Bu iletişim kuralı bozulmadan 832/13 beta yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanarak hücreleri glikoz-aracılı değişiklikler doğal bileşikler huzurunda mitokondrial solunum etkisini ölçmek için hedeftir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri
Bu makalede
Özet
Özet
Yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri izole mitokondri, hücre ve dokulara oksijen tüketimi ölçüm için sağlar. Beta hücreleri vücut tarafından kontrol kan şekeri düzeyleri insülin salgılanması yanıt olarak yükseltilmiş glikoz konsantrasyonu ile kritik bir rol oynamaktadır. İnsülin salgılanması glikoz metabolizması ve mitokondrial solunum tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, bozulmamış beta hücre solunum ölçme şeker hastalığı için bir tedavi olarak beta hücre fonksiyonu geliştirmek için önemlidir. Sağlam 832/13 INS-1'i kullanarak beta hücreleri hücresel solunum glikoz konsantrasyonu artan etkisini ölçebilirsiniz türetilmiş. Bu iletişim kuralı bir etkilerini belirlemenize izin vererek çeşitli bileşenleri, başka yerde içinde beta hücre solunum ölçmek için bize izin verir bileşikler sağlam hücre solunum üzerinde verilen. Burada iki doğal olarak meydana gelen bileşikler, monomeric epikateşin ve curcumin, low (2.5 mM) veya yüksek glikoz (16,7 mM) koşulları altında varlığı beta hücre solunum üzerindeki etkisini göstermektedir. Bu teknik, çeşitli bileşikler etkisi olduğu gibi beta hücre solunum huzurunda farklı glikoz konsantrasyonu belirlemek için kullanılabilir.
Giriş
Pankreas beta hücre birincil amacı sistem normoglycemia glikoz uyarılmış insülin salgılanması ile muhafaza etmektir. Beta hücreleri glikoz büyük ölçüde nedeniyle düşük benzeşme, yüksek kapasiteli glikoz taşıyıcı GLUT2 dolaşan fizyolojik değişiklikler hissediyorum (glikoz taşıyıcı 2, Km 16,7 mM)1. Dolaşım Glikoz seviyesi yükseldikçe, bu yüksek kapasiteli düşük-benzeşme ışınlama beta hücre içinde hücre içi glikoz orantılı bir artış kolaylaştırır. Glikoz Glikoliz, TCA döngüsü (tricarboxylic asit döngüsü) ve mitokondrial solunum yükseltilmiş hücresel ATP (adenozin trifosfat) seviyelerinde kaynaklanan metabolize edilir. Yükseltilmiş ATP k....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hücre kültürü
- Kültür INS-1 832/13 beta hücrelerinde RPMI % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1 penisilin-streptomisin, 10 mM HEPES, 2 mM glutamin, 1 mM sodyum Pyruvate ve 0.05 mM 2-mercaptoethanol9,10,11 ile desteklenmiş 1640 türetilmiş ,12,13.
- 832/13 hücreleri bir T75 şişesi 2 mL % 0.25 Tripsin, 8 mL tam RPMI 1640 medya ekleyerek 10 dk. Nötrleştir tripsin için 37 ° C'de kuluçka kullanarak kaldırın.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve adım 1.2 içinde 900 µL PBS, hü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Hazırlanan ve iletişim kuralında tanımlandığı gibi hasat INS-1 832/13 beta hücreleri oksijen tüketimi çeşitli kimyasal müdahaleler (şekil 1A) göre modülasyon gösterecektir. Glikoz konsantrasyonu 16,7 mM glikoz (şekil 1B) arttı zaman solunum bir artış gözlenir. Sağlam hücreleri Oligomycin A. ile tedavi ederken solunum azalacak Bu solunum Bazal, nonphosphorylating solunum durumu olarak tanımlanır kaçak olarak bilinir. Beta hücreleri uncoupling Ajan ETS solunum vey.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu iletişim kuralının amacı olduğu gibi pankreas beta hücrelerinde solunum oranları ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanmaktır. Bu yöntem beta hücre yanıt olarak artan şekeri ölçüm sağlar. Protokol için de Önarıtma ile çeşitli bileşenleri, bu doğal olarak meydana gelen monomeric epikateşin veya curcumin4,5iletişim kuralıyla gösterildiği gibi sağlar. Bu iletişim kuralı ' (burada görüldüğü gibi) ön veya minima.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Yazarlar Yardımcısı ve bilimsel tartışma Tessem ve Hancock Labs'in üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar Andrew Neilson, doktora (Virginia Tech) kakao türetilmiş epikateşin monomer kesir verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu çalışmada JST için bir hibe-diyabet eylem araştırma ve Eğitim Vakfı tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| O2k Çekirdeği: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Yüksek çözünürlüklü respirometri cihazı |
| DatLab 6 Programı | Oroboros Instruments | 27141-01 | Yüksek çözünürlüklü respirometri analizi için bilgisayar programı |
| INS-1 832/13 hücre hattı | Duke Üniversitesi Tıp Merkezi | YOK | Beta hücre hattı, Dr. Christopher Newgard |
| Curcumin'den | hediyeSigma | C7727 | Beta hücrelerinin ön tedavisi |
| Kakao epikateşin monomeri | Virginia Politeknik Enstitüsü ve Eyalet Üniversitesi | YOK | Beta hücrelerinin ön işlemi, Dr. Andrew Neilson'dan hediye |
| Tripsin | Sigma | T4049 | Hücre kültürü için |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | 832/13 beta hücre ortamı |
| Fetal Sığır Serumu | Hidroklonu | SH30071.03 | 832/13 beta hücre ortamı bileşeni |
| Penisilin-streptomisin | Sigma | P4458 | 832/13 beta hücre ortamı bileşeni |
| HEPES | Sigma | H3662 | 832/13 beta hücre ortamı bileşeni / 1x SAB Tampon |
| Glutamin Keson | GLL01 | 832/13 beta hücre ortamı bileşeni | |
| Sodyum Piruvat | Sigma | S8636 | 832/13 beta hücre ortamı bileşeni |
| 2-Merkaptoetanol | Sigma | M3148 | 832/13 beta hücre ortamı bileşeni |
| NaCl | Fisher | S271 | 10x SAB tamponunun |
| KCl | Sigma | P9541 | 10x SAB tamponunun bileşeni |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | 10x SAB tamponu |
| MgSO4 | Sigma | bileşeniM2643 | 10x SAB tamponu |
| bileşeni D-(+)-Glikoz Çözeltisi | Sigma | G8769 | 1x SAB tamponunun bileşeni, solunum tahlili için kimyasal |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | 1x SAB tamponunun bileşeni |
| %35 BSA Çözeltisi | Sigma | A7979 | 1x SAB tamponunun bileşeni |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1x SAB tamponu |
| 200 geçirmez etanol | Sigma | 459844 | Yıkama Oksigrafı O2k Odaları |
| Bileşeni Oligomisin A | Sigma | O4876 | Solunum tahlili için kimyasallar |
| FCCP | Sigma | C2920 | Solunum tahlili için kimyasallar |
| Anitisin A | Sigma | A8674 | Solunum tahlili için kimyasallar |
| BCA Protein Kiti | Thermo Fisher | 23225 | Protein konsantrasyonunun belirlenmesi için |
Kaynaklar
- Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Daha fazla makale keşfet
