Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

7.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/57009

⸱

9 Nisan 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Cardiovascular Research Institute Maastricht (CARIM), Maastricht University, 2Department of Vascular Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine

Bu makalede

Özet

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Özet

Lökosit yaralanma veya iltihap sitelerine yaralanma veya doku hasarı üzerine alımı son yıllarda incelenmiş ve lökosit yapışma cascade kavramında sonuçlandı. Ancak, lökosit işe dahil tam moleküler mekanizmalar henüz tam olarak tespit edilmiştir değil. Lökosit işe alım enfeksiyon, inflamasyon ve (auto-) bağışıklık araştırma alanında önemli bir konu kalır bu yana, biz temel mekanizmaları yapıştırılması çalışma, de-yapışma için basit bir laminar akış tabanlı tahlil mevcut ve hicret Arteryel ve venöz akışı rejimler altında lökositlerin. Vitro tahlil lökosit ve damar iltihabı farklı modellerde hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı, lökosit ve endotel hücreleri veya görüntülenir ve sonra kaydedilen trombosit etkileşimleri çalışmaya paralel akış odası ve bir ters faz kontrast mikroskobu bir kameraya bağlı kullanarak bir laminar akış tabanlı tahlil açıklar çevrimdışı analiz. Endotel hücreleri, trombosit veya lökosit inhibitörleri veya bu işlem sırasında belirli molekülleri rolünü belirlemek için antikorlar ile pretreated. Kesme koşulları, Yani atardamar veya toplardamar kesme stres, kolayca viskozite ve perfused sıvı akış hızı ve kanal yüksekliği tarafından adapte edilebilir.

Giriş

Yaralanma, iltihap veya enfeksiyon lökosit hızlı patojen veya hasar-ilişkili için moleküler desen (PAMPs, DAMPs), aktif bir duruma değiştirmek ve inflamasyon ve doku hasarı sitelere kan akışı dışarı hareket yanıt. Onların hücresel ve moleküler çevre ile etkileşim olanağı lökositlerin lökosit yapışma eksikliği1gibi genetik bozukluklar tarafından vurgulanmış olarak bağışıklık hücreleri olarak onların doğru işlevi için esastır. Lökosit yapışma son on yıl boyunca yoğun soruşturma konusu olmuştur ve bu erken 1990'larda2,3lökosit yapışma cascade kavramı sonuçlandı. Lökosit yapışma lökositlerin endotel vasküler yüzey üzerinde rulo için hücreleri neden selektin-aracılı yakalama tarafından başlatılır. Bu inişli çıkışlı lökositlerin endotel bağımlı göçmen cues, örneğin, integrinler aktivasyonu teşvik kemokinler için taramak sağlar. Daha sonra aktif integrinler firma lökosit durması sonucu bağlama endotel ligandlar için aracılık. Lökosit daha sonra tarama ve endotel monolayer delici ve temel dokusuna transmigrating önce yayarak extravasate hazırlayabilirsiniz. Kurallı lökosit cascade temel kavramı sunulmasından bu yana büyük ölçüde değişmeden kalmıştır, bazı ara adımlar ile4ekledi. Yine de, tam moleküler mekanizmaları ve lökosit işe dahil birçok oyuncu rollerini şu ana kadar açıklık olmuştur değil ve lökosit işe alım enfeksiyon, inflamasyon ve (auto-) bağışıklık alanında önemli bir konu kalır araştırma.

Örneğin, ateroskleroz gibi vasküler inflamatuar hastalıklar sırasında gemi duvar sürücüler plak gelişme içine lökosit işe arttı. Kararsız aterosklerotik plaklar rüptürü, trombosit ve koagülasyon sisteminin büyük harekete geçirmek ve daha sonra5damar tıkanıklığı. Bu kalp krizi veya felç gibi ciddi kardiyovasküler sonuçlara yol açabilir. Buna ek olarak, klinik olarak, olarak endotel denudation oluşur örneğin bir koroner arter uygulaması sonra yol açar lökosit ve trombosit maruz damar duvar iç (örneğin, matris bileşenleri ve pürüzsüz etkileşimler çok sayıda kas hücreleri) ve vasküler yaralanma kapsayan trombosit ile lökositlerin. Bu etkileşimler monosit-trombosit etkileşimleri neointima oluşumu6,7sürücü olarak daha da geliştirilmesi hastalık için önemlidir. Buna ek olarak, trombosit-lökosit etkileşimleri lökosit integrin Mac-1 (αMβ2) aracılı ve trombosit GPIbα trombozu fareler8roman sürücüleri olarak son zamanlarda belirlenmiştir.

