Laboratuvar konut, turkuaz Killifish (Nothobranchius furzeri) için bir iletişim kuralı

Özet

Laboratuvar muhafazasını turkuaz ev ve verimli bir şekilde standart Zebra balığı özellikleri için kullanılan aynı altyapı istihdam Merkezi su filtrasyon sistemi, bireysel balık binlerce yükseltmek killifish ölçeklendirilecektir. Burada verimli killifish bakım izin standart yordamların listesini ayrıntılı.

Özet

Deneysel amaçlar için kullanılan modeli laboratuvar balık yetiştiriciliği uygulamaları geliştirme modeli sistemleri, Zebra balığı ve medaka gibi başvuru balık kurulması büyük ölçüde yararlanmıştır. Son yıllarda ortaya çıkan bir balık-turkuaz killifish (Nothobranchius furzeri) – alanları araştırma grupları Biyoloji yaşlanma ve ekoloji, giderek artan sayıda tarafından kabul edilmiştir. Esir bir yaşam süresi 4-8 ay ile bu tür shortest-lived omurgalılar esaret kaldırdı ve yaşlanma oranı ve yaşam beklentisi değişikliklere yol açabilir testinde – kısa bir süre – deneysel müdahaleler bilimsel topluluk sağlar. Embriyonik diapause tarafından karakterize bu tür benzersiz Biyoloji verilen patlayıcı cinsel olgunlaşma, işaretlenmiş morfolojik ve davranış cinsel dimorfizm - ve onların nispeten kısa yetişkin yaşam süresi - özel yetiştirme uygulamaları içinde acil vardır isteğe bağlı. Bu iletişim kuralı en iyi turkuaz killifish laboratuvar Bakımı, etkinleştirme bu tür güçlü laboratuvar hayvan modeli olarak benimsemeye bilimsel topluluk izin anahtar yetiştirme önlemleri kümesini raporlar.

Giriş

Hızlı yaşam döngüsü ve kısa yaşam süresi göz önüne alındığında, turkuaz killifish Biyoloji^1,2,3' te bir umut verici yeni model organizma olarak hızla büyüyor. Bu tür benzersiz bir yaşam döngüsü embriyonik diapause, hızlı cinsel olgunlaşma ve bir genişletilmiş post-reproductive hayat sahne^4,5oluşan bir teleost için karakterizedir. Son iş bu tür Biyoloji hem tutsak hem de vahşi^6,7elucidating için katkıda bulunmuştur. Turkuaz killifish live mevsimlik taze su organları oluşturan Zimbabve ve Mozambik Afrika savana yağışlı sezon sırasında. Kuru sezonunda embriyo su diapause denilen bir stres dayanıklı hayat sahne sayesinde yokluğunda kuru çamur içinde hayatta kalmak.

Genetik haritalar bu tür için oluşturulan^8,9edilmiş ve son zamanlarda onların genom sıralı ve monte^10,11oldu. Birkaç doğuştan laboratuvar balık suşları geliştirdik ve transgenesis ve CRISPR/Cas9 yolu ile düzenleme genom elde edilebilir içinde bu tür, turkuaz killifish rekabetçi laboratuvar omurgalı model organizma ^{teşvik fiili haline gelmiştir 12,13,14}.

Her ne kadar bu tür¹⁵için yayımlanmış bir laboratuvar protokol, mevcut protokolünde biz özellikle yaşlanma ve hayatta kalma araştırmak Etüdleri amaçlayan deneysel laboratuvar kuralları kapsamlı bir listesi geliştirmek. Mevcut Protokolü araştırmacılar Zebra balığı ve medaka yetiştiriciliği ile zaten tanıdık turkuaz killifish çiftçiliği anahtar ayarlamalar en az sayıda benimseyerek usta olmak için sağlar. Aynı zamanda, araştırmacılar balık yetiştiriciliği gerekli araçları ile deneyiminiz olmadan gelişen bir turkuaz killifish koloni yükseltmek için bu iletişim kuralı sağlar.

Protokol

Balık bir su devridaim sistemi 28 ° C'de kaldırdı (bkz: su parametreleri), % 10-20 günlük su bertaraf ile. Üç farklı tank boyutu önerilir: 0, 8 L, 2.8 L ve 9,5 L. Her tank 2 mL/sn sürekli su akışı alır.

1. reaktifler hazırlık (malzeme dahil değildir)

Not: Afrika turkuaz killifish (Nothobranchius furzeri) bir kurulan laboratuvar stoktan sağlanabilir. Yıllık killifish kuruma dayanıklı embriyo posta ile gönderilebilir. Embriyo 8-30 ° C sıcaklık aralığında sevk etmek önemlidir.

