Bu yöntem, patojen işgali üç boyutlu (3D) modelleri ile böcek hücreye görselleştirmek gösterilmiştir. Hemocytes Drosophila larvaları üzerinden viral veya bakteriyel patojenler, ex vivo veya vivo içindeile bulaşmış. Virüslü hemocytes daha sonra sabit ve görüntüleme için bir confocal mikroskop ve sonraki 3D hücresel yeniden yapılanma ile lekeli.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva
Bu makalede
Özet
Özet
Drosophila melanogaster, patojenik enfeksiyon sırasında hemocytes enfeksiyon boyunca bağışıklık yanıtındaki önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, bu iletişim kuralının amacı belirli bir bağışıklık yerde uçar, yani hemocytes patojen işgali görselleştirmek için bir yöntem geliştirmektir. Burada 3 × 10 anlatılan yöntemle6 canlı hemocytes 200 Drosophila 3rd INSTAR larva ex vivo enfeksiyon için 30 dk içinde elde edilebilir. Alternatif olarak, hemocytes enfekte vivo içinde 3rd INSTAR larva için 24 saat sonrası enfeksiyon hemocyte çıkarma tarafından takip enjeksiyon yoluyla olabilir. Bu virüslü primer hücre tespit edildi, lekeli ve confocal mikroskobu kullanarak yansıma. Sonra 3D temsilcilikleri patojen işgal kesin olarak göstermek için görüntülerden üretildi. Ayrıca, yüksek kaliteli RNA qRT-PCR patojen mRNA şu tespiti için elde edilebilir enfeksiyon ve yeterli protein hulâsa Western blot analizi için bu hücrelerden. Birlikte ele alındığında, biz patojen işgalinin kesin uzlaşma ve enfeksiyon bakteriyel ve viral patojen türleri ve verimli bir yöntem hemocyte çıkarılması için yeterli canlı hemocytes Drosophila elde etmek için kullanarak onay için bir yöntem mevcut larva ex vivo ve in vivo enfeksiyon deneyler için.
Giriş
Drosophila melanogaster doğuştan gelen bağışıklık1incelenmesi için bir iyi kurulmuş model organizmadır. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı sırasında hemocytes yanıt patojeni meydan okuma olarak önemli bir rol oynamaktadır. Hemocytes mantar, viral ve bakteriyel enfeksiyon2,3sırasında fagositik eylem yoluyla patojen mücadelede önemli bir işleve sahip yanı sıra parazit Kapsüllenen için kritik öneme sahiptir.
En iyi ana bilgisayarın doğuştan gelen bağışıklık yanıtı patojenik mikrobiyal enfeksiyon anlamak için nasıl patojen konak hücreleri enfeksiyon sırası....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. ex vivo enfeksiyon
- Orta ve donanımları
- Steril koşullarda, taze Drosophila Hemocyte izole Orta (% 75 Schneider'ın Drosophila içeren DHIM) hazırlamak orta % 25 ile Fetal sığır Serum (FBS) ve filtre bu sterilize.
- 2-3 adet 10 cm x 10 cm parafin film bir stereomicroscope altında katman.
- Cam kılcal hazırlayın. Kapiller çektirme ısıtıcı maksimum % 55'i için ayarlayın. Kılcal tüp yaklaşık 10 µm keskin bir noktaya kadar çekin.
- Mineral yağ ile kılcal tamamlanmıyor.
- Dolu kılcal tüp nanoinjector (Şekil 1A) üzerine monte ve erimiş kılcal tüp İp....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Hemocytes ex vivo enfeksiyonu, 3 × 10 toplamak yaşamak için6 hemocytes 200 Drosophila 3rd INSTAR larvaları elde. Bizim yöntem geliştirmek için bir takım farklı teknikler denendi. Bireysel larva diseksiyon en fazla 1,5 saat sürer ve ortalama ~ 8000 hücre elde edilen en çok hangi koleksiyonun sonuna tarafından canlı değildi bu yöntemi18, kullanarak. Daha sonra hemocytes bulunan hemolymph çıkarmak için çalıştı, bir cam kılcal tü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Nasıl konak hücreleri enfekte olma daha iyi anlamak için özellikle daha önce denenmemiş patojen ve hücre tipi kombinasyonları4' te deneme zaman patojen hücrelerdeki lokalizasyonu netleştirmek önemlidir. Enfeksiyonu takip hücresel yanıt basamaklı eğitim üretken patojen işgali gösterebilir iken, görüntüleme ve hücresel yanıt verilerini kombinasyonu patojen işgali ve enfeksiyon göstermek için önemlidir. Patojen işgalinin 2D görüntüleri ana hücreleri gösteren raporlar üretken enfeksiyon göstermek eğil.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Teşekkürler
MCherry ifade Coxiella burnetiistokları sağlamak için Dr Robert Heinzen için minnettarız. Biz Dr Luis Teixeira omurgasız yanardöner virüs 6 ve Bloomington stok merkezi sinek stokları sağlamak için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu projenin kısmen NIH hibe R00 AI106963 (A.G.G.) ve Washington State Üniversitesi tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Schneider's Drosophila Orta | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Sığır Serumu | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filtre (0.22 & mikro; L) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Süzgeç (100 & mikro; m) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo mikroskop | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Cam kılcal | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Kılcal çektirme | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral yağ | Snow River Ürünleri | 1.1.4) | |
| Nanoenjektör | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forseps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 dağıtım aparatı | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Tripan Mavisi | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemositometre | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 kuyulu plaka | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii - mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila meyve suyu tabakları | Cold Spring Harbor Protokolleri | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Metil paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Mutlak etanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch'in %100 Üzüm suyu dondurulmuş konsantresi, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri kapları, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Mikroskop kapak camı | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Maya, Fırıncılar Kurutulmuş Aktif | MP Biyomedikal | 0210140001 | 2.1) 2 parça su ekleyin. 1 kısım maya (v / v) |
| Tungsten iğnesi | Güzel Bilim Araçları | 10130-20 | 2.1) |
| Tutma forseps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehit | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Sığır Serumu Albümin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade montaj ortamı | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Konfokal mikrosope | Leica | TCS SP8-X Beyaz Işık Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu | 3.2) |
| 3D görselleştirme modülü | ile 3D görüntüleme rekonstrüksiyon yazılımı Leica LASX3.3) | ||
| Mikroskop slaytları | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Omurgasız yanardöner virüs 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | suşu: 10403S | 4) Listeria monocytogenes suşu 10403S (Bishop ve Hinrichs, 1987), 50 & mikro içeren Difco Beyin-kalp infüzyonu (BHI) suyunda (BD Biosciences) yetiştirildi; 30 ° C'de g / ml streptomisin. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 18068015 | gDNA bozunması |
| cDNA Sentez Kiti | Bio-Rad | 1708891 | cDNA sentezi |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT, TGT, TTT, CAG, AAC, CCC, ATT -3'IIV6_193R_R | |
| IDT | , qRT-PCR, 5'- CAC, GAA, GAA, TGA, CCA, CAA, GG, -3'RpII_qRTPCR_fwd | ||
| SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | ||
| SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | ||
| SYBR Yeşil qRT-PCR reaktifi | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Gerçek Zamanlı PCR Sistemi | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Yazılım v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antikoru | abcam | ab35132 | Western blot |
| Tavşanda üretilen Anti-Aktin antikoru | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Tavşan IgG (H + L), HRP Konjugatı | Promega | W4011 | Western blot |
Kaynaklar
- Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
- Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