İnsan ve hayvan kan geniş durumu lökosit ve trombosit bir kaynak olarak araştırma ve izole matris molekülleri geniş yelpazede ve lökosit ve vasküler kökenli ölümsüzleştirdi hücre hatları için göz önüne alındığında, lökosit benzetimini yapmak için uygun etkileşimler bir laboratuvar ayarı, özel olarak tasarlanmış akışı perfüzyon Chambers'ı kullanarak akış altında. Adl değişik vakum odaklı kendinden yapışkanlı perfüzyon odalarına kadar geçen on yıl boyunca tasarlanmıştır. Tüm türevleri ortak yönü hareketsiz bölümü (örneğin, kültürlü damar hücreleri veya matris proteinler) önceden tanımlanmış bir kanal perfüzyon sıvıların hareketsiz bölümü üzerinde etkinleştirme ile donatılmış büyük bir sızıntı geçirmez odasına monte var. Buna ek olarak, teknoloji kalıp gelişmeler silis polimerler9tarihinde alan ısmarlama çözümler geliştirme etkin. Viskozite ve perfused sıvı akış hızı ve kanal yüksekliği esas olarak akış perfüzyon aygıt10makaslama stres özelliklerini belirlemek. Bu makalede, biz bir temel mekanizmaları yapıştırılması çalışma, de-yapışma için vitro yöntemi ve Hicret Arteryel ve venöz akışı rejimler altında lökositlerin mevcut. Burada sunulan yöntemleri onlar ortak kamera bağlı floresan mikroskop kullanılarak yapılır ve yüksek teknik yeterlilik Uluslararas› bir Denemecileri gerektirmeyen avantajdır. Vitro tahlil (inhibitörleri ekleyerek veya antikor engellemeörneğin,), birçok yönden manipüle edilebilir ve böylece damar iltihabı farklı modellerinde geçerli ve yapışma incelenmesi protein işlevleri sağlar veya belirli bileşikler değerlendirilmesi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada tıbbi etik ve Maastricht University of hayvan etik kurulları tarafından onaylanmıştır.