1. HÜMİK asit (kuluçka) çözüm sisteminde 1 g/L Hümik asit çözülerek su hazırlamak. Basınçlı kap ve stok ilâ 10 hafta için 4 ° C'de.
2. HUFA Artemia zenginleştirme hazırlamak için tuzlu su karides hatcher tuzlu karides çözeltinin konsantrasyonu 500 µL/M, günlük HUFA zenginleştirme ekleyin.
3. Metilen mavisi çözüm 100 µL/M Metilen mavisi hisse senedi çözüm daha önce autoclaved sistem suda çözülerek hazırlayın. Metilen mavisi ışığa duyarlı olduğu için çözüm karanlık şişelerde tutmak veya folyo ile kapatın. Mağazada RT.
4. Hindistan cevizi lifi katı substrat embriyo kuluçka için hazır olun. Alternatif olarak, bir filtre kağıdı (bakınız Bölüm 1.5) kullanın.
   1. Hindistan cevizi fiber distile su ile presoak. Basınçlı kap ve 4 ° C ilâ 5 hafta boyunca dükkanda.
   2. Embriyo transferi günü, Petri kabına nemli Hindistan cevizi lifi ile hazırlayın.
   3. Hindistan cevizi fiber duman başlık altında ve kirlenme mantar ve bakteri azaltmak için bir alev yanında 90 mm çap Petri kabına doldurun.
   4. Hindistan cevizi lifi steril doku ile 1 cm yüksekliği için kompakt. Nem çoğu Hindistan cevizi fiber bir kağıt havlu kağıt fazla suyu absorbe izin plaka üstüne basarak kaldırın. Metal bir kaşık ateşte ve Hindistan cevizi lifi tüm yüzey üzerinde bastırın. Bu Hindistan cevizi lifi mantar/bakteriyel kontaminasyon engeller.
5. Filtre kağıt embriyo kuluçka için sağlam bir substrat hazırlayın.
   1. Embriyo transferi günü, 90 mm Petri kabına uygun filtre kağıdı disklerin 3 kat yerleştirin. 5 mL nem tutmak için Hümik asit çözeltisi ekleyin.

2. üreme

1. Turkuaz killifish zorlanma bakım için ıslahı
   Not: bu protokolü sonrası tarama ve verimlilik tepeler arasında 7-9 hafta ~ 4 haftalıkken cinsel olgunluğa ulaşılır. Verimlilik besleme frekans ve gıda kalitesi bağlı olduğuna dikkat edin önemlidir; Bu nedenle, tank doğurmak başına günde en az iki besleme embriyo verim (bakınız Bölüm 5.6) artırmak için önerilir
   1. 9,5 L üreme tank kurulum. Sistem su ile doldurun ve bir erkek ve iki kadın balık ekleyin.
   2. Erkek Afrika turkuaz killifish kadın taciz için yol açabilecek, çiftleşme sırasında egemenlik görüntüleme gibi bir erkek dişi Çiftleşme stresi azaltmak ve üreme çıkış artış daha biraz daha küçük vücut boyutu seçin. 5-hafta-yaşlı erkek 6/7-hafta-yaşlı kadın ile ayarlayın.
   3. Plastik konteyner (10 x 10 x 5 cm) son ~ 2-3 cm derinliğe ulaşan autoclaved kum ile doldurun ve kum kutu üreme tank ortasına yerleştirin.
   4. Killifish sürekli olarak doğurmak ve embriyo haftada embriyo kuluçka için hasat Turkuaz izin.
      Not: Kum substrate kullanımı Merkezi filtrasyon sistemleri için zorluklar teşkil etmektedir ve alternatif yöntemlerle gelecekte değiştirilmesi gerekir. Olası alternatifler tankları damızlık Zebra balığı kullanımı olabilir.
2. Üremek için transgenesis
   Not: embriyo enjeksiyonlar için kullanmak için bir-cep-aşamada eşitlenmesi gerekir, ve bu döllenme hemen ardından toplanan gerektirir.
   1. Enjeksiyon ve transgenik satırlarının üretimi için kullanılacak bir hücre aşamalı embriyo hasat için bir erkek ve iki kadın balık (aynı aynı derecede 2.1.) üreme tankla ayarlayın.
   2. İki gün önce embriyo koleksiyonu, erkek bireysel bir tank yalıtmak ve erkek yetişkin kadın ile görsel temas içinde tutmak.
   3. Toplama günü, erkek ve bir kum kutusu üreme deposuna eklemek ve onları için 2 h spawn.

