvı işleyici
PCR suMO BIO17000-5PRIME
HotMasterMixQuantabio2200400
Barkodlu ters astarlarEurofinNo Katalog #tasarlanmış ve sipariş edilmiş
96 kuyulu PCR plakasıABD bilimsel1402-9708
Tapestation 2200 ve ilgili plastik malzemelerAgilentG2964AAotomatik DNA/RNA fragman analizörü
Tapestation için D1000 reaktifleriAgilent5067-5585Numune tamponu ve merdiven bu kitin bir parçasıdır
OneStep PCR İnhibitörü Çıkarma KitiZymo Research50444470PCR inhibitörü çıkarma işlemi üreticinin talimatlarına göre yapılır.
QIAquick PCR Saflaştırma KitiQiagen28104DNA temizleme kiti: PCR ürünlerinin silika membran bazlı saflaştırılması
Qubit dsDNA HS TestKiti Thermo FisherQ32854dimetilsülfoksit bazlı seyreltme tamponu ve boya bu kitin bir parçasıdır.
Qubit FlorometreThermo FisherQ33216
NanoDropThermo Fishermikro hacim spektrofotometresi
MiSeq 300 V2 kiti Illumina15033624/15033626
MiSeqIlluminaKatalog Yok #'ninyeni nesil sıralayıcı

Kaynaklar

  1. Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
  3. Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2(2017).
  4. Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990(2016).
  5. Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
  6. Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
  7. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52(2017).
  8. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561(2017).
  9. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  10. Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
  11. Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
  12. Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
  13. Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
  14. Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
  15. Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
  16. Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588(2016).
  17. Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100(2016).
  18. Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
  19. Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29(2016).
  20. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  21. Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26(2015).
  22. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24(2016).
  23. Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
  24. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564(2014).
  25. Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23(2015).
  26. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
  27. Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487(2014).
  28. Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19(2015).
  29. Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
  30. Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73(2016).
  31. Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
  32. ATCC. Mock microbial communities. , Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

16S SekanslamaD k Biyok tleNumune Haz rlamaN kleik Asit EkstraksiyonuV4 B lgesi AmplifikasyonuK t phane Haz rlamaKalite KontrolKontaminasyon KontrolleriYar Otomatik Protokol

İlgili makaleler