1. akış tabanlı tahlil insan hücreleri ile

  1. İnsan kanı düşük trombosit yalıtım
    1. Venöz kan sitrat (% 3,2) antikoagülan çizin.
    2. Asit sitrat dekstroz hacmi 1/15 ekleyin (ACD: 80 mM TRISODYUM sitrat, 52 mM sitrik asit ve 183 mM glikoz) kan.
    3. 350 x g fren trombosit zengin plazma (PRP) elde etmek 15 dakika olmadan, santrifüj kapasitesi.
    4. 15 mL konik tüp süpernatant nakletmek ve eklemek ACD hacmi 1/20.
    5. 1110 g fren trombosit zavallı plazma (PPP) elde etmek 15 dakika olmadan, santrifüj kapasitesi.
    6. Süpernatant atmak. Damlalıklı ipucu (P 1000) sonunda kesti, yapım o geniş, hangi AIDS önleme trombosit aktivasyon delik ve dikkatle trombosit tampon pH 6,6 PRP olarak aynı birimindeki trombosit Pelet askıya (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2.7 mM KCl, 2 mM MgCl2, % 0,1 sığır serum albümin ve % 0.1 glikoz). ACD hacmi 1/20 ekleyin ve karışımı yavaşça.
    7. Trombosit 1110 g fren 15dk için olmadan, cips.
    8. Süpernatant atın ve dikkatli olarak trombosit yukarıda 1 mL trombosit arabellek (pH 7.5) askıya alma.
    9. Bir otomatik Hematoloji analyzer ile 1/10 seyreltme trombosit konsantrasyon ölçmek.
    10. 2 x 107/mL sayısını elde etmek için trombosit arabelleği (pH 7.5) ile ses düzeyini ayarlayın.
  2. Yalıtım polimorfonükleer hücre insan kanı (uyarlama Brinkmann vd. 11 )
    1. Kan 24 mL heparin (10 U/mL) antikoagülan olarak çizin.
    2. 1.077 g/mL yoğunluk polysucrose sodyum diatrizoate orta 6 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) 15 mL konik tüp ve dikkatle üst katmanı 5-6 mL tam kan.
    3. Santrifüj fren olmadan 800 x g de 20 dk için.
    4. Aspire edin ve açık sarımsı üst tabaka atmak ve granülosit taze 15 mL konik tüpler içine içeren alt kırmızımsı faz transfer. Hücreleri son hacmi 14 mL ve santrifüj fren olmadan 300 x g de 10 dakika için 2 mM EDTA içeren PBS ekleyerek yıkayın.
    5. Bu arada, bir yoğunluk gradient orta hazırlamak (örneğin, percoll, bkz: Malzemeler tablo) PBS hisse senedi çözüm x 2 mL 10 ile 18 mL yoğunluk gradient orta karıştırma tarafından çalışma çözüm. Bu çalışma çözüm PBS ile seyreltik (1 x 4.25 mL her biri % 85, % 80'i, % 75, % 70 ve % 65 degrade orta çözümler elde etmek için).
    6. 2 konik tüpler yoğunluğu gradyan ile üst üste orta her yüzde 2 mL katman tarafından hazırlayın. En yüksek konsantrasyon ile başlarlar ve azalan düzende. Tüp katmanları bir su geçirmez marker ile işaretleyin.
    7. Dikkatli bir şekilde her iki hazır degradeler hücre süspansiyonlar 2 mL katman.
    8. Santrifüj vasıl 800 x g dikkatli bir şekilde dengeli bir santrifüj fren olmadan 20 dk için.
    9. Üst katmanı ve % 65 çoğunu Santrifüjü sonra Kaldır katman (ilk halka) ile PBMCs ve interphases % 85 katman kadar kalan beyaz yeni tüpler içine toplamak (ikinci halka, PMN).
    10. Hücreleri PBS 2 mM EDTA ile tüplerin ve santrifüj fren olmadan 300 x g, 10 dk kadar doldurarak yıkayın.
    11. Hank'in arabelleği (pH 7,45), içeren 10 mM Hepes ve % 0,2 insan albumini (tahlil arabellek) 1 mL posalı hücrelerde (genellikle ≥95% olan PMN) askıya alma ve süpernatant çıkarın.
    12. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 1 x 106/mL hücreleri askıya alma.
    13. Floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (Adım 3.3) ile devam.
  3. Yapisan trombosit - ve vasküler hücre-monolayers hazırlanması
    1. Hücre kültür yemek hazırlama (kültürlü hücreleri)
      1. 35 mm hücre kültür yemekleri 1 mL sulandırılmış sıçan kuyruk kollajen (30 µg/PBS 0.2 µm filtre filtre içinde seyreltilmiş mL) ile önceden kat.
      2. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya, kollajen çözüm atın ve bir kez PBS ile çanak yıkama.
    2. Kültür vasküler hücre kültür yemekleri
      1. İlköğretim (örneğin, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) veya (örneğin, EA. ölümsüzleştirdi damar hücreleri ayırma Hy926, SVEC) izdiham içinde bir T75 şişesi 1.5 mL hücre dekolmanı çözümü (örneğin, accutase) ile büyüdü. Hücre dekolmanı çözüm nötralize ve odası sayma bir hücreyle hücre konsantrasyonu belirlemek için uygun büyüme orta 4.5 mL ekleyin. Senaryo Özeti 105 hücre/mL uygun büyüme orta (örneğin, tam endotel hücre büyüme orta) x 0.5 askıya alma.
      2. Hücre süspansiyon 2 mL her 35 mm çanak ekleyin. Oksijen kuluçka %5 CO2 37 ° C'de hücreler (hücre türüne bağlı olarak 24-48 h alarak) izdiham kadar kültür.
    3. Cam coverslip hazırlık (yapışık trombosit)
      1. Bir kez içinde HCl-alkol cam coverslip bırakın (1, 2 M / % 50 v/v).
      2. Coverslip 2 kez ultrasaf su içinde yıkayın.
      3. Coverslip altında N2kuru.
      4. Öncesi kat cam coverslip ile seyreltilmiş sıçan kuyruk kollajen perfüzyon TMMOB kanal konumunu uygun olarak 100 µL tip ı (30 µg/PBS 0.2 µm filtre filtre içinde seyreltilmiş mL).
      5. RT, 30 dk için kuluçkaya, kollajen çözüm atmak ve coverslip 3 yıkama x PBS ile.
      6. Blok kolajen kaplı coverslip HEPES RT. 0,5 h için % 1 BSA ile
      7. Yıkama ve coverslip kuru ve perfüzyon odasına monte edin. Trombosit insan üzerinden veya adım 1.1 ya da 2.1, sırasıyla belirtildiği gibi fare kan ayırma.
    4. Trombosit immobilizasyon
      1. Kanal başına 2 x 107/mL trombosit süspansiyon, 70 µL ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO21,5 saat için kuluçkaya.
      2. Dikkatle yapışık olmayan trombosit engelleme çözüm (HEPES %5 BSA) için en az 30 dk RT. devam, floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (Adım 3.3) ile değiştirin.
    5. Vasküler hücre monolayer uyarılması
      1. Vasküler hücre 10 ng/mL tümör nekrozis faktör α (TNFα) içeren taze medya ile medya değiştirerek CO237 ° C ve %5 4 h için teşvik etmek.