3. embriyo yetiştiriciliği

1. Embriyo koleksiyonu
   Not: Embriyo koleksiyonu eleme ve embriyo kum kutusundan hasat tarafından gerçekleştirilir. Normal şartlar altında 200 embriyolar için 30'dan itibaren her kum kutusu içermelidir.
   1. Toplama günü, kum kutu üreme tankından kaldırın. Bir süzgeç (~0.9 mm baskı boyutu) kum kutusu boş ve sistem su ile durulayın. Bu kum ısıyla için toplamak için a büyük tank üzerinde yapılabilir.
   2. Kısmen süzgeç sistem suya daldırın ve yavaşça, ortasında gruplamak için embriyo icar girdap.
   3. Embriyo 10 mL Pasteur pipet ile toplamak.
   4. 90 mm ~ 40 mL sistem su kabında embriyo transfer edin.
   5. Embriyo Petri kabına bir ışık stereomicroscope altında incelemek ve rüptüre koryon ve hasarı belirtileri göstermek kaldırın.
   6. Doğrudan embriyo ağartmadevam edin.
      Not: Her zaman potansiyel çapraz-zorlanma embriyo contaminations önlemek için balık zorlanma başına bir süzgeç kullanın.
2. Ağartma embriyo
   Not: Embriyo ağartma mikroorganizmaların kuluçka medya kirletici içindebalık tank mevcut engeller.
   1. Beyazlatma önce tek kullanımlık bir Pasteur pipet sistem su toplanan embriyo içeren Petri kabına kaldırmak için kullanın.
   2. İstenmeyen mantar ve bakteri büyüme engellemek için toplanan embriyo 50 mL taze hazırlanmış H₂O₂ (%1 autoclaved sistem su v/v) ekleyin.
   3. 50 mL solüsyon içinde 90 mm Petri yemeklerinde düşük bir hızda embriyo 5 min için salla.
   4. H₂O₂ çözüm tek kullanımlık Pasteur pipet ile kaldırın ve embriyo 5 min ile 50 mL Metilen mavisi çözüm için üç kez yıkayın. Metilen mavisi çözüm kaldırın.
   5. H₂O₂ (%1 autoclaved sistem su v/v) 50 mL embriyolar için ekleyin ve 5 min için çalkalanır.
   6. H₂O₂ çözüm kaldırmak ve 50 mL Metilen mavisi solüsyon ile 5 min için üç kez yıkayın.
   7. Embriyo 28 ° C'de zaman uyumlu embriyo geliştirme, 90 mm 40 mL Metilen mavisi çözeltisi kabında başına 100 embriyo maksimum yoğunluğu artırmak için kuluçkaya.
      Not: embriyo kuluçka beyazlatma çözümünde uzatmak değil. Bu yumurta koryon zarar ve embriyo ölümleri artırmak. Embriyo ağartma büyük fiziksel-kimyasal değişiklikler değiştirilmiş koryon fizyolojisi ve başarı kuluçkalık neden olabilir yumurta koryon neden olabilir.
3. Embriyo kuluçka Metilen Mavili
   Not: Sıvı kuluçka Metilen mavisi çözümde parazit büyüme engeller ve ölü embriyo ve döllenmemiş yumurta olarak algılanmasını sağlar.
   1. Canlı sağlıklı embriyoların yaşama etkileyen mantar ve bakteri kontaminasyonu önlemek için Petri kabına (Metilen mavisi tarafından mavi lekeli) herhangi bir ölü embriyo kaldırma inkübe embriyo bakarak kontrol edin.
   2. Eski Metilen mavisi çözüm kaldırın ve taze çözüm ile değiştirin.
   3. Petri kabına 28 ° C İnkübatör (şekil 1A) döndürür. 7-10 gün içinde geliştirilen embriyolar görünür siyah gözleri göstermek emin olun. Bu embriyolar transfer Hindistan cevizi lif veya filtre kağıdı katı substrat orta (şekil 1B).
   4. Metilen mavisi gelişmemiş embriyo korumak, her gün izlemek ve siyah gözleri geliştirdik katı substrat ortamına aktarmak.
   5. Embriyo görünür siyah gözlerin kadar adımları 3.3.1-3.3.3 her gün tekrarlayın.
      Not: Embriyo sürekli maruz kalma Metilen mavisi yetişkin balık fizyolojisi uzun vadeli değişiklikler neden olabilir.
4. Filtre kağıt embriyo transferi
   Not: Turkuaz killifish embriyoların doğal koşulları recapitulating bir kuru yüzey üzerinde gelişebilir. Ayrıca, Kuru embriyo kuluçka araştırmacılar ve onları aynı günde yumurtadan embriyo senkronize sağlar.
   1. Geliştirilen embriyolar görünür siyah gözleri 7-10 gün içinde olacak gibi önceden hazırlanmış filtre kağıdı plaka üzerine Metilen mavisi çözümden embriyo transfer etmek için bir tek kullanımlık Pasteur pipet veya ince kavisli cımbız kullanın.
   2. 90 mm plaka (şekil 1B) başına 100 embriyolar kadar Forseps ile embriyo ~ 5 mm apart yaymak.
   3. Petri kabına parafilm ile kapatın.
   4. 2-3 hafta, onlar tamamen altın süsen geliştirdik ve (şekil 1 c) tarama için hazır kadar embriyo 28 ° C'de kuluçkaya.
      Not: kuluçka hazır kapak embriyo canlılığı önemli ölçüde azaltılmış olacak gibi 2 hafta daha uzun süre uzatmak değil.
5. Embriyo transferi için Hindistan cevizi lifi
   Not: Autoclaved, steril Hindistan cevizi fiber (veya organik torf yosun) katı substrat kuluçka için geçerli bir alternatif aracı olarak kullanılabilir.
   1. Metilen mavisi çözüm kullanıma hazır Hindistan cevizi lif levha üzerine embriyo transfer için bir tek kullanımlık Pasteur pipet veya ince kavisli cımbız kullanın.
   2. Embriyo ~ 5 mm ayrı, 90 mm plaka (şekil 1B) başına 100 embriyolar kadar yayıldı.
   3. Petri kabına parafilm ile kapatın.
   4. 2-3 hafta, onlar tam olarak (örneğin, şekil 1 c) altın süsen geliştirdik kadar embriyo 28 ° C'de kuluçkaya.
      Not: (en çok bir yıl) uzun süreli depolama için embriyo 3 gün sonrası koleksiyonu Metilen mavisi çözümlerinden 17 ° C'de bir katı substrat tabak transfer Onlar siyah gözleri geliştirmek kadar embriyo kuluçkaya.

4. turkuaz Killifish çıkım

Not: Turkuaz killifish embriyo başarıyla Hümik asit solüsyonu¹⁴' te yumurtadan.

1. İnce kavisli cımbız kullanarak, transfer dikkatle 50-100 embriyo 4 ° C'de Hümik asit solüsyonu ile dolu tarama kutusu Gelişmiş HÜMİK asit solüsyonu sistem suda 1 g/L Hümik asit oluşur. Basınçlı kap ve stok ilâ 10 hafta için 4 ° C'de. Tüm embriyoların tamamen batırma vardır emin olun. HÜMİK asit solüsyonu sığ, 2 cm daha derin olması gerekir.
   Not: Tarama Hümik asit solüsyonu düşük sıcaklık artırır ve embriyoların çözüm Komple daldırma eşitlenmiş tarama sağlar.
2. Tarama kutusunu 28 ° C kuluçka kuluçka yerleştirin. Damızlık kutu kapak ile örtmek. Yeterli havalandırma tedarik boru hava kaynağı ile tarafından tarama kutusu bağlayın.
   Not: Kuluçka sırasında yetersiz havalandırma sonuçları fry gaz mesane doldurmak mümkün değil yüksek oranda ("göbek-kaymak" fenotip, bölümünde 5.1 nota bakın)
3. Tarama, ertesi gün kuluçka kutusunun yeterli su kalitesini korumak için autoclaved sistem su oranı 1:1, günde bir kez son 2 cm derinliğe tutmak ekleyin.
4. Geri katı substrat kuluçkaya embriyo transfer ve bir hafta sonra yumurtadan girişimi.
   Not: Tarama, turkuaz killifish alımı için kolayca yeteneğine sahiptirler ve canlı gıda tüketmek. Optimal büyüme için günde iki kez fry aşırı taze taranmış tuzlu karides (Artemia salina) ile beslenir. Tam doyma Fry turuncu renkli abdomens 10-15 dk sonra her beslenme işaretidir. Pasteur pipet günlük olarak kullanarak aşırı, yenmeyen ve ayrıştırılmış tuzlu karides dışarı sifon.

5. çocuk ve yetişkin balık yetiştirme

1. Beş gün sonrası kuluçkalık, gençlere su yeniden dolaşım sistemi için hareket. Tek kullanımlık plastik Pipetler (ya da plastik kaşık), dikkatli bir şekilde kullanarak transfer beş gençlere başına 0, 8 L tank 400 µm fry ekran (Şekil 2) ile donatılmıştır.
   Not: Bu Juvenil killifish bir kısmını şiddetli malformasyonlar neden değil doğru yüzdürme ulaşan, onları sürekli yüzmek zorunda balık tarafından karakterize bir tipik "göbek-kaymak" fenotip, sonuçlanan gaz mesane dolu değil ki mümkündür yetişkin balık. Bu balıklar hayatta kalma deneyleri için veya verimli ıslah için kullanılamaz ve sansür gerekiyor.
2. Gençlere günde iki kez fazla taze taranmış tuzlu su karidesli 14 gün öncesine kadar sonrası kuluçkalık besleme. Enkaz her tank altından dışarı günlük sifon.
3. Yaş 14 gün transferi çocuksu balık 2.8 L tank için bir 850 µm fry ekran formatına sahip. Bu noktadan itibaren her tank balık kimlikli, kapağı Tarih, zorlanma bilgi, Balık cinsiyet ve balık kimlik numarası (şekil 3) gösteren etiket. Hayatta kalma deneyleri için tek tek her balık, bu noktadan itibaren tek tanklarında ev.
4. Aşağıdaki 7 gün için günde iki kez gençlere ~ 2 mL tuzlu karides balık başına ile beslenir. Bu aşamada balık 1-3 canlı kan solucanlar ile takıma girebilir (kan solucan larva balık için çok büyük olduğu durumlarda bir tıraş bıçağı ile daha küçük parçalara doğrayın). Su kalite bozulmasını önlemek için yenmeyen gıda ve haftada iki kez ek atık dışarı sifon.
5. 3 hafta sonra tarama sonra fry ekran tank arkasından kaldırmak ve ~ 2 mL tuzlu karides ve 0.5 mL kan solucan günde iki kez her Balık beslemek başlamak. Bu aşamada, gençlere 1 cm vücut büyüklüğüne ulaşmış olmanız gerekir ve tam boyutlu kan solucan sindirerek yeteneğine sahip olmalıdır.
6. 4 haftalıkken ~ 2 mL tuzlu karides ve 1 mL kan solucan günde iki kez her balık yemi. Kadın bir yoğunluğu 2.8 L tank başına 3 kadın, ortak barındırılıyor olabilir.
7. Bu aşamada balık tam cinsel olgunlaşma ulaşmak emin olun. Renklendirme erkeklerde belirtileri ile büyük dorsal, anal ve caudal fins varlığı için kontrol ve abdomens içinde dişi yumurta dolu yuvarlak.
   Not: hayatta kalma kohort çalışmaları için bireysel tankları yetişkin balık yetiştirme olumsuz balık davranış ve sağlık etkileyebilir. Ancak, grup konut hayatta kalma kohort çalışmaları için sıkı sosyal hiyerarşileri için önde gelen sosyal hakimiyet ve erkek bölgede kurulması nedeniyle önemli karıştırıcı faktörlerin ekler.