2. akış tabanlı tahlil fare hücreleri ile

  1. Trombosit fare kandan yalıtım
    1. Kardiyak delik üzerinden 21 G iğne (~ 1 mL) kullanarak çizmek kan anestezi (ketamin 80 mg/kg ve medetomidine 0.3 mg/kg) 6-8 hafta-yaşlı fareler (C57Bl/6) sitrat (% 3,2) antikoagülan olarak.
    2. ACD hacmi 1/6 ekleyin.
    3. 220 x g, santrifüj, trombosit zengin plazma (PRP) elde etmek 5 min için orta fren.
    4. Süpernatant (~ 600 µL) 1/3 kırmızı kan hücrelerinin yeni bir tüp transferi
    5. 95 x g 6 min için fren olmadan, santrifüj kapasitesi.
    6. Süpernatant (PRP) aktarmak ve trombosit konsantrasyon Tyrode'nın tampon 1/10 seyreltme ölçmek (TH arabellek: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2.7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, % 0,1 sığır serum albümin ve % 0.1 glikoz) bir otomatik Hematoloji analyzer ile.
    7. Trombosit ACD + 0.1 U/mL apyrase 1/25 hacmi ekleyerek yıkama ve 2,870 g, 2 min için orta fren de santrifüj kapasitesi.
    8. Süpernatant atın ve 600 µL TH arabellek, ACD hacmi 1/10 ve 0.1 U/mL apyrase ekleyin. Damlalıklı ipucu (P 1000) off kesmek, yapım o geniş, trombosit aktivasyon önlenmesinde yardımcı olur ve yavaşça Pelet askıya taşıyordu.
    9. Santrifüj 2,870 g de, 2 min için orta fren
    10. Süpernatant atın ve yavaşça trombosit TH arabellekte askıya alma.
    11. 2 x 107/mL sayısını elde etmek için TH arabelleği ile ses düzeyini ayarlayın.
  2. Yapisan trombosit monolayers hazırlanması
    1. Cam coverslip (yapışık trombosit) 1.3.3 göre hazırlayın.
  3. Trombosit immobilizasyon
    1. Kanal başına 2 x 107/mL trombosit süspansiyon, 100 µL ekleyin ve 37 ° C ve % 5 CO21,5 saat için kuluçkaya.
    2. Dikkatle yapışık olmayan trombosit engelleme çözüm (HEPES %5 BSA) için en az 30 dk RT. devam, floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (Adım 3.3) ile eski yerine koymak ile
  4. Fare trombosit monolayer uyarılması
    1. Önce perfüzyon lökositlerin (Adım 3,3), trombosit Trombin perfüzyon tarafından teşvik (0.5 nM) HHHSA arabelleği için 37 ° C'de 3 dk.

3. floresan etiketleme ve perfüzyon lökositlerin (PMN veya THP-1 insan ve RAW264.7 için veya birincil fare monosit fare akış tabanlı tahlil için)