6. besleme

Not: Laboratuvar turkuaz killifish-ebilmek var olmak fed bebek brine karides (Artemia salina nauplii) ve kan solucan (Chironomus spp. larva) birleşimidir. Turkuaz killifish fry sadece bebek brine karides beslenir. Çocuk ve yetişkin balık günde iki kez beslenen tuzlu karides ve kan solucan (Şekil 2). İdeal olarak, balık-ebilmek var olmak fed günde birden çok kez, 2 feedings aşan bu protokol için gösterilir.

1. Tuzlu su karides kültür
   1. 10 L Ters Ozmos (RO) su ve 350 g Kızıldeniz tuz tuzlu karides hatcher ekleyip bir havalandırma tüpü ile havalandırma tarafından çözülür.
   2. Kültür çok doymamış yağ asidi (HUFA) 5 mL ile zenginleştirmek.
   3. Tuzlu su karides kistler 20 g tarama çözüm ekleyin. Tuzlu su karides kistler suyun üzerinde yüzer yapmak ve uygun oksijen ve kan dolaşımı kültür sağlamak bakarak kontrol edin.
      Not: Kuru tuzlu karides kistlerin günlük aliquots 4 ° C'de saklanabilir
   4. Öğleden sonra ertesi gün, kültürü ile 5 mL HUFA de başka bir aliquot kaynağı.
2. Taranmış tuzlu karides hasat
   Not: başlangıç ile Kültür ~ 36 h sonra tuzlu su karides (biçim II faz) hasat için hazırsınız demektir.
   1. Hatcher altındaki musluk kullanarak bir kap içinde kültürünün 5 L toplamak ve 10 dakika oturup bekleyin.
   2. 10 dk sonra tuzlu su karides kabuğu (kahverengi renk) 5 L konteyner en baştan çıkarmak ve bir ağ üzerinden taranmış tuzlu karides (turuncu renk) filtre. Sigara yumurtadan yumurta ve ölü tuzlu karides içerdiğinden konteyner alt kısmında bulunan tortu dışlamak için dikkat edin.
   3. 2 lt konteyner içine taranmış tuzlu karides RO su ile durulama ve 10 dakika oturup bekleyin.
   4. 10 dakika sonra tekrar bir kafes ile tuzlu su karides filtre ve 2 L RO su toplamak.
   5. Tuzlu su karides çözüm sigara yumurtadan kistler ve tuzlu su karides kabukları boşalana kadar önceki üç adımı yineleyin.
   6. Tuzlu su karides 2 L kapsayıcıdan beslenme için sıkmak şişe içine aktarın.
      Not: tuzlu karides kültürü oldukça sağlam ve güvenilir. Ancak, tuzlu su karides başarısız çıkım durumunda sıkıntısı önlemek için daha küçük (500 mL) yedek tekneleri kullanılabilir.
3. Yedek hatcher kurma
   1. Kırmızı deniz tuzu RO su 500 ml 17,5 g Havalandırma tarafından çözülür.
   2. Kültür HUFA 500 µL ile zenginleştirmek.
   3. Tuzlu su karides kistlerin 2 g ekleyin.
   4. 18-24 saat sonra bir kez daha HUFA 500 µL ile Kültür kaynağı.
      Not: tuzlu karides ~ 24 h sonra hasat hazırdır.
4. Canlı kan solucan hazırlanması
   1. Hemen besleme önce uygun bir miktar kan solucanın RO su kullanarak bir süzgeç aracılığıyla filtre.
      Not: Canlı kan solucan 4 ° C de 7-10 gün boyunca saklanır.
   2. Plastik bir kaba RO su küçük bir miktar kan solucanı durulayın.
   3. Bir plastik Pasteur ile pipet (dar uç) kaldırıldı, beslenme için kan solucan karışımı hallet.
      Not: Laboratuvar killifish kolonileri canlı gıda ile un kontrollü kaynaklardan besleme dış contaminations için bir risk parazitler ve potansiyel patojenik mikrobiyal topluluklar ekler. Gelecekte, bir geçici steril balık besleme geliştirilmelidir.

7. killifish laboratuvar zorlanma Genotipleme

Not: kullanılan⁹ (Tablo 1) belirli genetik (microsatellite) işaretleri de seks her zorlanma içinde belirlemek için turkuaz killifish suşları arasında ayırt etmek için olabilir.

1. Örnekleme
   1. Balık içinde ıslak sünger üst kısmında bir ağ güvenli tutmak.
   2. Operculum balık vücuttan pamuk temizleme bezi kullanarak Kaudal fin için 2-3 ölçekten temizle.
   3. Pamuklu çubuk ölçekten almak ve 2-3 ölçekler NaOH solüsyon içeren 1 mL tüp içinde transfer (200 µL 0,5 mol/M NaOH, % 1 β-Mercaptoethanol ve % 0,5 polivinil pirolidon).
   4. PCR tüpleri 15 için spin s ölçekler tamamen NaOH çözümde batırma vardır emin olun.
2. Genomik DNA izolasyon
   1. Örnek 95 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
   2. Serin RT, Örnek 1 hacmi 1/10 ile nötralize M Tris-HCl, pH 8.0.
   3. Örnek için tam hızda 5 dk santrifüj kapasitesi.

8. su parametreleri

Not: Hayvancılık kullanım amacı olan yetişkin fenotipleme olduğunu organizmaların yaşam süresi boyunca son derece kararlı yetiştirme şartları hedef türler gerektirir. Bu nedenle, turkuaz killifish gibi su organizmalar kültür su parametreleri sıkı denetim gerektirir. Ek 4-adımlar ile su devridaim filtrasyon su, bütün tankları ile aynı su şartları zamanla sağlayan su parametreleri üzerinde kontrol ulaşmak için sağlam bir temel sağlar. Bu sistem su ticari deniz tuz ve sodyum bikarbonat ile eklendi Ters Ozmos (RO) sudan reconstitute için tavsiye edilir.

1. Su sirkülasyon sistem düzeni: ilk olarak, atık-balık sudan tüm un yenmiş gıda artıkları ve daha büyük parçacıkları yakalar katı parçacıklar metal filtre akar tankları. Metal Filtreler haftada üç kez durulanır; İkinci olarak, ilk mekanik filtrasyon su büyük karterleri iletti ve sonra nerede bakteri nitrites ve nitrat amonyak dönüştürmek bir biyolojik pompalanır; Üçüncü olarak, biyolojik daha hassas boyut parçacıklar tuzak 25 µm filtre kollu için su pompalanır. Son olarak, su bakteri ve virüsler sterilize ultraviyole (UV) lambaları ile su akar. Aşağıdaki dört adımları, balık tank için filtrelenmiş su verir.
2. Mikroorganizma büyüme Tanklardaki azaltmak, nitrat birikimi önlemek ve azaltmak için genel olarak tuzluluk, 10-%20-in sistem su üstünde a günlük temel atıldı.
3. Su sıcaklığı sabit 28 ° c, su pH sabit 7.0-7,5 Aralık içinde korumak.
4. Oodinosis, önlemek için çeşitli tuzluluk Killifish tahammül rağmen iletkenlik aralığı 650-710 mikro-Siemens içinde korumak. Bir yıl süren 12 h ışık/karanlık döngü koloni sağlık ve verimlilik sağlar.
   Not: Killifish su iletkenliği 1500 mikro-Siemens kadar dayanabilir.

Sonuçlar

Medyan sağkalım GRZ zorlanma (örneğin şekil 4A) haftada 12-18 arasında değişen turkuaz killifish uygun hayvancılık sonuç. Medyan sağkalım varyasyonları frekans beslenme ve sıcaklık koşullarında konut rejime bağlıdır. Zavallı yetiştiriciliği hayatta kalma eğriler sunmak sonuçlarında erken mortalite ve birkaç dönüm noktaları (şekil 4B) tarafından karakterize yaşam boyunca zaman, tekrarlayan, ani damla arttı.

Şekil 1: temsilcisi embriyonik gelişim dönemleri ile ilgili kuluçka substrat. (A) taze embriyolar, metilen mavisi çözüm kuluçka 28 ° C'de inkübe toplanan (B) embriyo katı ortamına aktarılması hazır ya kağıt veya Hindistan cevizi lif filtre. (C) embriyo yumurtadan için tipik altın süsen görüntüleme hazır. Ölçek çubuğu 1 mm. için eşit olan Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: turkuaz killifish sonrası gelişim çıkım dönemlerinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: temsilcisi balık ID etiket 3üncü itibaren balık için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: 70 erkek turkuaz killifish için temsilcisi sağkalım eğrisi. (A) turkuaz killifish laboratuvar kaldırdı için tipik bir hayatta kalma eğrisi. Hayatta kalma eğrileri karşılaştırılması (B) elde edilen balık en uygun yetiştirme koşullarında (siyah) kaldırdı ve zavallı yetiştiriciliği (kırmızı ve mavi). Kesikli kırmızı yatay çizgi % 50 hayatta kalma, ortalama yaşam süresi (x ekseni üzerinde belirtilir), kesişen yaşam eğrisi gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