  1. Floresan etiketleme
    1. Lökosit (1 x 106/mL) hücre permeant yeşil flüoresan nükleik asit leke (1 µM) ile etiketleyin. 37 ° C'de 30 dk için hücreleri kuluçkaya
    2. PBS ile hücreleri tarafından Santrifüjü 300 x g 5 min için de yıkama ve 0.5 x 106 hücre/mL (5 mL test durumuna bağlı olarak akış hızı başına) tahlil arabellekte bir konsantrasyon hücrelere askıya alma.
  2. Akış odası tahlil hazırlık
    1. Lökosit yapışma hücre monolayer Tarih için çanak hücre kültür ortamından atın ve akış odasına topla. Boru şırıngaya takın. İmmobilize trombositler üzerinde lökosit yapışma için mikro slayt şırıngaya takın. Önceden bir su banyosu ile 37 ° c sıcak
    2. Bir perfüzyon şırınga (50 mL), yükleme şırınga tenkıye tutucusu ve pompa çekilme kümesi modu almak. Pompa birimi için 0 mL ve 50 mL şırınga için 26.70 mm çapı ayarlayın.
    3. Tüp tek bir amaç için bir dirsek radarı konektörüne takın. Radarı kilit bağlantı için belgili tanımlık tenkıye yerleştirin ve tüp radarı kilit coupler dirsek radarı konektörüne bağlayın. Ücretsiz tüp ucunu akışı odasına bağlayın.
  3. Lökosit perfüzyon ve yapışma
    1. Lökosit yapışma hücre monolayer Tarih için çanak hücre kültür ortamından atın ve akış odasına topla. Boru şırıngaya takın. İmmobilize trombositler üzerinde lökosit yapışma için mikro slayt şırıngaya takın.
    2. Lökosit perfüzyon ve üzerinde bir vasküler adezyon için-ya da trombosit monolayer, ikinci tüp tahlil tampon ve 1 mL damlalıklı ile boru dolgu içeren bir 50 mL konik tüp içine yerleştirin sonra tüp sıkmak ve akış odasına bağlayın.
    3. Lökosit perfüzyon önce 3 mM CaCl2 ve 2 mM MgCl2 hücre süspansiyon ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
    4. Tahlil arabellek perfüzyon olası hava odası ve kablo kanalları kaldırmak için hücre önce sıvı.
    5. Onları sıkı sıkarak tüp biter kapatın ve hücre süspansiyon, tuzağa üzerinden hava kabarcıkları önlenmesi için tahlil arabellek üzerinden tüp geçiş. İlk hücreleri gelene kadar uygun akış hızı/makaslama stres içeren hücreler sıvı.
    6. Uygun akış hızı/makaslama stres 2 min için hücrelerle sıvı ve 2-6 dk bir ters faz kontrast/Floresans mikroskobu (örneğin, EVOS-FL) ile çalışırken ve yapışık hücrelerinin arasında en az 6 resim yakalama 100 X büyütme kullanarak bağlı bir CCD veya CMOS kamera için.
      Not: Akış odası boyutları ve perfusate viskozite akış hızı/makaslama stres bağlıdır. Burada kullanılan perfüzyon odası için (bkz. Tablo malzeme):
      Τη= * 97.1*Φ
      Τ: yamultma stres (1 dyn/cm2)
      Η: viskozite (0,015 dyn * s/cm2)
      Φ: akış hızı (0.67 mL/dk)
  4. Lökosit de-yapışma
    1. De-adhesion için tahlil arabelleğine hücre süspansiyon gelen tüp hava kabarcıkları sıkışmış olma engelleyen Borulama, sıkarak geçin.
    2. Hücreleri tarafından perfüzyon ile tahlil arabellek uygun akış hızı/makaslama stres (bkz: 3.3.7 Not) ile bağlantısını kesin.
  5. Lökosit hicret
    1. Lökosit hicret için lökosit (Adım 3) sıvı yeterli bir miktar lökositlerin uygun kadar (~ 50 hücreler/görünüm alanı).
    2. Lökosit süspansiyon tahlil arabellek ile değiştirin.
    3. Transmigrating hücreleri zaman atlamalı tarafından her 10-15 s 37 ° C'de 30-60 dk kayıt