KİMLİĞİ	İleri astar		Ters astar		Boyut aralığı (bp)
* NfuSU0007	GGCTAAGCCTTGCTGACAGA		CAGGGAGCTGAAAACCTCAG		166 - 214
* NfuSU0010	CGCAGTCTGATCAAATCGTGT		TGTTTGAAGGTTCACATTCATTATC		220 - 272
NfuSU0016	CATGGCTAAACCGTGATGAA		GAAGGACGCCAGCTATGAAG		209 - 240
NfuSU0022	AACACAGCTCTCGTAAGGAGGTA		TTCAGACTTGTCTTACTACCATGTTT		198 - 238
NfuSU0027	TCCAGCTGAATCGGTAATGA		AAACTCGAGGGTGCAATCTG		164 - 226
NfuSU0049	CTGGACAAAGTGCCAATCAC		CTCCCACAGTCCCAAAACAT		196 - 197
NfuSU0050	CCAGAATGAACAATACTCAGATCAA		GCAGCTTAGTTTAATGATATCACAATG		252 - 295
NfuSU0060	CTAGCCACTCCCCTGGTTTA		CCGTCACGATGTGCTGATAC		216 - 248
NfuFLI0030	CAGAAGCTAAAGGCCAGACG		GGGAAACAATAGGGAACCAC		174 - 205
* NfuFLI0091	ACGCTGACTCTACCCAGTC		CTGCCTGCTACTGACAATG		355 - 373
* - belirlenmesi işaretleri seks

Tablo 1: Genotipleme astar zorlanma tanımlama için.

Tartışma

Biz laboratuvar embriyo koleksiyonu, kuluçka gibi yetişkin balık konut, dahil olmak üzere turkuaz killifish kültür için bir protokol tarif doğurmak ve besleme. Bizim iletişim kuralı özellikle yetişkin balık, özellikle deneysel araştırmalar yaşlanma ve yaşam süresi üzerinde duruldu araştırma laboratuvarları hedeflenmektedir. Turkuaz killifish bir çift Zebra balığı tesisi yükseltilebilir; Ancak, standart Zebra balığı bakımı¹⁶' dan killifish yetiştiriciliği önemli yönleri farklı. Bu ayarlamalar erken bir tuzlu su-karides sadece diyet bir diyet protein açısından zengin kan solucan gibi kuru ve sıvı kuluçka aşaması oluşan embriyo kuluçka belirli adımları ile takıma geçiş içerir.

İletişim kuralına kritik adımlar 8-30 ° C sıcaklık aralığında sevkiyat embriyo içerir. Yetiştirme durumunda, sıklık ve gıda kalitesi besleme verimlilik bağlıdır; Bu nedenle, embriyo verim (bakınız Bölüm 5.6) artırmak için tank doğurmak başına günde en az iki besleme önerilir. Embriyo beyazlatma sırasında embriyo kuluçka beyazlatma çözüm genişletmeniz değil. Bu yumurta koryon ve artan embriyo ölümleri hasara neden olabilir. Metilen mavisi ile embriyo kuluçka zaman kuluçka hazır kapak embriyo canlılığı önemli ölçüde azaltılmış olacak gibi 2 hafta daha uzun süre uzatmak değil. Turkuaz killifish kuluçkalık için Hümik asit solüsyonu düşük sıcaklık tarama artırır ve embriyoların çözüm Komple daldırma eşitlenmiş tarama sağlar. Fry gaz mesane doldurmak mümkün değil yüksek oranda kuluçka sonuçlarında sırasında yetersiz havalandırma ("göbek-kaymak" fenotip, bkz: Notlar bölümünde 5.1).

Sınırlama-in doğurmak için protokol hangi pozlar sorunlar için filtrasyon sistemleri Merkezi ve alternatif yöntemlerle gelecekte değiştirilmesi gerektiğini kum substrate kullanımını içerir. Olası alternatifler tankları damızlık Zebra balığı kullanımı olabilir. Embriyo ağartma büyük fiziksel-kimyasal değişiklikler değiştirilmiş koryon fizyolojisi ve başarı kuluçkalık neden olabilir yumurta koryon neden olabilir. Embriyo sürekli maruz kalma Metilen mavisi yetişkin balık fizyolojisi uzun vadeli değişiklikler neden olabilir. Hayatta kalma kohort çalışmaları için bireysel tankları yetişkin balık yetiştirme balık davranış ve sağlık olumsuz yönde etkileyebilir. Ancak, grup konut hayatta kalma kohort çalışmaları için sıkı sosyal hiyerarşileri için önde gelen sosyal hakimiyet ve erkek bölgede kurulması nedeniyle önemli karıştırıcı faktörlerin ekler. Bu nedenle, yalıtım sağkalım Etütleri erkek balık makul bir uzlaşma olduğuna karar. Beslenme laboratuvar killifish kolonileri un kontrollü kaynaklardan gelen canlı gıda ile dış contaminations için bir risk parazitler ve potansiyel patojenik mikrobiyal topluluklar ekleyin. Gelecekte, bir geçici steril balık besleme geliştirilmelidir.

Bu iletişim kuralı için gelecekteki iyileştirmeler hala 3-4 hafta içinde cinsel olgunlaşma tamamlamak için yol bir kontrollü, Sigara-live diyet ele alınacak. Özet olarak, bizim iletişim kuralı turkuaz killifish laboratuvar için geniş bilimsel bir topluluk kültür erişilebilirlik sunmaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Prob kalibrasyon tampon çözeltisi pH=7.0	Roth	A518.1	1L tampon çözeltisi pH=7.0 su sistemini kalibre etmek için pH-elektrot
Prob kalibrasyon tampon çözeltisi pH=4.0	Roth	P712.1	1L tampon çözeltisi pH=4.0 su sistemini kalibre etmek için pH-elektrot
İletkenlik standardı	VWR	83607.260	500 mL İletkenlik standardı 1,413 uS/cm su sistemini kalibre etmek için iletkenlik elektrodu
Kolay Şeritler Testi 6'sı 1	arada JBL	2533900	Sistem suyunun klor değerlerinin belirlenmesi için test şeritleri
Amonyak Testi	JBL	2536500	Sistem suyunun amonyak içeriğini belirlemek için test
Kızıldeniz Tuzu	Kızıldeniz		22 kg kova
Sodyum hidrojen karbonat	VWR	27780.360
Hümik asit	Sigma- Aldrich	53680-50G
Yeni HUFA Artemia zenginleştirme	ZM Sistemleri İngiltere		75g şişe
Metilen mavisi	Roth	AE64.1
Hidrojen peroksit çözeltisi	Sigma- Aldrich	31642-1L	%30 (a/a)
Hindistan cevizi lifi	Dragon	ZCS010
Whatman kağıdı	GE sağlık	3030-690
Etanol saf	VWR	20821.467	%100
Silis kumu	yerel evcil hayvan dükkanı
Artemia Eggs Premium Grade	Sanders
Bloodworm	yerel distribütörü		Poseidon Aquakultur Almanya
dNTP'lerin çözelti karışımı	Biolabs	N04472	10mM
Taq DNA polimeraz	Invitrogen	18038-042	5U/uL
PCR 10x Tampon	İnvitrogen	18038-042
MgCl2	Invitrogen	18038-042	50mM
NaOH	Sigma- Aldrich	S8045-500g	50mM
Tris-HCl, pH = 8.0 çözelti	Sigma- Aldrich	T2694-1L	1M
HCl 37%	Sigma- Aldrich	H1758-500mL
Balık tankları	Aquaneering		hacmi: 0.8L, 2.8L, 9.5L; bölmeler, kızartma ağları ve kapaklarla donatılmış
Orbital çalkalayıcı	VWR	89032-100	model 5000
Mikrobiyolojik inkübatör	Thermo Scientific, Heratherm	50125882	model IMC18; sıvı fazdaki depolama embriyoları için, t = 27-28 & derece olarak ayarlayın; C
Soğutma İnkübatörü	Bağlayıcı	9020-0209	model KT115; katı fazdaki embriyoların depolanması için, t = 27-28 & derece olarak ayarlayın; C
Kuluçka kuluçka makinesi	Thermo Scientific, Heratherm	51028114	model OGS180; kuluçkalık embriyolar için, t = 27-28 & derece olarak ayarlayın; C
Stereomikroskop	Leica		model M80
Üreme kumu/kuluçka kutuları	Roth	1598.1	1000mL
Petri kabı	Sarstedt	82.1473	92x16mm
50 mL Konik tüp	Sarstedt	62.547.254
15 mL Konik tüp	Sarstedt	62.554.002
Tek Kullanımlık Plastik Pasteur pipeti	Roth	EA71.1	2 mL; Kan kurtları ile beslenen balıklar veya embriyo seçimi için 3-4mm çapında açmak için ucunu kesin
Serolojik pipet	Sarstedt	86.1689.001	50mL
Şırınga	Henke Sass Wolf	4100-000V0	10mL
Metal süzgeç			inceliği < 1 mm; embriyo toplama için
Cımbız	Dumont	0508-5/45-PO	tip5/45; embriyo transferi için
25 L Salamura karides kuluçka makinesi	Aquaneering	ZHBS25	ana kuluçka makinesi
500 mL Salamura karides kuluçka makinesi	JBL	6106100	model Artemio 1; yedek kuluçka
Dar gözenekli balık ağları	JBL
Kum kabı	VWR	BURK7102-5000	5000mL
Salamura karides ayırma kabı	VWR	BURK7102-2000	2000mL
Plastik fermuarlı çanta	Roth	P279.2	ölü balık saklama için
Pipetboy	Integra	155000	model Pipetboy acu2
Parafilm	P-Lab	P701605
		AQ380	4-6 mm çap
1 L Cam şişe	VWR	215-1595
2 L Cam şişe	VWR	215-1596
500 mL Salamura		ile balık beslemek için	K665.1
; m salamura karides süzgeci	Florida Aqua Farms	BB-PC2	salamura karides/kan kurdu toplama için
Finish filtre çorapları	Aquaneering	MFVB025C	25-μ m
Merkezi filtrasyon balık barınma sistemi			Aquaneering, Techniplast, Aquatic Habitats, Aqua Schwarz