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Endotel lökosit yapışma çalışmaya fluorescently etiketli THP-1 hücreleri üzerinde 3 din/cm22 min için TNFα - veya sigara-uyarılmış endotel monolayer periosteum. Yapisan Monositik hücre toplam sayısı perfüzyon 2 dk sonra 6 bağımsız alan 2-6 dk bir süre içinde yakalama tarafından tespit edilmiştir. Yapışık hücreleri en az 6 resimleri bir ters faz kontrast/Floresans mikroskobu (örneğin, EVOS-FL) ele quantified bağlantılı CCD veya CMOS kamera 10 X büyütme kullanarak ve ort...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu vitro tahlil vasküler enflamasyon sırasında lökosit alımı temel mekanizmaları araştırmak için basit bir yöntemdir, ancak dikkat edilmesi gereken bazı kritik nokta. Bu tahlil başarıyla gerçekleştirmek için ilk perfüzyon lökosit bir sağlam ve Konfluent vasküler veya trombosit monolayer gereksinimdir. Bu önceden kaplama kollajen türü olan yüzeylerin tarafından ben elde edilebilir. Genel olarak, birincil damar hücreleri ile çalışırken, yavaşça önerilen collagenase içeren dekolmanı çözüm kullanarak hücreleri ayırm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Biz Drs. Martin M. Schmitt ve satır Fraemohs teşekkür ederim. Bu eser bilimsel araştırma (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Vakfı kan nakli araştırma (LSBR Nr. 1638) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) R.R.K. için ödül için Hollanda Vakfı tarafından desteklenmiştir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ters floresan mikroskobu, örneğin EVOS-FLLife Technologies Europe bv
Pompa örn. modeli: 210-CE  dünya hassas aletleri78-9210W
Falcon 35 mm TC ile İşlenmiş Kolay Kavrama Tarzı Hücre Kültürü Tabağıcorning353001
50 mL şırıngaBecton Dickinson300137
Silikon boru VWR228-0700
Dirsek Luer Konnektör ErkekIbidi10802
Dişi Luer Kilit KuplörüIbidi10823
Akış odasıÜniversite Hastanesi RWTH AachenPatent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strö mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgä ngen an Zelloberflä Çetin. 2005.  
Ibidi yapışkan slayt VI 0.4Ibidi80608
Yapışkan slaytlar için lameller Ibidi10812
Kollajen Tip I, sıçan kuyruğuLife Technologies Europe bvA1048301
Rekombinant İnsan TNF-&alfa;Peprotech300-01A
Peptid 6 için Trombin Reseptör Aktivatörü (TRAP - 6)Anaspec / Eurogentec24191
SYTO 13 yeşil floresan nükleik asit lekesiLife Technologies Europe bvS7575
Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi 10xSigma-Aldrich ChemieH4641
HEPES tampon çözeltisi 1M, sıvıLife Technologies Europe bv15630049
BUMINATE Albümin, %25 Baxter60010
Enjeksiyonluk suB. Braun3624315
Kalsiyum klorür dihidratMerck102382 
Magnezyum klorür hekzahidrat Sigma-Aldrich ChemieM2670
ApyraseSigma-Aldrich ChemieA6535
Primer İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücreleri (HUVEC)Promocell GmbHC-12203
Endotel Hücre Büyüme Ortamı (Kullanıma Hazır)Promocell GmbHC-22010
Primer İnsan Aort Endotel Hücreleri (HAoEC)ATCC  PCS-100-011
Vasküler Hücreli Bazal Ortam ATCCPCS-100-030
Endotel Hücre Büyüme Kiti-BBEATCCPCS-100-040
Primer İnsan Aort Düz Kas Hücreleri (HAoSMC)ATCCPCS-100-012
Vasküler Düz Kas Hücresi Büyüme KitiATCCPCS-100-042
İnsan endotel hücre hattı, EA.hy926ATCCCRL-2922
Dulbecco'lar Modifiye Eagle's Medium (DMEM)ATCC30-2002
Fare endotel hücre hattı, SV 40 dönüştürülmüş (SVEC4-10)ATCCCRL-2181
İnsan Monositik hücre hattı, Ultra-Glutamin ile THP-1DSMZACC-16
RPMI 1640LonzaBE12-702F/U1
Fare monosit/makrofaj RAW264.7ATCCTIB-71
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM), yüksek glikozluGibco11965092
AccutasePromocell GmbHC-41310
PercollSigma-Aldrich ChemieP1644
Histopaque 1119Sigma-Aldrich Chemie11191
10x PBSLife Technologies Europe bv14200075
BD  Sodyum Heparinli Vacutainer Plastik Kan Alma TüpleriBecton Dickinson367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Pıhtılaşma sodyum sitrat %3.2  Greiner Bio455322
HCl/EtOH karışımı (1.2 mol/L HCl ve %50 etanol) su içindeSigma-Aldrich ChemieÇeker ocakta 0.3L HCl (4 mol/L) ile 0.7L %70 v/v etanolü karıştırarak hazırlayın

Kaynaklar

  1. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
  2. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
  3. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
  4. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  5. Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
  6. Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
  7. Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
  8. Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559(2017).
  9. Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
  10. Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
  11. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724(2010).
  12. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586(2013).
  13. Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Laminer Akış AnaliziTrombosit İzolasyonuAkış OdasıKayma GerilmesiEndotel HücreleriFloresan MikroskopiHücre AdhezyonuTümör Nekroz FaktörüTRAP-6 Stimülasyonu
Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.